電感耦合等離子體質譜法分析海蟹中的砷元素分布特征

嚴 國，梅光明*，常家琪，張小軍，顧 捷，孟春英

（1.浙江海洋大學食品與醫(yī)藥學院，浙江 舟山 316021；2.浙江省海洋水產研究所，浙江 舟山 316021；3.浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，浙江 舟山 316021）

砷（As）是自然界中廣泛分布的一種重要的類金屬元素，可與肌體細胞中的酶結合，使許多酶失活，造成代謝障礙[1]。自然界中的砷元素通常由地表徑流等方式進入海水中，又通過食物鏈在海產品富集，因此海產品攝入成為人體暴露砷元素的主要途徑之一[2-3]。海產品中的砷分為無機砷和有機砷兩大類，其中無機砷主要指砷酸根（arsenate，As（V））和亞砷酸根（arsenite，As（III）），有機砷主要指一甲基砷（monomethyl arsenic acid，MMA）、二甲基砷（dimethyl arsenic acid，DMA）、砷甜菜堿（arsenobetaine，AsB）、砷膽堿（arsenocholine，AsC）、砷糖和砷脂等[4]。砷的生物毒性不僅與其總含量相關，更大程度上與其存在的形態(tài)種類相關[5]，以半致死量（LD50）計，毒性依次為As（III）＞As（V）＞MMA＞DMA＞AsB＞AsC[6-7]。無機砷是砷元素化合物致畸、致癌及致突變的主要來源，有機砷通常被認為是低毒或者無毒的，海產品中砷化合物的含量較高，但主要以無毒或低毒的AsB和砷糖的形式存在[4]。

目前砷形態(tài)分析的方法主要有高效液相色譜-原子熒光光譜（high performance liquid chromatography-atomic fluorescence spectrometry，HPLC-AFS）法[8-10]、高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜（high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry，HPLC-ICP-MS）法[11-14]以及毛細管電泳-ICP-MS法[15-17]等。HPLC-ICP-MS因結合了HPLC的高效分離性能和ICP-MS的超強元素分析能力，具有線性范圍寬、檢出限低、靈敏度高且干擾少等優(yōu)點，已成為目前砷形態(tài)分析最有力的方法，廣泛應用于食品[3,14,18-19]、藥品[20-21]、環(huán)境[22-23]中砷化合物的測定。GB 5009.11—2014《食品中總砷及無機砷的測定》[24]中第一法HPLC-AFS法最多只能測定As（III）、As（V）、MMA和DMA這4 種砷形態(tài)分析物，不能測定AsB等（因其無法轉化成含砷的氣態(tài)氫化物而被AFS測定）。該標準中的第二法使用HPLC-ICP-MS測定了5 種砷形態(tài)，但在實際樣品中也很難將AsB和DMA分開，嚴重影響二者定性和定量準確性要求。海蟹因具有味道鮮美、低脂肪、高蛋白等優(yōu)點，深受消費者喜愛，但同時作為一種營養(yǎng)級別較高的甲殼類海產生物，其富集砷元素能力較強，已有文獻中有關不同品種海蟹及蟹體不同組織中砷元素的分布特征的研究報道較少。本實驗運用優(yōu)化后的ICP-MS法對4 種海蟹（青蟹、三疣梭子蟹、日本鱘和細點圓趾蟹）及其不同組織（蟹肌肉、蟹鉗肉、蟹鰓、肝胰腺和性腺）中的砷元素分布特征進行測定，為海蟹砷污染風險評估及消費者食用建議提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青蟹、三疣梭子蟹、日本鱘和細點圓趾蟹均購于浙江省舟山市超市或集貿市場，按照GB/T 30891—2014《水產品抽樣規(guī)范》[25]處理后作為待測樣品。

AsB溶液標準物質（GBW 08670）、MMA溶液標準物質（GBW 08668）、DMA溶液標準物質（GBW 08669）、As（V）溶液標準物質（GBW 08667）、As（III）溶液標準物質（GBW 08666） 中國計量科學研究院；砷單元素標準溶液（1 000 μg/mL，GSB04-1714-2004） 國家有色金屬及電子材料分析測試中心；扇貝粉（GBW10023）和紫菜粉（GBW10050）生物成分分析標準物質 地球物理地球化學勘查研究所；金槍魚組織中砷形態(tài)標準物質（BCR-627） 歐洲標準局。

