黃漿水酯化液工藝優(yōu)化及關鍵風味物質分析

楊銘，李亞男，陳正行*，李娟，李永富，王莉，王韌，羅小虎，李誠

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122) 2(糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

黃漿水是白酒固態(tài)發(fā)酵過程中沉積在窖池底部的黏稠液體，含有豐富的有機酸、酯類、醇、醛等酒類風味物質。但重鉻酸鹽指數(shù)(dichromate oxidizability, CODCr)較高(40 000～150 000 mg/L)，遠超國家廢水排放標準(1 000 mg/L，GB 8978—1996)，通常被各大酒廠降解處理后排放，潛在資源沒有得到有效利用。

傳統(tǒng)方式對黃漿水的利用主要在于將黃漿水拌糟回窯進行再次發(fā)酵或加拌優(yōu)質黃泥進行養(yǎng)窖護窖[1]；直接把黃漿水加入蒸酒所用的鍋底水中進行“串蒸”等[2-3]。這些方式改善了白酒香氣，但實驗結果大多流于經驗。20世紀90年代開始，研究者開始著眼于酯化黃漿水中的有機酸增加香味物質，將酯化液用于“串香”，能更好地提高白酒品質[4]。21世紀開始，黃漿水逐漸用于其他新產品開發(fā)：張立強等[5]用食用酒精和黃漿水，采用液態(tài)發(fā)酵法釀制白醋；梁艷玲等[6]用樹脂從黃漿水中提取乳酸；王永偉等[7]采用生物轉化、多菌種協(xié)同發(fā)酵等手段制取黃漿水醋飲；唐心強等[8]利用共沸蒸餾從黃漿水中獲取白酒調味品；李安軍等[9]利用超臨界CO2萃取技術提取黃水中的風味物質。

在所有針對黃漿水的研究中，有機酸的酯化利用一直是研究的重點。黃漿水來源于白酒，含有不可人為復制的天然香精，使它對于白酒更具價值。劉賓等[10]在黃漿水和酒尾中添加己酸和酯化酶進行正交實驗，確定最優(yōu)酯化條件為：乙醇含量10%、己酸添加量1.5%、酯化酶用量7%、溫度30 ℃酯化7 d，在此條件下，總酯質量濃度最高可達近5 g/L。但沒有對酯化時間進行單一因素實驗，也沒有對風味物質進行全面分析；馬榮山等[11]采用化學酯化法，對黃漿水和酒尾添加正己酸和乙酸，通過提高酸度促進酯類物質的生成，在最優(yōu)條件下，總酯質量濃度達到2.3 g/L較對照組1.5 g/L有所提高。但酯化效果遠不如添加其他催化劑；與此類似，鎮(zhèn)達采用732#H+交換樹脂促進有機酸和乙醇的反應，在乙醇絕對超量(乙醇/黃漿水體積比為6∶4)的情況下，己酸乙酯效果最為顯著，含量提高了7.5倍。

陳帥等[12]比較了1種紅曲霉菌株和2種產酯酵母的酯化特性，前者較后兩者酯化力更強，且酯化產物的結構輪廓與白酒類似；XIA等[13]比較了兩種華根霉、一種紅曲霉和一種米根霉的酶制劑對黃漿水的酯化特性，結果表明紅曲酶制劑在乙醇含量10%，pH 3.5 的條件下酯化效果最好，使總酯質量濃度由4.86 g/L增加到了7.31 g/L。大量結果表明紅曲在生物酯化方面具有較高的應用價值[14-17]。

