紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造過程揮發(fā)性風(fēng)味組分及微生物菌群多樣性分析

洪家麗，李秋藝，潘雨陽，郭偉靈，黃梓芮，趙立娜，錢 敏，白衛(wèi)東，倪 莉，饒平凡，劉 斌，呂旭聰,,*

（1.福建農(nóng)林大學(xué) 國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；2.福州外語外貿(mào)學(xué)院，福建 福州 350202；3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；4.福州大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)研究所，福建 福州 350108）

紅曲黃酒是以糯米為主要原料，添加紅曲和藥白曲作為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)多種微生物釀造而成的一種低度黃酒，以色紅、味醇、香濃而著稱，不僅具有豐富營養(yǎng)成分，還因添加了紅曲進(jìn)行發(fā)酵而具備多種與眾不同的生理功效，是中國黃酒中十分有特色的一類黃酒[1-4]。作為感官特征中最重要的指標(biāo)，香氣特征是紅曲黃酒品質(zhì)的重要組成部分，很大程度上決定了紅曲黃酒的檔次以及企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。紅曲黃酒獨(dú)特香氣組分的形成與其傳統(tǒng)釀造過程中微生物發(fā)揮的功能密切相關(guān)[5-7]。到目前為止，對于紅曲黃酒香氣組分在紅曲黃酒實(shí)際釀造過程中主要由哪些微生物代謝產(chǎn)生尚不清楚。為實(shí)現(xiàn)紅曲黃酒香氣特征的定向調(diào)控，提升我國紅曲黃酒的風(fēng)味品質(zhì)，很有必要深入探究傳統(tǒng)釀造過程中特征香氣組分形成與微生物菌群之間的關(guān)系，確定與特征香氣組分形成密切相關(guān)的微生物類型，為闡明功能微生物對特征香氣組分生成的調(diào)控機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

高通量測序（high throughput sequencing，HTS）是一種全新的測序技術(shù)，能一次進(jìn)行多個(gè)樣品測定，還能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定，給研究提供了方便。通量高、快速、低成本等優(yōu)點(diǎn)，使得該方法一經(jīng)出現(xiàn)就被廣泛應(yīng)用于各種生態(tài)系統(tǒng)中，比如土壤、草魚腸道、海洋沉積物等生態(tài)環(huán)境中微生物多樣性的檢測和研究中[8-12]。近年來，HTS也逐漸應(yīng)用到傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的多樣性研究，如白酒、醋、泡菜、黃酒等傳統(tǒng)發(fā)酵食品[13-16]，而紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造過程中微生物菌群的HTS研究至今鮮見報(bào)道。因此，本研究一方面運(yùn)用頂空固相微萃?。╤ead space solid phase microextraction，HS-SPME）與氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用相結(jié)合的方法分析紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造過程不同時(shí)期的揮發(fā)性風(fēng)味組分，借助主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）模型系統(tǒng)地比較釀造初期、中期和末期3 個(gè)時(shí)期的揮發(fā)性風(fēng)味成分；另一方面采用HTS技術(shù)分析紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造過程的微生物菌群結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化；最后，基于Spearman相關(guān)性分析優(yōu)勢菌群-揮發(fā)性風(fēng)味組分之間的相關(guān)性，旨在闡明傳統(tǒng)釀造過程中香氣組分形成與微生物菌群之間的關(guān)系，為提升紅曲黃酒風(fēng)味品質(zhì)和改良紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造工藝提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烏衣紅曲、藥白曲產(chǎn)自福建省南平市建陽市；2-辛醇（內(nèi)標(biāo)，色譜純） 美國Sigma公司；NaCl（分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)色譜純或分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A/5975MSD GC-MS聯(lián)用儀、DB-5MS彈性石英毛細(xì)管管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司；SPME裝置、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭美國Supelco公司；15 mL頂空鉗口樣品瓶 上海安譜公司；電子分析天平 梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；MiSeq HTS平臺 美國Illumina公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；DF-1型號集熱式磁力攪拌器 金壇市鑫渃實(shí)驗(yàn)儀器廠；QYSW-10B純水機(jī) 重慶前沿水處理設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造工藝