(NH4)2CO3、NH4H2PO4、(NH4)2HPO4（均為色譜純）德國Sigma公司；甲醇、正己烷（均為色譜純） 德國Merck公司；硝酸（優(yōu)級純） 美國J.T.Baker公司；過氧化氫、氨水（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；質譜調諧液（10 μg/L Ce、Co、Li、Tl、Y）、內標液（100 μg/mL Bi、Ge、In、Li、Lu、Rh）美國Agilent公司；實驗用水為Milli-Q制備超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設備

AcquityTMH-class超高效液相色譜儀 美國Waters公司；7900型ICP-MS儀 美國Agilent公司；Centrifuge 5810高速離心機 德國Eppendorf公司；MS2旋渦混合器德國IK公司；AL204型電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；超聲清洗機 寧波海曙科生超聲設備有限公司；pH計 德國Sartorius公司；ETHOS 1型微波消解儀 意大利Milestone公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

砷形態(tài)物標準儲備溶液：將5 種不同形態(tài)砷（AsB、MMA、DMA、As（III）、As（V））的標準物質溶液取適量分別準確轉移至5 mL容量瓶中，用超純水分別定容至5 mL，其質量濃度分別為14.72、9.54、22.17、28.78、6.88 μg/mL，于4 ℃避光保存，備用。

砷形態(tài)物混合標準使用液：分別準確移取5 種不同形態(tài)砷（AsB、MMA、DMA、As（III）、As（V））的標準儲備溶液340、524、226、174、727 μL于5 mL容量瓶中，用超純水容至5 mL，使各組分質量濃度均為1.0 μg/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

砷形態(tài)標準曲線系列：分別準確移取砷形態(tài)物混合標準使用溶液50、100、250、500 μL用流動相定容至5 mL，使標準溶液質量濃度為10、20、50、100 μg/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。

砷單元素標準曲線系列溶液：將1 000 μg/L砷單元素標準溶液用1%硝酸溶液逐級稀釋到1.0、5.0、10.0、30.0、50.0、100.0、300 μg/L，超純水定容至5 mL備用。

硝酸溶液（0.15 mol/L）：準確量取10 mL硝酸，溶于水并稀釋至1 000 mL。

(NH4)2CO3溶液（50 mmol/L）：稱取2.450 3 g（精確至0.000 1 g）(NH4)2CO3，溶于500 mL水中，用氨水調節(jié)pH 9.5，經0.45 μm水相濾膜過濾后超聲脫氣30 min，備用。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 總砷測定前處理

準確稱量0.5 g（精確至0.000 1 g）均質后的待測螃蟹樣品于聚四氟乙烯消解罐中，依次加入6.0 mL硝酸、2.0 mL過氧化氫溶液，搖勻后加蓋放置過夜，使樣品進行預消解。次日將消解罐放入微波消解系統(tǒng)中，設置適宜的微波消解程序（表1），按照相關消解步驟進行消解。消解完畢后，180 ℃于趕酸架上加熱趕酸至1～2 mL，冷卻至室溫后用超純水定容至50 mL，采用ICP-MS上機測定。同時做試劑空白實驗，采用扇貝粉和紫菜粉作為質控樣進行結果質量控制。

表1 微波消解程序Table 1 Microwave digestion procedure

1.3.2.2 砷形態(tài)前處理

準確稱量均質后的待測樣品0.5～1.0 g（精確至0.000 1 g）于50 mL離心管中，加入20 mL 0.15 mol/L硝酸溶液，3 000 r/min渦旋1 min，置于氣浴恒溫振蕩器中，在50 ℃、150 r/min過夜振蕩提取，提取完畢后次日取出，冷卻至室溫，3 000 r/min渦旋30 s，6 000 r/min離心8 min。移取5 mL上清液于15 mL離心管中，加入正己烷3 mL，3 000 r/min渦旋1 min后再6 000 r/min離心8 min，棄去正己烷層。吸取下層清液，經0.22 μm水相濾膜過濾后上HPLC-ICP-MS分析。按相同操作方法做試劑空白實驗，同時檢測BCR-627標準物質進行結果質量控制。

1.3.3 方法

1.3.3.1 總砷含量測定

表2 ICP-MS工作參數(shù)Table 2 Working parameters of ICP-MS

使用1.0 μg/L Ce、Co、Li、Tl、Y的調諧液在線優(yōu)化ICP-MS各項參數(shù)，使分辨率和靈敏度等各項儀器性能達到最佳?？偵楹繙y定時采用1.0 μg/mL89Y溶液在線加入內標，用于校正儀器響應信號強度的變化。優(yōu)化后ICPMS的主要參數(shù)見表2。將砷元素標準曲線系列溶液從低濃度到高濃度依次于ICP-MS中進樣，測定相應的信號值。以標準溶液質量濃度為橫坐標、信號強度（CPS計數(shù)）為縱坐標繪制標準曲線，外標法定量，測定4 種海蟹及其不同部位中總砷含量。

