固相萃取-高效液相色譜法測定蘋果汁及其飲料中展青霉素的含量

劉文慧，董 越，王 娜，李紹振*

（北京匯源飲料食品集團(tuán)有限公司，北京 100000）

展青霉素又名棒曲霉素，是一種非揮發(fā)性的內(nèi)酯類化合物，屬于真菌類毒素，是青霉屬、曲霉屬、羅囊菌屬和絲衣霉屬等多種真菌的次生代謝產(chǎn)物，可溶于水、乙醇、在堿性溶液中不穩(wěn)定，極易被破壞，具有神經(jīng)毒性、潛在的免疫毒性、致癌、致畸和致突變性[1-3]。展青霉素主要污染水果及其制品，蘋果及其制品尤為嚴(yán)重[4-7]，給蘋果產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也對人的健康和安全構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅[5-6,8-9]。GB 2761—2016《食品中真菌毒素限量》標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定以蘋果、山楂為原料的制品中展青霉素限量為50 μg/kg[10]。GB/T 18963—2012《濃縮蘋果汁》標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定展青霉素為出廠檢測項(xiàng)目[11]。

展青霉素的檢測方法有薄層色譜法[12-13]、液相色譜法[14-17]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[18]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[19-21]、免疫學(xué)檢測方法[22-23]等。2017年6月23日實(shí)施的GB 5009.185—2016《食品中展青霉素的測定》[24]中方法為：第一法同位素稀釋-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，適用于蘋果和山楂為原料的水果及其制品、果蔬汁類和酒類食品中展青霉素含量的測定。第二法高效液相色譜法，僅適用于蘋果為原料的水果及其果蔬汁類和酒類食品中展青霉素含量的測定。第一法從標(biāo)準(zhǔn)品、試劑耗材到檢測用儀器價(jià)格都十分昂貴，第二法中使用的展青霉素專用固相萃取凈化柱也價(jià)格不菲，檢測成本很高。這給以此作為出廠檢測項(xiàng)目的蘋果濃縮汁生產(chǎn)廠家造成了很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此從企業(yè)自控方面考慮，開發(fā)適合企業(yè)自控用的準(zhǔn)確度較高，檢測成本適中的檢測方法尤為重要。

本實(shí)驗(yàn)采用價(jià)格相對較低的混合型陰離子交換柱作為凈化柱，采用目前蘋果濃縮汁生產(chǎn)企業(yè)都已配備的液相色譜作為檢測儀器，優(yōu)化前處理?xiàng)l件，評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，建立了蘋果汁及其飲料中展青霉素檢測的固相萃取-高效液相色譜檢測方法，此方法準(zhǔn)確度較高，成本適中，操作較簡便，為蘋果濃縮汁生產(chǎn)企業(yè)提供了適合自控的檢測方法，減輕了蘋果濃縮汁生產(chǎn)企業(yè)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果汁及其飲料 市售；棒曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.5%） 美國Sigma公司；乙腈、乙酸、乙酸乙酯（均為色譜純） 百靈威科技有限公司；甲醇（色譜純）美國Fisher公司；乙酸銨（優(yōu)級純） 鄭州派尼化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

1100系列液相色譜儀（配二極管陣列檢測器）美國Agilent公司；SE812氮吹儀 北京帥恩科技有限責(zé)任公司；ULUP-II超純水機(jī) 四川優(yōu)普超純科技有限公司；BSA224S-CW電子天平 德國賽多利斯公司；UV-2450紫外-可見光分光光計(jì) 島津企業(yè)管理（中國）有限公司；固相萃取裝置 美國Supelco公司；Cleanert PAX-SPE混合型陰離子交換柱（150 mg/6 mL） 天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及質(zhì)量濃度標(biāo)定