本研究在釀造工藝實(shí)驗(yàn)室按照紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造工藝分別在10 L的陶瓷酒壇中進(jìn)行傳統(tǒng)釀造。具體工藝參數(shù)為：以蒸熟冷卻后的糯米（4.0 kg）為原料，落缸前把水（6 L）與烏衣紅曲（400 g）、藥白曲（40 g）先落缸浸泡數(shù)小時(shí)，之后將冷卻后的糯米落壇并與曲和水翻拌均勻后蓋蓋，在28 ℃糖化發(fā)酵3 d，之后在15 ℃發(fā)酵，在發(fā)酵的第10天將壇口進(jìn)行密封處理進(jìn)行厭氧發(fā)酵。分別在發(fā)酵第1天（初期）、第10天（中期）、第30天（末期），從酒壇的上、中、下3 個(gè)位置分別取酒醅樣，然后進(jìn)行等量混勻，用于香氣組分分析及微生物菌群結(jié)構(gòu)分析，樣品凍存于－80 ℃冰箱備用。

1.3.2 揮發(fā)性組分SPME處理

萃取頭的預(yù)處理：將新購置的萃取頭在GC儀進(jìn)樣口250 ℃老化1 h。

樣品HS-SPME：取6 mL稀釋10 倍后的酒醅樣，加入到15 mL的頂空瓶中，加2.0 g NaCl和5 μL內(nèi)標(biāo)（2-辛醇，質(zhì)量濃度10 mg/L），使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭在50 ℃預(yù)熱10 min，然后磁力攪拌萃取吸附30 min，用于GC-MS分析。

1.3.3 GC-MS分析

將萃取頭從頂空瓶中取出，迅速插入GC儀進(jìn)樣口在250 ℃解吸5 min，進(jìn)行GC-MS檢測分析。

GC條件：DB-Wax色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣（純度＞99.999%），不分流，體積流量1 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；程序升溫：起始溫度40 ℃，保持 5 min，以5 ℃/min的速率升溫至120 ℃，然后以10 ℃/min升溫至240 ℃，保持5 min。后運(yùn)行溫度240 ℃，后運(yùn)行時(shí)間5 min。

MS條件：接口溫度280 ℃；連接桿溫度150 ℃；電子電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z 35～450；ACQ方式Scan。

1.3.4 HTS分析不同時(shí)期黃酒的菌群結(jié)構(gòu)

1.3.4.1 不同釀造時(shí)期菌群總DNA提取

稱取釀造初期、中期及末期的酒醅樣各1 g，采用玻璃珠破碎法對樣品進(jìn)行破碎處理，利用Omega公司試劑盒Mag-Bind Soil DNA Kit (50) M5635-01提取菌體DNA。

1.3.4.2 目的區(qū)段擴(kuò)增及HTS

Illumina MiSeq HTS用引物Pro340F（5’-CCTACGGGNBGCASCAG-3’）和Pro805R（5’-GACTACNVGGGTATCTAATCC-3’）對細(xì)菌DNA的V3-V4高變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。使用引物序列為（5’-GTGAAT CATCGARTC-3’）的正向引物和序列為（5’-TCCTCCGCTTATTGAT-3’）的反向引物對真菌ITS2區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃變性5 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物通過DNA凝膠回收試劑盒對進(jìn)行回收純化，然后進(jìn)行文庫的構(gòu)建，不同文庫采用不同的barcode加以區(qū)分；最后在Illumina MiSeq平臺進(jìn)行HTS。

1.4 數(shù)據(jù)分析

定性和定量分析：由GC-MS得到的色譜圖，經(jīng)計(jì)算機(jī)在標(biāo)準(zhǔn)譜庫NIST11和Wiley中比對檢索，確定揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)成分，準(zhǔn)確地鑒定出不同釀造時(shí)期黃酒的揮發(fā)性成分，采用2-辛醇（10 mg/L）為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行進(jìn)行半定量分析，得到各組分的質(zhì)量濃度。利用R語言繪制熱圖，可直觀觀察到紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造不同階段的揮發(fā)性風(fēng)味組分含量的差異。將處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)一步通過SIMCA 14.1軟件進(jìn)行多變量分析處理。進(jìn)行PCA揭示紅曲黃酒不同釀造階段樣品間揮發(fā)性組分的差異。通過OPLS-DA模型快速準(zhǔn)確地篩選出不同釀造時(shí)期的差異揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，探究不同釀造時(shí)期對紅曲黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)形成的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)釀造過程不同時(shí)期揮發(fā)性風(fēng)味組分分析

