電流-時(shí)間曲線法測(cè)定魚(yú)露中的苯乙胺

趙曉娟，周嬋媛，張 敏，陳海光，白衛(wèi)東

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣州市廣式傳統(tǒng)食品加工與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510225）

苯乙胺又稱β-苯乙胺，是一種芳香族生物胺，廣泛存在于巧克力、牛奶、肉和葡萄酒中[1-2]。在人體內(nèi)，苯乙胺是一種生物堿與單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)，能夠提升細(xì)胞外液中多巴胺的水平，同時(shí)抑制多巴胺神經(jīng)活化，用于治療抑郁癥。苯乙胺作為重要的醫(yī)藥中間體，主要用于合成興奮藥、抗抑郁藥、迷幻劑、神入感激發(fā)劑、降食欲劑、支氣管擴(kuò)張藥等。但人體若攝入過(guò)量的苯乙胺，則可能出現(xiàn)惡心、失眠、頭暈和頭痛等不良反應(yīng)。因此，必須控制從食品中攝入的苯乙胺量，建立苯乙胺的快速、簡(jiǎn)便、靈敏的檢測(cè)方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前食品中苯乙胺及其他生物胺的檢測(cè)方法主要有[3]：色譜法[4-12]、毛細(xì)管電泳法[13-16]和生物傳感器法[17-22]等。其中，色譜法由于具有分離效率高、選擇性好、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)而應(yīng)用最為廣泛，但色譜法的樣品前處理操作繁瑣而耗時(shí)，尤其高效液相色譜法在測(cè)定生物胺時(shí)通常需要進(jìn)行衍生化反應(yīng)[4,23]，大量化學(xué)試劑的使用可能會(huì)給環(huán)境和人體造成一定的危害。

本研究通過(guò)優(yōu)化電極修飾方法、電化學(xué)測(cè)試方法和測(cè)試條件，建立一種苯乙胺的電化學(xué)檢測(cè)方法，并利用干擾性、重復(fù)性和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)等對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨在建立一種成本低、簡(jiǎn)便快速測(cè)定苯乙胺含量的方法，為魚(yú)露等食品中生物胺的快速檢測(cè)及質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚(yú)露 市購(gòu)；苯乙胺、酪胺、組胺、精胺、亞精胺、腐胺、尸胺、色胺 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；L-半胱氨酸（L-cysteine，Cys）、氯金酸、殼聚糖 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、硼氫化鈉 天津福晨化學(xué)試劑廠；所用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

CHI660E電化學(xué)工作站 北京華科普天儀器有限公司；三電極系統(tǒng)：工作電極為金電極（AuE，Φ=2 mm）或修飾的AuE，參比電極為Ag/AgCl電極（飽和KCl溶液），輔助電極為鉑絲電極 上海辰華儀器有限公司；金薄膜微電極（gold thin-film microelectrode，AuME）（由工作（Φ=1 mm）、參比和輔助電極組成） 西班牙Micrux公司；BSA124S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 納米金（AuNPs）的制備

AuNPs的制備參照文獻(xiàn)[24-26]方法。所用的玻璃器皿均用HNO3-HCl（1∶3，V/V）混合酸洗滌干凈。稱取適量殼聚糖，溶解在1.0%乙酸溶液中，配成2 mg/mL的溶液30 mL，在電磁攪拌下加入15 mL 10 mmol/L的氯金酸溶液，攪拌30 min，然后在攪拌下逐滴加入6 mL新配制的0.1 mol/L硼氫化鈉溶液，繼續(xù)攪拌，直至溶液變?yōu)橥该鞯木萍t色，并置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 電極處理