1.3.3.2 砷形態(tài)測定

色譜條件：Dionex IonPac As19陰離子交換柱（250 mm×4 mm，10 μm）及保護柱（50 mm×4 mm）；進樣量50 μL；樣品室溫度10 ℃，柱溫40 ℃；流動相為50 mmol/L、pH 9.5的(NH4)2CO3溶液；等度洗脫；流速1.0 mL/min。

質譜條件：瞬時信號采集模式，其他參數(shù)見表2所示。

1.4 數(shù)據統(tǒng)計與分析

采用Origin 9.1和Excel 2007軟件對數(shù)據進行處理并作圖，實驗數(shù)據取平行實驗的均值。

2 結果與分析

2.1 總砷含量測定

選用GBW10050紫菜粉和GBW10023扇貝粉作為質控樣品進行總砷測定的結果質量控制，質控樣標準值、測定值和相對標準偏差見表3。結果顯示2 種質控樣品的總砷測定值都在標準值范圍內，說明采用的ICP-MS測定方法準確度高、精密度好。

表4為4 種海蟹及其不同組織中總砷含量的測定結果：從平均值進行比較，除蟹腮、殼后的整蟹中總砷測定值依次為細點圓趾蟹（4.75 mg/kg）＜青蟹（6.18 mg/kg）＜三疣梭子蟹（10.52 mg/kg）＜日本鱘（16.80 mg/kg）；同一品種的海蟹分組織部位來看，總砷含量均值基本都呈現(xiàn)出性腺（雌）＞肝胰腺＞蟹胸肌肉＞蟹鉗肉＞蟹鰓的變化趨勢。后續(xù)進一步對來自同一個樣品的分部位總砷測定值進行分析，也呈現(xiàn)出同樣的規(guī)律。結果表明海蟹是高富集砷海洋生物，性腺和肝胰腺是海蟹富集砷的主要部位。我國國家標準規(guī)定水產動物及其制品（魚類及制品除外）無機砷含量小于0.5 mg/kg[26]，158 個海蟹總砷含量為0.37～35.81 mg/kg，因此有必要對海蟹中砷進行形態(tài)分析。

表4 4 種海蟹及其組織中總砷含量的測定Table 4 Determination of total arsenic in four sea crabs

2.2 海蟹中砷形態(tài)測定條件優(yōu)化

2.2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1.1 色譜柱的選擇

分別采用Waters SpherisorbSAX色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Hamilton PRP-X100陰離子交換柱（250 mm×4.1 mm，10 μm）和Dionex IonPac As19陰離子交換柱（250 mm×4 mm，10 μm）對20 μg/L的6 種砷化合物的混合標準溶液進行分離。在嘗試多種流動相組成和梯度洗脫程序下，結果發(fā)現(xiàn)：Waters SpherisorbSAX色譜柱分離出現(xiàn)干擾峰多且目標物響應值均較低（圖1A）；使用Hamilton色譜柱進行分離發(fā)現(xiàn)，AsB和As（III）不能很好分離（圖1B）；Dionex IonPac As19對AsC和AsB不能達到基線分離（圖1C）。3 種色譜柱都很難實現(xiàn)6 種砷形態(tài)物的色譜峰完全分離。已有較多的文獻表明水產品中砷元素多以AsB存在和少量的無機砷存在，AsC基本未檢出，并且因無機砷毒性最強，As（III）、As（V）是水產品中必檢參數(shù)，因此水產品砷元素形態(tài)分析檢測中必須實現(xiàn)AsB和無機砷的分離。因此最終選擇AsB、MMA、DMA、As（III）、As（V）這5 種砷形態(tài)為研究對象，采用Dionex IonPac As19色譜柱在6 min內將5 種砷形態(tài)完全分開（圖2），且峰形尖銳，響應值高，用時短且分離效果好。

圖1 不同色譜柱分離6 種砷形態(tài)色譜圖Fig. 1 Chromatograms of six arsenic species on different columns

圖2 Dionex IonPac As19色譜柱分離5 種砷形態(tài)色譜圖Fig. 2 Chromatograms of five arsenic species on Dionex IonPac As19 column