本研究采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭對紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造初期、中期和末期3 個(gè)時(shí)期酒醅樣中的揮發(fā)性風(fēng)味組分進(jìn)行SPME-GC-MS分析，其總離子流色譜圖見圖1?？梢钥闯?，釀造初期和中期的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)譜圖比較相似，而釀造末期揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類復(fù)雜多樣，大多數(shù)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量較中期有所提高。

圖1 不同釀造時(shí)期揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分的總離子流色譜圖Fig. 1 GC-MS total ion chromatograms of volatile components in fermented grains collected at different brewing stages

圖2 不同釀造時(shí)期揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的熱圖分析Fig. 2 Heatmap of volatile components in fermented grains samples collected at different brewing stages

通過數(shù)據(jù)庫比對，鑒定釀造初期、中期和末期3 種時(shí)期酒樣中的揮發(fā)性物質(zhì)共76 種，并用R語言繪制成熱圖，直觀地表現(xiàn)出3 個(gè)時(shí)期的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的差異，圖中每種成分含量用不同的顏色表示，其中紅色越深代表其含量越多，而藍(lán)色越深代表其含量越少。由圖2可知，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在釀造初期有49 種，中期有51 種，末期有48 種。其中，初、中、末3 個(gè)釀造時(shí)期共有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為29 種，包括：異戊醇（F7）、2-苯乙醇（F68）、3,5-二叔丁基苯酚（F66）等；初、中期共有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有10 種；中、末期共有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有4 種；而初、末期則無共有揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。此外，共有的49 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中的順式-2-辛烯-1-醇（F24）、2-甲基戊酸（F64）、辛醛（F59）、苯甲醛（F34）、正十六烷酸（F56）、(2Z)-2-庚烯醛（F21）、反式-2-辛烯醇（F23）、5,7-二氧辛酸（F26）、α-松油醇（F2）和2-丙基-1,3-戊二醇二丙酸酯（F63）是傳統(tǒng)釀造初期酒醪樣特有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)；3-羥基-2-丁酮（F32）、2-庚酮（F20）、2,6-二甲基-2,6-十一碳二烯-10-酮（F27）、2-乙基己酸（F52）、反式-10-十八碳烯酸甲酯（F6）、新癸酸（F55）、3-辛醇（F25）和4-乙基-2-甲氧基苯酚（F67）是傳統(tǒng)釀造中期酒醪樣特有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)；丁酸乙酯（F40）、辛酸乙酯（F61）、鄰苯二甲酸二異丁酯（F3）、O-乙酰基對甲酚（F45）、癸酸乙酯（F42）、棕櫚酸乙酯（F49）、油酸乙酯（F46）、三縮四乙二醇（F73）、2-酮丁酸（F39）、庚酸乙酯（F48）、戊酸乙酯（F65）、3-羥基十三烷酸乙酯（F75）、乙基癸二酸乙酯（F71）、椰子醛（F18）、乙基3-甲基丁基琥珀酸酯（F38）是傳統(tǒng)釀造末期特有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。從揮發(fā)性風(fēng)味組分熱圖的層次聚類分析可以看出，釀造中期與初期在揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成上較相似，末期與初期、中期的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)差異較大。牟穰等[17]在其研究中也曾有過相似的結(jié)論：在黃酒釀造的初、中期，酒醪樣中含有較多的營養(yǎng)物質(zhì)可供微生物生長繁殖，微生物種類差異較少，因此共有揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)較多。

2.2 傳統(tǒng)釀造過程不同時(shí)期酒醪樣中的差異揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析

圖3 基于PCA模型解析不同時(shí)期酒醪樣揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Fig. 3 PCA Analysis of volatile flavor components of fermented grains samples collected at different brewing stages

為探究紅曲黃酒不同釀造時(shí)期樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的聚類趨勢，將不同時(shí)期酒樣進(jìn)行PCA。如圖3所示，釀造初期、中期和末期酒醪樣分別位于不同的象限中，說明3 個(gè)不同時(shí)期酒醪樣之間揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)均存在較大差異。

OPLS-DA模型通過將X軸矩陣信息分解成與Y相關(guān)和不相關(guān)的兩類信息，能夠過濾掉與分組不相關(guān)的變量，結(jié)合差異性變量的重要性投影值（variable importance in the projection，VIP），從而使獲得的差異性代謝物更加可靠。在OPLS-DA模型中，兩組之間的分類可以將分散點(diǎn)圖和S型載荷圖的形式可視化。如圖4所示，兩組樣本區(qū)分顯著，分別位于得分圖的兩側(cè)，并都處于95%置信區(qū)間內(nèi)。