1.3.2.1 AuE的處理

將AuE依次用粒徑為1.0、0.3 μm和0.05 μm的α-Al2O3粉在專用拋光絨毛墊上拋光，每一步均用超純水洗凈，然后依次在HNO3（1＋1）、無(wú)水乙醇和水中超聲清洗。將預(yù)處理后的電極置于0.5 mol/L硫酸溶液中，在－0.3～1.5 V電位區(qū)間內(nèi)，以50 mV/s 的掃描速率進(jìn)行循環(huán)伏安電化學(xué)處理，直到獲得穩(wěn)定的循環(huán)伏安響應(yīng)為止。

1.3.2.2 AuME的處理

將3 μL的0.1 mol/L硫酸溶液滴加在AuME表面，－1.5～1.5 V電位區(qū)間內(nèi)，以0.1 V/s的掃描速率循環(huán)伏安處理10 圈，用水淋洗后室溫晾干備用。

1.3.3 修飾電極的制備

分別利用AuNPs和Cys對(duì)AuE進(jìn)行修飾。將3 μL的AuNPs溶膠滴涂在AuE表面，室溫晾干后，即得到納米金修飾金電極（AuNPs/AuE）。將AuE浸入0.1 mol/L Cys的HCl溶液（0.05 mol/L）中，于4 ℃自組裝12 h，取出電極用水淋洗后得到Cys修飾電極（Cys/AuE）。

1.3.4 樣品處理

魚(yú)露樣品的處理參照GB 5009.208—2016《食品中生物胺的測(cè)定》[27]中的萃取方法。取約15 mL魚(yú)露于干凈的小燒杯中，用0.22 μm醋酸纖維濾膜過(guò)濾于50 mL燒杯中，在所得濾液中加入氯化鈉使溶液飽和。量取10.0 mL飽和溶液于50 mL離心管中，用1.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至12，再加入5 mL正丁醇-三氯甲烷（1∶1，V/V）混合液，旋渦振蕩5 min，于3 600 r/min離心10 min，取上層有機(jī)相，且需重復(fù)2 次，合并2 次溶液。將混合液置于60 ℃水浴蒸至近干，然后用氮?dú)獯蹈?。最后加? mL pH 12.7的NaOH溶液使殘留物溶解，所得溶液即待測(cè)溶液。

1.3.5 測(cè)試方法

基于AuE的測(cè)試體系是將三電極系統(tǒng)置于pH 12.7的NaOH空白溶液中，在磁力攪拌器均勻快速攪拌下，用積分脈沖安培（integrated pulsed amperometric detection，IPA）法[28]（E2電位0.5 V）和電流-時(shí)間（I-t）曲線法（初始電位0.1 V）分別進(jìn)行掃描，待基線穩(wěn)定后，用微量注射器注入一定量的苯乙胺溶液，再掃描至穩(wěn)定，測(cè)量出響應(yīng)的電流差（各濃度苯乙胺溶液的響應(yīng)電流值與NaOH空白溶液的響應(yīng)電流值之差）。

基于AuME的測(cè)試體系是將NaOH空白溶液和不同濃度的苯乙胺溶液依次滴加在電極表面進(jìn)行掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 IPA法測(cè)定條件優(yōu)化

2.1.1 工作電極的選擇

工作電極的形狀和尺寸對(duì)其測(cè)試性能有重要影響。利用IPA法考察不同濃度的苯乙胺溶液在AuE和AuME上的電化學(xué)響應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用AuE進(jìn)行測(cè)定時(shí)操作簡(jiǎn)單方便，基線穩(wěn)定，1.66×10－6mol/L苯乙胺具有明顯響應(yīng)，測(cè)試靈敏度較高，且響應(yīng)電流隨著苯乙胺濃度的增加而增加。當(dāng)用AuME進(jìn)行測(cè)定時(shí)，1.0×10－6mol/L和1.0×10－5mol/L苯乙胺溶液與NaOH空白溶液的響應(yīng)曲線幾乎重疊，說(shuō)明AuME對(duì)低濃度苯乙胺溶液無(wú)響應(yīng)，雖然1.0×10－3mol/L苯乙胺在AuME上具有明顯響應(yīng)，但基線一直下降，不穩(wěn)定。因此，選用AuE作為IPA法測(cè)定的工作電極。