2.2.1.2 流動相的選擇

在選定的Dionex IonPac As19色譜柱下，實驗對比表5中常用的5 種流動相對5 種砷形態(tài)的洗脫效果。結果顯示，序號4中流動相為pH 6.0的25 mmol/L NH4H2PO4溶液時，AsB不能得到有效洗脫，且和DMA不能完全分離；序號1、2、3、5洗脫條件下，5 種不同砷形態(tài)化合物均能洗脫分離，但序號2條件下，分離效果最好，且使用等度洗脫條件，可以減少梯度洗脫需要的柱平衡時間，提高分析速度，6 min內5 種砷形態(tài)化合物全部洗脫且完全分離（圖2）。通過單標定性，5 種不同化合物洗脫順序依次為AsB、DMA、As（III）、MMA、As（V）。

表5 洗脫條件的選擇Table 5 Gradient elution program of mobile phase

2.2.1.3 樣品提取劑的選擇

目前，常見的樣品中砷形態(tài)提取劑有水、甲醇-水（1∶1，V/V）、0.15 mol/L硝酸溶液、20 mmol/L乙酸銨溶液等。水作為提取劑時一般對基質簡單的樣品進行提取，如大米等。甲醇-水為提取劑時，能夠較好避免形態(tài)間的轉化，使化合物保持自身形態(tài)[27-28]，但甲醇含量過高時會降低無機砷的提取效率和樣品測定時的靈敏度，且有機相中的碳易在ICP-MS截取錐孔處富集堆積縮短錐使用壽命和影響測定結果[3]。以HPLC-ICP-MS法測定的BCR-627金槍魚標準物質中的AsB、DMA含量與質控樣標準值的比值作為提取率來比較上述4 種溶劑的提取效果。如圖3所示，采用0.15 mol/L硝酸溶液和20 mmol/L乙酸銨溶液作為提取劑，對AsB和DMA的提取率最好，均大于70%，且0.15 mol/L硝酸溶液提取效率最佳，AsB、DMA平均提取率分別為89.7%和83%，因此選擇0.15 mol/L硝酸溶液作為海蟹樣品中砷形態(tài)測定的提取劑。

2.2.2 質譜條件的優(yōu)化

2.2.2.1 質譜檢測模式的選擇

實驗考察No Gas標準模式和He模式下，5 種砷化合物分析的響應值。結果表明在No Gas標準模式下，每種砷化合物響應均是He模式的20 倍左右，且沒有出現(xiàn)目標物干擾峰（圖4）。陳紹占等[20]在分析牛黃解毒片暴露后大鼠血清中砷形態(tài)時，也同樣對兩種模式下5 種砷形態(tài)化合物檢出限高低以及對40Ar35Cl＋、75As檢測信號的影響發(fā)現(xiàn)，標準模式下檢出限較低且標準模式下產生的干擾峰不影響5 種砷化合物的測定。因此本實驗選擇標準模式進行5 種砷形態(tài)化合物的檢測。

圖4 質譜檢測模式對砷形態(tài)物測定響應信號強度的影響Fig. 4 Effect of mass spectrometric test mode (He collision and No Gas mode) on signal response of arsenic species

2.2.2.2 補償氣流量的選擇

在使用標準模式下，進一步考察載氣流量和補償氣流量的最適值（圖5），結果表明當載氣流量為1.05 mL/min，補償氣為0 mL/min時，響應最高。陸奕娜等[29]對海產品中砷形態(tài)化合物測定時發(fā)現(xiàn)，補償氣為0 mL/min時，儀器靈敏度最佳且對雙電荷及氧化物的干擾最小，本實驗選擇不使用補償氣。

圖5 No Gas模式下Ar流速對砷形態(tài)物測定響應信號強度的影響Fig. 5 Effect of Ar velocity on signal response of arsenic species in No Gas mode

2.3 砷形態(tài)方法學驗證

2.3.1 方法檢出限及線性范圍

分別配制0、10、20、50、100、300 μg/L系列砷化合物混合標準溶液，在上述優(yōu)化后的一系列實驗條件下進行分析。結果表明在0～300 μg/L范圍內，5 種砷化物的響應色譜峰面積值與質量濃度呈良好的線性關系，相關系數(shù)均大于0.998。以實際樣品測定后計算色譜圖中各目標物的峰響應信噪比（RSN），得出各砷形態(tài)物的檢出限（RSN=3）為0.008～0.014 mg/kg，定量限（RSN=10）為0.025～0.055 mg/kg（表6）。

表6 測定曲線線性關系及方法檢出限與定量限Table 6 Calibration equations, LODs and LOQs for arsenic species