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：用5 mL乙酸乙酯溶解展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品5 mg后，移入25 mL的容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，混勻，配制成質(zhì)量濃度為200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，－20 ℃冷凍避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液質(zhì)量濃度標(biāo)定：參照GB 5009.185—2016[24]。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制備：取1 000 μL經(jīng)標(biāo)定過的展青霉毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用氮?dú)獯蹈珊笕芙庥?0 mL pH 4.0水（乙酸調(diào)pH值）中，配制成質(zhì)量濃度為1 000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。根據(jù)需要再用pH 4.0水稀釋，配成適當(dāng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品處理

1.3.2.1 樣品預(yù)處理

蘋果濃縮汁：按照GB/T 18963—2012[11]要求稀釋至原汁，待凈化；蘋果汁及其飲料：取樣品，待凈化。

1.3.2.2 凈化

Cleanert PAX-SPE（混合型陰離子交換柱）活化：依次用5 mL甲醇，5 mL水進(jìn)行活化，活化后置于超純水中平衡；取2 g待凈化樣品（精確至1 mg）轉(zhuǎn)移至已預(yù)活化好的混合型陰離子交換柱中，控制樣液3 mL/min的穩(wěn)定速度過柱，上樣完成后，依次加入3 mL乙酸銨溶液（5 mmol/L）、3 mL水淋洗，抽干混合型陰離子交換柱后，加入4 mL甲醇洗脫，棄去初始的1 mL洗脫液，收集后續(xù)洗脫液，在洗脫液中加20 μL乙酸，混勻，40 ℃緩慢氮吹至近干后，用乙酸水溶液（20 mL乙酸＋250 mL水）定容至1 mL，混勻，過0.45 μm水相膜，待測。

1.3.3 液相色譜條件

Waters Xbridge C18液相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相：A為乙腈，B為超純水；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流速1 mL/min；檢測波長254 nm；檢測時(shí)間18 min；延遲（后運(yùn)行）2 min；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.4 展青霉素含量計(jì)算

按公式（1）計(jì)算展青霉素含量：

式中：x為樣品中展青霉素含量/（μg/kg）；ρ為由校準(zhǔn)曲線計(jì)算所得的試樣溶液中展青霉素的質(zhì)量濃度/（μg/L）；V為最終定容體積/mL；m為樣品取樣量/g；f為稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析采用Excel 10.0，圖像處理方法采用Origin 7.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢出限和定量限的測定

2.1.1 展青霉素儀器檢出限[25]

按照1.3.1節(jié)配制不同質(zhì)量濃度的展青霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液，按1.3.3節(jié)液相色譜條件進(jìn)樣測定，根據(jù)GB/T 27417—2017信噪比法評估檢出限的要求，采用信噪比為3確定展青霉素儀器檢出限為10 μg/L，故此液相色譜檢測方法能夠用于展青霉素的檢測。

2.1.2 蘋果汁中展青霉素方法檢出限和定量限

蘋果汁樣品（空白樣品）和蘋果汁樣品（空白樣品）加標(biāo)后按1.3.2節(jié)處理后按1.3.3節(jié)進(jìn)樣測定，同時(shí)測定展青霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液，見圖1。

圖1 展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品（A）、蘋果汁樣品（B）和蘋果汁樣品（空白樣品）加標(biāo)（25 μg/kg）（C）液相色譜圖Fig. 1 Liquid chromatograms of patulin standard (A), real apple juice sample(B) and spiked apple juice sample (at 25 μg/kg) (C)

由圖1A可知，展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為7.9 min，圖1B在7.9 min未出峰，說明蘋果汁樣品（空白樣品）中未檢出展青霉素，圖1C在7.9 min出峰，說明蘋果汁樣品中若含有展青霉素（含量高于檢出限時(shí)）能夠檢出，由此可知此方法可用于蘋果汁中展青霉素的檢測。