2.1.2 電極修飾方法的選擇

Cys分子能通過(guò)巰基定向自組裝在AuE的表面，其分子中的氨基和羧基兩種活性官能團(tuán)能增加修飾電極的電催化活性。AuNPs具有大的比表面積和良好的導(dǎo)電性，能增加電極表面的氧化還原反應(yīng)位點(diǎn)，提高修飾電極的靈敏度，是目前應(yīng)用最為廣泛的一種金屬納米材料。本研究分別采用Cys和AuNPs對(duì)AuE進(jìn)行修飾，比較AuE和制備的Cys/AuE和AuNPs/AuE對(duì)不同濃度苯乙胺溶液的測(cè)試效果。由圖1A可知，3 種電極測(cè)定苯乙胺的響應(yīng)電流差由大到小依次為：AuE、Cys/AuE、AuNPs/AuE。由圖1B可知，AuNPs/AuE在NaOH空白溶液中掃描時(shí)基線達(dá)到穩(wěn)定所需的時(shí)間較長(zhǎng)，主要是由于利用IPA法掃描過(guò)程中，電位的變化引起電極表面AuNPs的穩(wěn)定性發(fā)生改變；而Cys/AuE與AuE測(cè)定苯乙胺的安培響應(yīng)曲線變化趨勢(shì)近乎相同，穩(wěn)定性均良好，說(shuō)明與AuE相比，利用Cys修飾AuE對(duì)苯乙胺的測(cè)試效果沒(méi)有顯著影響和改善。因此，選擇AuE進(jìn)行測(cè)試。

圖1 不同電極測(cè)定苯乙胺的電流差比較圖（A）和IPA圖（B）Fig. 1 Comparison of current difference (A) and integrated pulsed amperometric responses (B) of phenethylamine on different electrodes

2.1.3 氧化峰電位和E2電位的確定

將AuE先后置于pH 12.7的NaOH和1.0×10－3mol/L苯乙胺溶液中，用流體力學(xué)調(diào)制伏安法[29-31]在0～0.9 V進(jìn)行掃描，通過(guò)比較兩者的伏安曲線，確定苯乙胺的氧化峰電位在0.3～0.65 V之間。根據(jù)氧化峰電位，將IPA法的E2電位分別設(shè)置為0.3、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6 V和0.65 V，運(yùn)用IPA法測(cè)試8.32×10－7mol/L和1.66×10－6mol/L苯乙胺溶液，比較不同電位參數(shù)下AuE對(duì)于低濃度苯乙胺的響應(yīng)情況，確定最優(yōu)電位。如圖2所示，當(dāng)E2電位為0.3～0.5 V時(shí)，測(cè)得的電流差值逐漸增大，在0.5 V時(shí)苯乙胺的電流響應(yīng)達(dá)到最大值，然后電流差值隨著E2電位的增加而減小。因此，最優(yōu)E2電位確定為0.5 V。

圖2 E2電位對(duì)苯乙胺電化學(xué)響應(yīng)的影響Fig. 2 Effects of E2 potential on the electrochemical response of phenethylamine

2.1.4 IPA法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按照2.1.3節(jié)優(yōu)化的E2電位，使用IPA法考察不同濃度苯乙胺在AuE上電流響應(yīng)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著苯乙胺濃度的增加，IPA響應(yīng)曲線呈階梯式上升。電流差ΔI與苯乙胺溶液濃度c在8.32×10－7～1.40×10－5mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：ΔI = 0.279 8c＋0.389 3（r = 0.997），基于3 倍的信噪比，得到該法測(cè)定苯乙胺的檢出限為2.8×10－7mol/L。

2.1.5 干擾性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 IPA法測(cè)定3 種生物胺的電流差比較圖Fig. 3 Comparison of current difference of three kinds of biogenic amines on AuE by IPA