縱觀前人對黃漿水酯化技術的研究，采用生物技術[18]比采用化學手段有更好的效果。本實驗旨在對這一結論進行驗證。選取較好的催化劑進行條件優(yōu)化，并對酯化前后的樣品進行氣-質聯(lián)用分析，與洋河濃香型白酒進行比對。生物酯化法中，紅曲粗酶是比較理想的酯化酶；而化學手段中不管是添加有機酸還是樹脂，都是引入H+從而促進酯化反應。考慮到引入更多的有機酸違背有機酸回收利用的初衷，而酒尾中含有更多的雜環(huán)醇會降低產品品質，因此選取富含紅曲粗酶的紅曲粉和H+交換樹脂為催化劑，對黃漿水和乙醇(不添加酒尾)進行酯化實驗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃漿水：江蘇洋河酒廠(濃香型)，已預先經過離心處理去掉大部分固形物；52°天之藍白酒：江蘇洋河酒廠；紅曲粉：武漢佳成生物制品有限公司，酒用酯化紅曲粉，平均酯化力(46±5) mg/(g·100h)；732# H+交換樹脂：國藥滬試化學試劑有限公司；無水乙醇：分析純，國藥沃凱；2-辛醇、乙酸香葉酯、特戊酸、2-乙基己醇:色譜純，Sigma公司。

1.2 儀器與設備

50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭,美國Supelco公司；SCION SQ-456-GC氣-質聯(lián)用儀,美國布魯克公司；DB-Wax 60 m×0.25 mm×0. 25 μm氣相色譜柱，美國Agilent公司；超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 酯化試驗方法

取200 mL黃漿水于500 mL錐形瓶中，分別加入無水乙醇(0、10、20、30、40 mL)，紅曲粉(0、5、10、15、20、25 g)或H+交換樹脂(0、2.5、5、7.5、10、12.5 g)，氣浴搖床振蕩30 min后放入恒溫培養(yǎng)箱(25、31、37 ℃) 酯化一定的天數(shù)(7、14、21、28、35 d)，對酯化液的總酯含量進行測定。

分別設定無水乙醇30 mL，紅曲粉 20 g，酯化溫度31 ℃，酯化時間14 d為固定因素，進行單一因素實驗。

1.4 總酸、總酯測定

結合文獻[19]與《GBT 10345—2007 白酒分析方法》改進總酸總酯的測定方法如下(聯(lián)合滴定-電位法)：

待測液制備:準確量取黃漿水試樣5.00 mL(準確至 0.01 mL)，用去離子水稀釋并定容至250 mL，搖勻備用。

轉移待測液50 mL到250 mL圓底燒瓶中，加入攪拌子，插入pH計電極，以NaOH標準滴定液滴至pH=8.2。上述溶液準確加入NaOH標準滴定液25 mL (若總酯較高，可加入50 mL)，放入玻璃珠，裝上冷凝管，于沸水浴上加熱回流30 min。取下冷卻后以H2SO4標準滴定液滴至pH=9.0，減慢滴定速度，每次半滴，直至pH=8.7。同時吸取乙醇(無酯)溶液50 mL，按上述方法做空白對照試驗所得結果均保留至兩位小數(shù)。

實驗結果按公式(1)計算：

(1)

式中:X1，總酸，以己酸計，g/L；c，NaOH標準滴定液濃度，mol/L；V1，消耗NaOH標準滴定溶液的體積，mL；5，稀釋倍數(shù)；5.00，量取黃漿水的體積，mL； 116.16，己酸摩爾質量，g/mol。

(2)

式中:X2，總酯，以己酸乙酯計，g/L；c，H2SO4標準滴定溶液的濃度，mol/L；V0，空白試樣消耗H2SO4標準滴定溶液的體積，mL；V2，樣品消耗H2SO4標準滴定溶液的體積，mL；5，稀釋倍數(shù)；5.00，量取黃漿水的體積,mL；144.21，己酸乙酯摩爾質量，g/mol；

1.5 頂空-固相微萃取和GC-MS方法

頂空-固相微萃取方法：在20 mL頂空瓶中加入8 mL待測酯化液或稀釋10倍的天之藍白酒，3 g NaCl，20 μL內標溶液(mg/L): 2-辛醇41.00，乙酸香葉酯45.89，特戊酸44.34，2-乙基己醇41.55(以上均為最終濃度)，50 ℃預熱5 min，以固相微萃取頭進行吸附萃取，保溫30 min，進GC-MS進行分析，解吸5 min。