在蘋果汁樣品（空白樣品）中加不同質(zhì)量濃度水平的展青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，根據(jù)GB/T 27417—2017信噪比法評估檢出限的要求，采用信噪比為3，確定展青霉素的方法檢出限為8 μg/kg，根據(jù)GB/T 27417—2017中定量限為3 倍的檢出限，確定展青霉素的定量限為25 μg/kg，低于GB 2761—2016中對于展青霉素限量50 μg/kg的要求，故此液相色譜檢測方法能夠用于蘋果汁中展青霉素的檢測。

2.2 展青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)曲線

由2.1.2節(jié)可知，展青霉素的方法定量限為25 μg/kg，而檢測方法中取約2 g樣品經(jīng)前處理后定容至1 mL，相當(dāng)于樣品濃縮約2 倍，故校準(zhǔn)曲線以50 μg/L為最低質(zhì)量濃度。

按1.3.1節(jié)配制50、100、200、300、400 μg/L和500 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.3.3節(jié)液相色譜條件進(jìn)樣重復(fù)測定3 次，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制校準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程y=0.097 4x－0.224 2，決定系數(shù)R2為0.999 6，表明在50～500 μg/L線性關(guān)系良好，校準(zhǔn)曲線符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》[26]的要求。

2.3 回收率和精密度測試結(jié)果

精密度采用變異系數(shù)來衡量。在蘋果汁樣品（空白樣品）中加3 個(gè)質(zhì)量濃度水平的展青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度水平按1.3.2節(jié)處理后按1.3.3節(jié)進(jìn)樣重復(fù)測定3 次，按1.3.4節(jié)進(jìn)行結(jié)果計(jì)算，回收率和精密度結(jié)果見表2。

表2 回收率測試結(jié)果Table 2 Results of recovery test

由表2可知，回收率和精密度符合GB/T 27404—2008中對于檢測方法回收率和精密度的要求。

2.4 檢測結(jié)果準(zhǔn)確性測試結(jié)果

2.4.1 質(zhì)控樣品來源及評價(jià)方法

從有資質(zhì)的機(jī)構(gòu)（CNAS認(rèn)可能力驗(yàn)證提供者）購買果汁中展青霉素含量檢測內(nèi)部質(zhì)控樣品進(jìn)行測定，質(zhì)控樣品采用Z-比分?jǐn)?shù)法[27-29]評價(jià)測定結(jié)果，Z-比分按公式（2）計(jì)算：

式中：x為測試結(jié)果/（μg/kg）；X為指定值/（μg/kg）； 為標(biāo)準(zhǔn)差/（μg/kg）。X、 由質(zhì)控樣品提供單位給定。

評價(jià)方法：|Z|≤2，滿意結(jié)果；2＜|Z|＜3，有問題結(jié)果（可疑）；|Z|≥3，不滿意結(jié)果（離群）。

2.4.2 質(zhì)控樣品測定結(jié)果

質(zhì)控樣品按1.3.2節(jié)處理后按1.3.3節(jié)進(jìn)樣重復(fù)測定6 次，按1.3.4節(jié)進(jìn)行結(jié)果計(jì)算，展青霉素含量分別為323.536、330.366、328.089、326.851、321.260 μg/kg和321.260 μg/kg，x為325.227 μg/kg， 為3.783 μg/kg，變異系數(shù)為1.16%，小于15%[26]。

2.4.3 測定結(jié)果評價(jià)

按照質(zhì)控樣給定的評價(jià)方法對檢測結(jié)果進(jìn)行評價(jià)，由表3可知，質(zhì)控樣品的檢測結(jié)果符合要求。綜上，此展青霉素的檢測方法能夠用于蘋果汁中展青霉素的檢測。

表3 質(zhì)控樣品測定結(jié)果評價(jià)Table 3 Analytical results for the determination of patulin in quality control samples