以1.66×10－6、3.32×10－6mol/L和6.62×10－6mol/L苯乙胺溶液為對(duì)照，采用IPA法考察相同濃度的酪胺、組胺對(duì)苯乙胺測(cè)定的干擾情況，結(jié)果如圖3所示。利用該法測(cè)試苯乙胺時(shí)，酪胺和組胺均有明顯響應(yīng)，會(huì)對(duì)苯乙胺的測(cè)試結(jié)果產(chǎn)生干擾，食品中其他幾種常見(jiàn)的生物胺很可能也有干擾。因此，采用IPA法可以對(duì)食品中的組胺、酪胺和苯乙胺等生物胺的總量進(jìn)行測(cè)定，但是該法不能對(duì)苯乙胺含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。

2.2 I-t曲線法

2.2.1 工作電極的選擇

運(yùn)用I-t曲線法考察不同濃度苯乙胺溶液在AuE和AuME表面的電化學(xué)響應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用I-t曲線法測(cè)定時(shí)，苯乙胺在兩種電極上的響應(yīng)靈敏度均明顯高于IPA法。此外，與IPA法相似，AuE的響應(yīng)基線穩(wěn)定，能夠測(cè)定8.26×10－8mol/L苯乙胺溶液，測(cè)試靈敏度高于AuME，且響應(yīng)電流差值隨著苯乙胺濃度的增加而增加。因此，選用AuE作為I-t曲線法測(cè)定的工作電極。

2.2.2 修飾方法的選擇

采用AuNPs對(duì)AuE進(jìn)行修飾，比較AuE和AuNPs/AuE對(duì)8.26×10－8、2.49×10－7、5.8×10－7、9.08×10－7mol/L和1.23×10－6mol/L苯乙胺溶液的測(cè)試效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苯乙胺在AuE和AuNPs/AuE上I-t響應(yīng)曲線的變化趨勢(shì)大致相同，穩(wěn)定性良好，但是響應(yīng)電流差的大小有明顯區(qū)別。相同濃度苯乙胺在AuNPs/AuE上的響應(yīng)電流差明顯比AuE的大，隨著苯乙胺濃度的增加，電流差增大的幅度越明顯，說(shuō)明AuNPs/AuE對(duì)苯乙胺具有良好的測(cè)試效果，AuNPs的修飾增加了AuE的響應(yīng)靈敏度。因此，選擇AuNPs作為AuE的修飾材料。

2.2.3 初始電位的優(yōu)化

I-t曲線法對(duì)苯乙胺的響應(yīng)電位與IPA法不同，因此，首先需要測(cè)出苯乙胺溶液的開(kāi)路電位，然后以開(kāi)路電位為基礎(chǔ)，對(duì)I-t曲線法的初始電位進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)測(cè)得1.0×10－6mol/L苯乙胺溶液的開(kāi)路電位為0.083 V。根據(jù)開(kāi)路電位，將I-t曲線法的初始電位分別設(shè)置為0.06、0.08、0.1、0.2 V和0.3 V，考察不同濃度苯乙胺在AuNPs/AuE上的響應(yīng)情況，結(jié)果如圖4所示。初始電位的改變對(duì)苯乙胺的電流響應(yīng)值具有顯著影響，與其他電位相比，當(dāng)初始電位為0.1 V時(shí)，不同濃度苯乙胺在AuNPs/AuE上的響應(yīng)電流值均最大。而當(dāng)初始電位為0.3 V時(shí)，苯乙胺在電極表面沒(méi)有響應(yīng)，隨著苯乙胺濃度的增加，掃描曲線無(wú)明顯變化。因此，選擇0.1 V作為I-t曲線法的最佳初始電位。

圖4 不同初始電位時(shí)苯乙胺在AuNPs/AuE上的電流差比較圖Fig. 4 Comparison of current difference of phenethylamine at different initial potentials on AuNPs/AuE