GC-MS方法：使用DB-Wax毛細管色譜柱對樣品進行分離。GC升溫程序：50 ℃保持2 min，以5 ℃/min 的速度升溫至90 ℃，保持0 min，再以10 ℃/min 的速度升溫至230 ℃,保持7 min；進樣口溫度 250 ℃，載氣He，流速2 mL/min，進樣量1 μL，不分流進樣。MS條件：EI，電離能量 70 eV，燈絲電流設定值 120 μA；離子源溫度200 ℃。掃描方式：Scan，掃描范圍50～550 u。

2 結果與分析

2.1 黃漿水理化成分分析和主要風味化合物

不同產地、不同香型、不同酒廠所產生的黃漿水理化成分差異極大，該文對洋河酒廠所提供的黃漿水原料進行了基礎的理化檢測，結果如表1。洋河濃香型黃漿水pH值為2～4，符合黃漿水的一般特性；其蛋白質和總酯質量濃度較低，而總酸質量濃度高達52～56 g/L，較同類樣品稍高；此外，黃漿水中總糖質量濃度較高，這是造成樣品黏度較高的主要原因。含量豐富的有機酸為我們酯化黃漿水以提高總酯水平提供了前提。

表1 洋河濃香型黃漿水基本理化性質Table 1 Basic physical and chemical properties of Yanghe yellow water

注：表中“%”均表示質量分數(shù)。

由表2可知，洋河濃香型白酒黃漿水中的揮發(fā)性成分主要為有機酸，其濃度遠遠高于醇、醛、酯等其他成分。

表2 洋河酒黃漿水風味化合物質量濃度Table 2 Concentration of flavor compound in Yanghe yellow water

續(xù)表2

化合物 質量濃度/(mg·L-1)有機酸己酸3 942.11辛酸1 520.03丁酸1 206.26庚酸628.64丙二酸530.17乙酸266.69正戊酸155.95二甲基丙二酸46.545-甲基己酸33.132-甲基丁酸30.40丙酸24.68異己酸23.84甲酸5.48有機酸總計8 413.92醇類化合物正己醇0.596異戊醇0.398苯乙醇0.187丁醇0.099正辛醇0.084正庚醇0.055桉葉油醇0.0282-庚醇0.0271-戊醇0.025異丁醇0.0222-戊醇0.0151-壬醇0.010合金歡醇0.0062-戊醇0.006醇類總計1.730醛類乙醛0.0662-甲基丁醛0.0233-甲基丁醛0.133糠醛0.446苯甲醛0.1902,4-二甲基苯甲醛0.036醛類總計0.895酚類2,4-二叔丁基苯酚0.8804-甲基愈創(chuàng)木酚0.331鄰甲酚0.3024-乙基-2-甲氧基苯酚0.103對乙基苯酚0.0712,6-二叔丁基-4-乙基苯酚0.008酚類總計1.695

有機酸主要以己酸質量濃度最高，乙酯化產物己酸乙酯恰恰與濃香型白酒的特征風味物質相符。含量其次高的有機酸為丁酸，接下來是一些長鏈有機酸，如戊酸、庚酸、辛酸等，其相應的酯化物：丁酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯皆是洋河綿柔型白酒的重要風味成分；除了有機酸類，黃漿水中還含有與濃香型白酒風味息息相關的酯類物質。這些酯類物質種類豐富、濃度較低，含量最高的己酸乙酯，其質量濃度也僅僅只有4.141 mg/L。黃漿水中的酯類物質主要是乙酯類，除此之外還有少量甲酯、丙酯等。黃漿水中2-甲基丁酸的質量濃度為30.40 mg/L，其相應的乙酯化物2-甲基丁酸乙酯是洋河天之藍白酒除己酸乙酯外較重要風味物質。由于該酯化物閾值很低(0.2 μg/L)，所以少量即產生明顯風味。

2.2 黃漿水酯化單一因素實驗

羧酸跟醇的反應是可逆的，一般情況下反應極其緩慢，達到平衡的時間也較為漫長。此反應是SN2反應，即兩反應物分子先結合，再進行化學鍵的斷裂，脫去雜原子基團。如圖1，羧酸上的羰基碳在質子酸的作用下更易缺電子，從而被親核試劑醇攻擊，兩者加合形成新的離子基團；新的離子基團脫去水，從而形成酯。當質子酸不存在時，羧酸和醇很難發(fā)生加成反應，因此步驟②是酯化反應的控制步驟；而步驟④是逆反應水解反應的控制步驟。通過此反應機理可知，提高酯得率的關鍵在于提供質子酸H+和脫去反應產物H2O。