圖4 基于OPLS-DA的分?jǐn)?shù)散點(diǎn)圖Fig. 4 Score scatter plot obtained from OPLS-DA

S型載荷圖通過組合OPLS-DA的預(yù)測模型組件的協(xié)方差分布和權(quán)重的相關(guān)性改善分類變量的可視化，與原點(diǎn)相距越遠(yuǎn)，相關(guān)值越高且協(xié)方差越大，說明這些變量差異較顯著。如圖5所示，靠近中軸線上的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為兩個(gè)不同時(shí)期酒醪樣中差異較小的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，而遠(yuǎn)離原點(diǎn)的為兩種酒醪樣中差異較大的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

圖5 基于OPLS-DA模型分析的S型載荷圖Fig. 5 S-shaped loading plot obtained from OPLS-DA

由圖5A可知，初期與中期酒醪樣間的差異揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為異戊醇（F7）、1-己醇（F11）、丙酸（F70）、異丁醇（F17）、乙酸乙酯（F1）、柏木醇（F41）、2,5-二叔丁基對苯二酚（F5）、己醛（F50）等19 種物質(zhì)，且圖6A顯示這19 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的VIP值均大于1，說明這些揮發(fā)性組分在初期酒醪樣和中期酒醪樣中的含量存在顯著性差異。由圖5B、C可知，末期酒醪樣與初期酒醪樣和末期酒醪樣與中期酒醪樣間共有的差異揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為異戊醇（F7）、2-苯乙醇（F68）、己酸乙酯（F53）、丁二酸二乙酯（F37）、乙酸異戊酯（F8）、辛酸（F60）、丁酸乙酯（F40）、正癸酸（F54）、辛酸乙酯（F61）和乙酸乙酯（F1）。此外，異丁醇（F17）和丙酸（F70）是末期酒醪樣與初期酒醪樣間特有的差異揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，而1-己醇（F11）、柏木醇（F41）、乙酸苯乙酯（F31）和O-乙酰基對甲酚（F45）則是末期酒醪樣與中期酒醪樣間特有的差異揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。且這幾種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的VIP值均大于1（圖6B、C），說明這些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量存在顯著性差異。

精準(zhǔn)生態(tài)畫像。在全面采集數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，按照指標(biāo)評價(jià)規(guī)則，既可以對全市政治生態(tài)建設(shè)進(jìn)行整體畫像，也可以對單位和個(gè)人進(jìn)行局部畫像；既可以對日常工作進(jìn)行常規(guī)畫像，也可以對重點(diǎn)工作進(jìn)行專題畫像。系統(tǒng)根據(jù)評價(jià)分析結(jié)果，可以自動生成單位政治生態(tài)檔案和個(gè)人勤廉檔案。

圖6 基于OPLS-DA模型分析的VIP預(yù)測值分布圖Fig. 6 Distribution of VIP forecast values based on OPLS-DA

2.3 傳統(tǒng)釀造過程微生物菌群多樣性分析

2.3.1 細(xì)菌多樣性分析

在細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析（表1）中，初期酒醪樣中的優(yōu)勢細(xì)菌包括解淀粉芽孢桿菌（17.42%）、人參土芽孢桿菌（16.79%）、葡萄球菌屬（11.43%）、芽孢桿菌屬（10.87%）、枯草芽孢桿菌（8.40%）；中期酒醪樣中的優(yōu)勢細(xì)菌有卷曲乳桿菌（17.92%）、明串珠菌屬（17.51%）、嗜酸乳桿菌（12.30%）、拉烏爾菌屬（9.57%）、芽孢桿菌屬（8.17%）；末期酒醪樣中的優(yōu)勢細(xì)菌包括卷曲乳桿菌（20.30%）、嗜酸乳桿菌（18.19%）、明串珠菌屬（16.52%）、消化乳桿菌（13.91%）和檸檬明串珠菌（12.33%）。芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬細(xì)菌的數(shù)量在釀造初期最多，隨著釀造時(shí)間的推移逐步減少，而乳酸菌取而代之成為釀造體系中優(yōu)勢的細(xì)菌菌群。這是因?yàn)檠挎邨U菌和葡萄球菌屬于需氧菌，在釀造初期好氧條件下生長良好，產(chǎn)生多種酶類，促進(jìn)淀粉糖化，從而使乳桿菌屬細(xì)菌在發(fā)酵中、末期能夠大量生長繁殖[18-19]，釀造中、末期的缺氧條件和高乙醇含量則會抑制芽孢桿菌和葡萄球菌的生長。乳桿菌多為兼性厭氧菌，具有較強(qiáng)的耐酸和耐乙醇的能力，更適合在釀造中、末期的低氧環(huán)境下生長代謝[20]。張中華[21]也曾發(fā)現(xiàn)相似的研究結(jié)果：在紹興黃酒釀造初期細(xì)菌主要以葡萄球菌和芽孢桿菌為主，但發(fā)酵中、末期其含量逐漸減少，乳酸桿菌成為優(yōu)勢菌。