2.2.4 I-t曲線法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

使用I-t曲線法考察不同濃度苯乙胺在AuNPs/AuE上電流響應(yīng)的變化情況。結(jié)果顯示，隨著苯乙胺溶液濃度的增加，I-t曲線呈階梯式下降。苯乙胺在電極上的響應(yīng)電流差－ΔI與濃度c在4.13×10－8～4.72×10－6mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：－ΔI= 7.783c＋1.181（r = 0.997），該法對(duì)苯乙胺的檢出限為1.4×10－8mol/L（RSN= 3），雖然高于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[32]的2.5×10－10mol/L，但明顯低于2.1節(jié)IPA法和文獻(xiàn)[4,15-16,28]報(bào)道的檢出限水平。該電化學(xué)檢測(cè)方法試劑用量少、靈敏度較高、成本低、簡(jiǎn)便快速，可以與色譜法形成優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，在苯乙胺的快速檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮其應(yīng)用價(jià)值。

2.2.5 干擾性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用I-t曲線法考察不同濃度的酪胺、組胺、精胺、亞精胺、腐胺、尸胺、色胺對(duì)測(cè)定苯乙胺的干擾情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除色胺外，相同濃度甚至10 倍于苯乙胺濃度的其余6 種生物胺對(duì)苯乙胺的測(cè)定均無(wú)明顯干擾。2.5×10－7、5.8×10－7、1.23×10－6mol/L苯乙胺和色胺的電化學(xué)響應(yīng)如圖5所示。與苯乙胺相比，相同濃度色胺的響應(yīng)電流差值明顯較小。由于色胺在水產(chǎn)品及其制品中含量相對(duì)較少，所以利用該法測(cè)定水產(chǎn)品及其制品中的苯乙胺時(shí)可不考慮色胺的影響。

圖5 I-t曲線法測(cè)定苯乙胺和色胺的電流差比較圖Fig. 5 Comparison of current difference of phenethylamine and tryptamine on AuNPs/AuE by I-t method

2.2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用6支AuNPs/AuE對(duì)濃度為1.66×10－7、3.32×10－7mol/L的苯乙胺溶液分別進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得苯乙胺響應(yīng)電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.7%和4.0%，表明AuNPs/AuE的重復(fù)性良好。

2.3 樣品分析與回收率的測(cè)定結(jié)果

將魚(yú)露調(diào)味品按照1.3.4節(jié)方法進(jìn)行前處理，然后使用I-t曲線法進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得該魚(yú)露測(cè)試樣品液中苯乙胺濃度為1.85×10－7mol/L，經(jīng)換算得出該魚(yú)露樣品中苯乙胺濃度為1.11×10－5mol/L。為驗(yàn)證此方法的準(zhǔn)確性，對(duì)魚(yú)露樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。魚(yú)露樣品中不同濃度（1.66×10－7、3.31×10－7mol/L）苯乙胺的加標(biāo)回收率為90.0%～110.8%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.8%和6.2%。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用IPA法和I-t曲線法測(cè)定苯乙胺，對(duì)工作電極、電極修飾方法、測(cè)定電位分別進(jìn)行選擇和優(yōu)化，并比較兩種方法的測(cè)定效果。結(jié)果表明：利用AuE和IPA法可以對(duì)食品中的組胺、酪胺和苯乙胺等生物胺的總量進(jìn)行測(cè)定，但是該法不能對(duì)苯乙胺含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定；采用膠體金修飾的AuE，在初始電位為0.1 V時(shí)，運(yùn)用I-t曲線法測(cè)定苯乙胺具有良好的選擇性和較高的靈敏度，檢出限為1.4×10－8mol/L，測(cè)定魚(yú)露樣品中苯乙胺的加標(biāo)回收率在90.0%～110.8%之間，該法適用于魚(yú)露樣品中苯乙胺的測(cè)定。