圖1 酯化反應機理Fig.1 Esterification mechanism

濃H2SO4兼具提供質子酸H+和脫去反應產物H2O兩種作用，因此通常被用作工業(yè)生產酯類物質的催化劑。

但黃漿水體系中80%以上都是水，加入濃H2SO4不僅成本大而且難度高；且濃H2SO4作為高?；ぎa品，按照規(guī)定不允許在食品體系添加?？紤]到食品安全性和產品認可度，應盡量選取安全可靠的催化劑。

2.2.1 催化劑的種類和添加量對酯化反應的影響

紅曲酯化酶是天然酯化劑，紅曲則是天然紅色素，長期應用于餐飲行業(yè)和食品加工業(yè)中(玫瑰燒肉、豆腐乳)，更具有健脾消食，活血化瘀的保健功效。張丹等[2]將紅曲霉菌和酵母菌混合培養(yǎng)制成生物制劑用于黃漿水酯化，使得黃漿水中的主要風味酯類均有大幅上升；張立強等[20]探究了麩皮紅曲的培養(yǎng)方法及最佳酯化條件，并表明在麩皮中加入黃水可以有效地提高麩皮紅曲的酯化力；陳帥等[21]基于響應面優(yōu)化了紅曲酶促酯化黃漿水的條件，最佳條件下總酯提高了8倍以上。為了驗證生物法和無機法對黃漿水中有機酸的酯化效果，我們分別采用酒用酯化紅曲粉和H+交換樹脂作為催化劑，對黃漿水/乙醇混合液進行了單一因素實驗。

圖2表示紅曲粉加入5 g時，總酯質量濃度由1.6 g/L快速增加至3.9 g/L；加入5～15 g的紅曲粉，總酯含量增加的幅度變??；進一步添加紅曲粉，總酯增加的趨勢減緩，已經沒有顯著差異。實驗表明，紅曲粉添加至20 g既可滿足酯化反應對催化劑的需求，該實驗條件下，總酯質量濃度提高至5.5 g/L。

圖2 紅曲添加量對酯化液總酯的影響Fig.2 Effect of Monascus powder addition on total ester concentration注：圖中不同小寫字母表示差異顯著。下同。

圖3表明加入H+交換樹脂能夠一定程度上促進酯化反應，加入2.5 g樹脂時總酯質量濃度提高到近4 g/L。 但繼續(xù)添加樹脂并不能進一步促進酯化，加入7.5 g乃至更多的樹脂反而使總酯有輕微的下降趨勢。H+交換樹脂的加入提供了質子酸，在一定程度上促進了酯化反應正向進行，但樹脂并不是越多越好。綜上所述，紅曲粉酯化力優(yōu)于H+交換樹脂，因此選擇紅曲粉作為催化劑。

圖3 氫離子交換樹脂對酯化液總酯的影響Fig.3 Effect of ion exchange resin on total ester concentration

2.2.2 乙醇添加量對酯化反應的影響

乙醇添加量對酯化液總酯的影響如圖4所示。隨著乙醇濃度的提升，總酯質量濃度不斷增加，添加量達到30 mL 后，過量的乙醇無法促進產生更多的酯類。乙醇是酯化反應的底物，其濃度高低直接影響正向反應速率。適量的乙醇對反應有促進作用，但是過多的乙醇不僅會使紅曲粉中的酯化酶變性失活，而且會沖淡黃漿水中有機酸濃度，減慢反應速率。從圖中可以看出，乙醇添加量在30 mL時達到臨界值，再增加濃度無法提高總酯質量濃度，反而會阻礙反應的進行。

圖4 乙醇添加量對酯化液總酯的影響Fig.4 Effect of the amount of added ethanol on the total ester concentration