表1 紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造過程不同階段細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析Table 1 Percentage contents of bacterial sequences in fermented grains samples collected at different brewing stages

2.3.2 真菌多樣性分析

在傳統(tǒng)釀造過程中，真菌菌群結(jié)構(gòu)不斷變化，從表2可以看出，真菌種類多樣，隨著釀造時(shí)間的推移，真菌種類數(shù)量逐漸減少，優(yōu)勢真菌逐漸突出。在釀造的初期，真菌主要以黑曲霉（46.06%）、少根根霉原變種（12.23%）、紫色紅曲霉（8.68%）、米根霉（7.86%）和米曲霉（5.71%）為主；到發(fā)酵中期，優(yōu)勢真菌結(jié)構(gòu)相較于發(fā)酵初期有明顯變化，釀酒酵母（55.90%）逐漸成為釀造體系中的優(yōu)勢菌，黑曲霉（17.18%）相對豐度顯著降低；發(fā)酵末期釀酒酵母（69.46%）成為釀造體系中的優(yōu)勢菌。米曲霉、黑曲霉、紫色紅曲霉等糖化菌與酵母菌的含量變化成相反趨勢，原因可能是在投料時(shí)加入了黑曲霉，導(dǎo)致該屬成為發(fā)初期酒醪樣中的最主要優(yōu)勢真菌，而在發(fā)酵末期，酒醪樣中氧氣含量顯著降低從而生長被抑制[22]。反之，在發(fā)酵初期，溫度、氧氣含量較高，酵母菌能夠以較高的速度進(jìn)行繁殖，成為中、末期酒樣主要的優(yōu)勢真菌菌群[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，在傳統(tǒng)釀造的初期檢測到的霉菌數(shù)量較多，而在傳統(tǒng)釀造的中、末期檢測到的霉菌數(shù)量較少，主要原因在于乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸和乙酸，酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生大量的乙醇，都會抑制霉菌的生長代謝。本研究在釀造的中、末期還是能夠檢測到少量霉菌的存在，可能是基于DNA為模板的HTS技術(shù)在檢測過程中無法有效區(qū)分所分析的DNA分子是否來源于活性微生物，無法區(qū)分死菌與活菌[24]。

表2 紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造過程不同階段真菌菌群結(jié)構(gòu)分析Table 2 Percentage contents of fungal sequences in samples collected from of different periods of traditional brewing process

2.4 傳統(tǒng)釀造過程優(yōu)勢菌群-揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)性分析

2.4.1 優(yōu)勢細(xì)菌菌群-揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性分析

由圖7可知，葡糖酸醋酸桿菌屬、嗜酸乳桿菌、消化乳桿菌、卷曲乳桿菌、乳球菌屬、檸檬明串珠菌和假單胞菌屬與釀造過程中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)大多呈正相關(guān)；解淀粉芽孢桿菌、人參土芽孢桿菌、單純芽孢桿菌、芽孢桿菌屬、枯草芽孢桿菌、短芽孢桿菌屬等在發(fā)酵過程中與大多數(shù)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)呈負(fù)相關(guān)，但與5,7-二氧辛酸（F26）、苯甲醛（F34）、己醛（F50）和丙酸（F70）等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)呈正相關(guān)。

圖7 傳統(tǒng)釀造過程優(yōu)勢細(xì)菌菌群與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性分析矩陣圖Fig. 7 Correlation analysis between dominant bacterial flora and volatile flavor components during the brewing process