2.3.2 方法的準確度和精密度驗證

準確稱量BCR-627金槍魚組織中砷形態(tài)標準物質0.5 g，其中含AsB參考值為（3.9±0.225）mg/kg，DMA含量參考值為（0.15±0.022 5）mg/kg。按照本實驗方法進行的6 次平行測定結果為：AsB含量范圍為3.794～4.056 mg/kg，DMA測定值范圍為0.132 8～0.167 4 mg/kg，相對標準偏差分別為4.2%和4.6%，均在參考值范圍內。同時采用加標回收率實驗進一步驗證本方法的準確度和精密度。準確稱取青蟹肌肉樣品18 份，分別添加3 種不同質量濃度的AsB、DMA、MMA、As（III）、As（V）5 種砷化合物混合標準溶液，使得樣品添加量分別為0.40、1.00、2.00 mg/kg，每個梯度下設置6 個平行實驗，進行加標回收實驗，計算添加回收率和相對標準偏差，同時做樣品本底值測定。如表7所示，在高、中、低3 個加標水平下，5 種不同砷形態(tài)物加標回收率在70.0%～105.0%之間，相對標準偏差均小于5%，滿足分析檢測要求，進一步證實了本方法測定結果準確性好、精密度高。

表7 青蟹肌肉樣品中5 種砷形態(tài)物的添加回收率測定（n=6）Table 7 Spike recoveries of five arsenic species in muscle of Scylla serrata (n= 6)

2.3.3 海蟹樣品中砷形態(tài)分析

圖6 青蟹肌肉中5 種砷化合物色譜圖Fig. 6 Chromatograms of five arsenic species in muscle of S. serrata

表8 4 種海蟹及其組織中砷化合物測定結果Table 8 Average concentrations of total arsenic and arsenic species in whole sea crabs and their tissues

運用HPLC-ICP-MS法測定4 種海蟹（青蟹、細點圓趾蟹、三疣梭子蟹和日本鱘）158 個樣品及其不同組織部位中砷形態(tài)分布特征。測定色譜圖及數(shù)據結果分別見圖6和表8所示，4 種海蟹樣品測定色譜圖類似，均以AsB含量最高，其次是DMA和MMA，As（III）和As（V）僅在少量樣品有檢出；整蟹（除腮、殼后）及其不同部位樣品中AsB占總砷含量的60.9%～99.4%，4 種海蟹AsB平均含量值依次為細點圓趾蟹＜青蟹＜三疣梭子蟹＜日本鱘，同一品種的海蟹中AsB平均含量值性腺（雌）＞肝胰腺＞蟹胸肌肉＞蟹鉗肉＞蟹鰓，呈現(xiàn)的趨勢與總砷含量一致。結果表明海蟹雖作為砷高富集品種，但主要以有機砷AsB為主，無機砷含量較低，158 個海蟹樣品整蟹及分組織測定無機砷含量均值在0～0.12 mg/kg范圍內，均未超過國家食品安全標準對水產動物的無機砷限值（0.5 mg/kg）要求。AsB其結構類似甜菜堿，LD50大于10 000 mg/kg，被視為無毒的有機砷形態(tài)[5,30]，在人體內不能進行代謝，直接被排出體外，通常認為不會危及人體健康[6,31]，因此海蟹雖然作為砷元素高富集生物，但無機砷含量較低，食用海蟹帶來的無機砷健康風險較低。

3 結 論

采用優(yōu)化后的ICP-MS法和HPLC-ICP-MS法分別測定了青蟹、三疣梭子蟹、日本鱘和細點圓趾蟹4 種常見海蟹中總砷及砷形態(tài)物分布特征。結果顯示海蟹是砷高富集水產品，158 個蟹類樣品中總砷含量范圍為0.37～35.81 mg/kg；整蟹及分組織進行砷形態(tài)物測定數(shù)據表明海蟹體內以毒性較低的AsB為主，AsB占其總砷含量的60.9%～99.4%，158 個海蟹樣品無機砷含量均值在0～0.12 mg/kg；從分品種及同一品種下分組織部位的測定結果來看，總砷含量和AsB的測定均值基本都呈現(xiàn)出品種上細點圓趾蟹＜青蟹＜三疣梭子蟹＜日本鱘、同一品種樣品下性腺（雌）＞肝胰腺＞蟹胸肌肉＞蟹鉗肉＞蟹鰓的變化趨勢，說明日本鱘富集砷能力較強，性腺和肝胰腺是海蟹富集砷的重要器官。由于無機砷含量較低，均在國家標準對水產品中無機砷的規(guī)定限量值以下，因此食用海蟹帶來的砷健康危害風險較低。