3 討 論

3.1 展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品的選擇和稱量

由于展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格較高，且標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制后需標(biāo)定確定質(zhì)量濃度，故展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品純度符合要求，不使用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也可滿足標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溯源的需求。在檢測過程中展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品使用量較小，5 mg即可滿足要求，因此建議購買5 mg裝標(biāo)準(zhǔn)品。稱量5 mg的標(biāo)準(zhǔn)品，需要使用至0.001 mg天平[30]，一般工廠化驗(yàn)室不具備稱量條件，由于標(biāo)準(zhǔn)品在分裝時(shí)對于分裝量有允差要求，且配制成標(biāo)準(zhǔn)儲備液后需標(biāo)定確定溶液質(zhì)量濃度，故不稱量標(biāo)準(zhǔn)品對標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度不造成影響，因此可將5 mg裝的展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品，不需稱量全部配制成標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

3.2 展青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液貯存問題

由于展青霉素容易降解，故展青霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液的貯存條件十分重要，需在－20 ℃冷凍避光條件下貯存。3.1節(jié)中提到將購買小包裝展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品一次全部配制成標(biāo)準(zhǔn)儲備液，在使用過程中為了避免反復(fù)凍融對展青霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液的影響，可將配成的標(biāo)準(zhǔn)儲備液混勻后分裝成幾份，做好標(biāo)記，－20 ℃冷凍避光貯存。在貯存過程中需對展青霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度定期監(jiān)測，貯存條件定期監(jiān)控。展青霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液在－20 ℃避光條件下可貯存3 a。

展青霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液實(shí)際是由標(biāo)定液配制而成的，故展青霉素標(biāo)定液的貯存也尤為重要，同樣需在－20 ℃冷凍避光條件下貯存。在使用過程中注意觀察標(biāo)定液濃度變化。展青霉素標(biāo)定液在－20 ℃可貯存6 個(gè)月。

展青霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液，配制后在4～6 ℃冷藏避光條件下貯存，在使用過程中注意觀察標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度變化。展青霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液在4～6 ℃冷藏避光下貯存可使用1 個(gè)月。

3.3 檢出限

GB/T 27417—2017中檢出限分為儀器檢出限和方法檢出限。儀器檢出限為用儀器可靠地將目標(biāo)分析物信號從背景（噪音）中識別出來時(shí)分析物的最低濃度或量；方法檢出限為用特定方法可靠的將分析物測定信號從特定基質(zhì)背景中識別或區(qū)分出來時(shí)分析物的最低濃度或量。

由標(biāo)準(zhǔn)中給定的定義可知，標(biāo)準(zhǔn)品配制成標(biāo)準(zhǔn)工作液后按儀器檢測條件直接進(jìn)樣得到的是儀器檢出限，而方法檢出限是樣品基體按規(guī)定的前處理?xiàng)l件處理后，再按儀器檢測條件檢測得到的檢出限。方法檢出限不但與儀器噪音有關(guān)，而且還決定于方法全部流程的各個(gè)環(huán)節(jié)，如取樣、分離富集、測定條件優(yōu)化等，分析者、環(huán)境、樣品性質(zhì)等對檢出限也均有影響。

因此檢測方法選擇時(shí)，儀器檢出限可以確定檢測所用儀器是否能夠用于目標(biāo)物質(zhì)的檢測，而檢測方法是否能夠滿足樣品中目標(biāo)物質(zhì)檢測定量的需求需要測定方法檢出限。

3.4 基體對于檢測的影響

CNAS-CL01-A002：2018[31]中關(guān)于使用的檢測標(biāo)準(zhǔn)中對于樣品基體要求，“實(shí)驗(yàn)室應(yīng)關(guān)注檢測方法中提供的限制說明、濃度范圍和樣品基體”，“任何對標(biāo)準(zhǔn)方法的偏離，都必須進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)（如超出適用的濃度范圍或基體使用標(biāo)準(zhǔn)方法）”，由此可見在檢測方法中樣品基體尤為重要，因此不能認(rèn)為檢測方法能用于一種樣品基體，就能用于所有樣品基體的檢測。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，本研究檢測方法僅適用于蘋果汁及其飲料中展青霉素的檢測，不適用于山楂樣品中展青霉素的檢測。