2.2.3 反應時間對酯化反應的影響

圖5反映了總酯和酯化時間的關系，結果表明，隨著酯化反應的進行總酯質量濃度不斷升高，酯化4周后，總酯含量增長緩慢，繼續(xù)延長酯化時間，總酯質量濃度增加沒有顯著性差異。實驗進一步表明，黃漿水體系中的酯化反應是緩慢的可逆反應，在酯化階段后期反應逐漸趨于平衡。為了節(jié)省時間成本、取得最大收益，選取酯化時間28 d較為適宜。

圖5 反應時間對酯化液總酯的影響Fig.5 Effect of reaction time on total ester concentration

2.2.4 反應溫度對酯化反應的影響

紅曲活性最佳溫度為30～32 ℃，在(31±6)℃進行酯化試驗，如圖6所示。

圖6 反應溫度對酯化液總酯的影響Fig.6 Effect of the amount of added ethanol on the total ester concentration

當酯化溫度為31 ℃時，總酯質量濃度達到最高，故選取酯化溫度為31 ℃。

使用SPSS對以上4因素進行方差分析，紅曲粉添加量、乙醇添加量、反應時間這3個因子對總酯都有非常顯著的影響(**,P<0.01)，而反應溫度對總酯具有顯著影響(*，0.01

2.3 黃漿水酯化正交實驗

表3是4因素混合水平正交表，表4是正交實驗方案和16組實驗數(shù)據(jù)，并對其進行了直觀分析。

表3 正交實驗因素水平表Table 3 Orthogonal test design table

表4 正交試驗方案及實驗結果分析Table 4 The results of orthogonal test and data analysis

在A、B、C、D4個因素中，極差R最大的是C列，即酯化時間。這說明該酯化時間的改變對實驗結果的影響最大，是最主要的因素。其次主要的因素依次是乙醇含量、反應溫度和紅曲粉含量?？樟械臉O差值最小但接近A列的極差值，這說明上述各因素之間存在的交互作用并不顯著。表4表明，在試驗范圍內最佳的試驗方案為A3B3C4D2即：紅曲粉 20 g (8% 質量分數(shù))、乙醇 30 mL (13%體積分數(shù))、酯化時間 35 d、反應溫度31 ℃。

結合2.2.3以時間為單一變量的試驗結果，在其他條件一致的狀況下，最佳方案A3B3C4D2和方案A3B3C3D2的總酯質量濃度沒有顯著性差異。考慮到時間成本，應選擇方案A3B3C3D2即：紅曲粉 20 g (8%質量分數(shù))、乙醇 30 mL (13%體積分數(shù))、酯化時間28 d、反應溫度31 ℃為最優(yōu)工藝。

2.4 風味成分分析及與香氣輪廓對比

對優(yōu)選方案(紅曲粉20 g、乙醇30 mL、酯化時間28 d、反應溫度31 ℃)酯化液及洋河天之藍白酒的風味物質進行定性及定量分析，風味化合物的閾值和質量濃度列于表5和表6。

表5 天之藍白酒主要風味物質閾值及香氣特征Table 5 The threshold and aroma characteristics of main flavor substances in Tianzhilan liquor

對比表2和表5可知，己酸乙酯質量濃度由酯化前的4.14 mg/L增加到220.64 mg/L；丁酸乙酯由0.532 mg/L 增長到17.39 mg/L；戊酸乙酯由0.438 mg/L增長到4.76 mg/L；2-甲基丁酸乙酯由0.003 mg/L增長到0.31 mg/L；儀器可檢出的總酯由8.30 mg/L增長到428.4 mg/L。酯化后主要風味酯類全部提高了10倍以上。有機酸的濃度有所減少，但依舊保持較高水平。

表6 酯化液風味化合物質量濃度Table 6 Concentration of flavor compound in esterification liquid of yellow water

續(xù)表6

化合物 質量濃度/(mg·L-1)異戊醇0.19醇類總計112 378.1醛類異戊醛1.430壬醛0.183辛醛0.046癸醛0.033己醛0.011壬烯醛0.006醛類總計1.708酚類2,4-二叔丁基苯酚0.1204-甲基苯酚1.1654-乙基-2-甲氧基苯酚0.200苯酚0.3362,6-二叔丁基對甲酚1.0984-甲基愈創(chuàng)木酚0.331酚類總計3.025