高亦豹等[25]與吳衍庸[26]分別采用PCR-變性梯度凝膠電泳法和富集培養(yǎng)法在白酒大曲和高溫曲中檢測到大量嗜異戊醇的假單胞菌，本研究優(yōu)勢細(xì)菌菌群-揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性分析也發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬與某些高級醇類具有顯著正相關(guān)，推測該屬的細(xì)菌可能具有產(chǎn)高級醇的能力。此外，假單胞菌屬大多具有分解脂肪及蛋白質(zhì)的能力，由此可能產(chǎn)生某些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的前體，從而賦予黃酒獨(dú)特的香氣特征[27]。揮發(fā)性物質(zhì)與細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)關(guān)系復(fù)雜，某一種揮發(fā)性成分可能與多種細(xì)菌菌群均存在一定的相關(guān)性，很有可能是多種微生物協(xié)同作用的結(jié)果，如乙酸乙酯（F1）、異戊醇（F7）與葡糖酸醋酸桿菌屬、嗜酸乳桿菌、消化乳桿菌、乳球菌屬等均存在一定相關(guān)性。

圖8 傳統(tǒng)釀造過程優(yōu)勢真菌菌群與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性分析矩陣圖Fig. 8 Correlation analysis between dominant fungal flora and volatile flavor components during the brewing process

由圖8可知，卷枝毛霉菌、釀酒酵母、異常威克漢姆酵母與釀造過程中的大多數(shù)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)呈正相關(guān)，與個(gè)別揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)呈負(fù)相關(guān)，如己醛（F50）和丙酸（F70）；米曲霉、黑曲霉、弗氏假絲酵母、紫色紅曲霉等真菌與發(fā)酵過程中的大部分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)呈負(fù)相關(guān)，但與5,7-二氧辛酸（F26）、苯甲醛（F34）、己醛（F50）和丙酸（F70）這些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)呈正相關(guān)。

在釀酒過程中，釀酒酵母作為最主要的微生物群體，對乙醇及其他風(fēng)味物質(zhì)（酯類）的產(chǎn)生有重要作用[28-30]。Lappe-Oliveras等[31]研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母除了能利用葡萄糖、果糖、蔗糖等進(jìn)行乙醇發(fā)酵之外，還能產(chǎn)生許多功能性成分（氨基酸和維生素等），以及重要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，對酒體風(fēng)格的形成有顯著的促進(jìn)作用。

3 結(jié) 論

使用HS-SPME-GC-MS聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合PCA、OPLSDA模型對紅曲黃酒不同釀造時(shí)期的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行較全面分析發(fā)現(xiàn)：紅曲黃酒中的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)異戊醇、2-苯乙醇、己酸乙酯、丁二酸二乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、辛酸、辛酸乙酯、正癸酸、乙酸乙酯、柏木醇、乙酸苯乙酯和O-乙?；鶎追拥仁窃趥鹘y(tǒng)釀造的中、末期形成的。

通過菌群HTS技術(shù)對傳統(tǒng)釀造過程不同時(shí)期的菌群結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)：在紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造的初期、中期和末期菌群結(jié)構(gòu)多樣性改變顯著。在細(xì)菌方面，釀造初期優(yōu)勢細(xì)菌菌群主要有解淀粉芽孢桿菌、人參土芽孢桿菌和葡萄球菌屬等；中期與末期酒醪樣中的優(yōu)勢細(xì)菌菌群較為相似相似，主要是卷曲乳桿菌、明串珠菌屬和嗜酸乳桿菌等。在真菌菌群方面，初期優(yōu)勢真菌菌群主要以黑曲霉、少根根霉原變種和紫色紅曲霉等為主；到發(fā)酵中和末期，釀酒酵母逐漸成為釀造體系中的優(yōu)勢菌。

菌群與關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：葡糖酸醋酸桿菌屬、嗜酸乳桿菌、消化乳桿菌、卷曲乳桿菌、乳球菌屬、檸檬明串珠菌、假單胞菌屬、卷枝毛霉菌、釀酒酵母和異常威克漢姆酵母與釀造過程中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)大多呈正相關(guān)。研究結(jié)果闡明紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)形成與微生物菌群之間的關(guān)系，為紅曲黃酒中功能微生物的分離篩選和定向發(fā)酵調(diào)控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。