圖7和圖8反映酯化液和天之藍白酒中的風味成分有諸多相似之處。

圖7 酯化液揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.7 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in the esterified liquor

圖8 洋河天之藍白酒(10倍稀釋)揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.8 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in the Yanghe Tianzhilan liquor (10 times dilution)

白酒中可檢出的風味成分在酯化液圖譜相應位置均有出峰。白酒中最顯著的風味成分是己酸乙酯，該化合物同時是酯化液中含量最多的風味酯類。其他對白酒風味有較大貢獻的酯類如：乙酸乙酯、乳酸乙酯、戊酸乙酯、丁酸乙酯和2-甲基丁酸乙酯等在酯化液中均有檢出，且峰面積的相對大小與白酒較為相似；有機酸方面，酯化液中的己酸含量依然有較高水平，其次是辛酸、庚酸和丁酸，相對大小與洋河天之藍白酒相一致。

由表6和表7可知，酯化液中酯類物質種類與白酒重合度較高，與上述結論一致。

表7 天之藍白酒風味化合物質量濃度Table 7 Concentration of flavor compound in Tianzhilan liquor

續(xù)表7

化合物 質量濃度/(mg·L-1)正戊酸4.71丁酸4.27乙酰丙酸4.17有機酸總計1 593.17醛酮類乙醛4.122-甲基丁醛1.10異戊醛4.99己醛2.85壬醛0.77苯甲醛9.862,4-二甲基苯甲醛2.964-甲基-2-己酮0.811-壬酮1.08苯乙酮1.08苯乙酮1.08醛酮類總計29.63醇類2-丁醇0.431-丙醇1.32異丁醇1.083-甲基-2-丁醇0.46丁醇1.98異戊醇10.12正己醇11.032-乙基-4-甲基戊醇0.31辛醇0.21正辛醇0.89醇類總計29.30

但各酯類化合物質量濃度較白酒普遍偏低，這與酯化液中含水量仍舊較高有關，后續(xù)應用應對酯化液進行除水和濃縮。酯化液中己酸濃度是白酒中的2倍，這較黃漿水中的己酸已經大大減少，酯化液中的其他有機酸類也較白酒稍高。

由于各風味化合物的香氣閾值不同，因此僅通過質量濃度不能反映香氣輪廓[22]。綜合各方面對濃香型白酒的研究[23-26]，挑選出對酒體香氣貢獻較大的16種主要風味物質，它們的閾值及香氣特征羅列在表5中。

圖9反映的是16種主要風味物質香氣活力值(OAV，質量濃度與閾值之比[27])的對數(shù)雷達圖[13]，其中低于0的數(shù)值代表該化合物濃度低于人體感官閾值。從圖中可以看出，黃漿水、酯化液和白酒在有機酸產生的風味上輪廓較為相近，這是由于各類有機酸的閾值普遍較大。三者的主要差別在酯類風味一側，酯化液和白酒的輪廓較為接近，但面積小于白酒；黃漿水在酯類一側的輪廓面積遠遠小于兩者。這說明酯化對黃漿水的香氣輪廓產生了顯著的影響，為黃漿水在白酒中的應用增加了有益風味成分。

圖9 主要風味物質OAV對數(shù)雷達圖Fig.9 OAV logarithmic radar chart of main flavor substances

3 結論

通過對黃漿水進行理化分析和風味物質定量檢測，進一步確定了黃漿水的潛在利用價值和酯化提高重要風味物質的可行性。通過單一因素實驗明確了催化劑用量、乙醇添加量、酯化時間、酯化溫度對于酯化反應的影響規(guī)律，并通過正交實驗確定了洋河酒黃漿水的推薦酯化條件為：紅曲粉8% (質量分數(shù))、乙醇 13% (體積分數(shù))、酯化時間 28 d、反應溫度31 ℃。最后對酯化液進行GC-MS分析，發(fā)現(xiàn)酯化后關鍵風味物質酯類的濃度提高了10倍以上，風味物質種類豐富能與目標白酒相符，但總體酯化率還有待提升。另外，尋找更好地縮短酯化周期的且兼顧食品安全性的高效催化劑，也是后續(xù)研究的重點之一。