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    QuEChERS前處理結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 同時測定酵母產(chǎn)品中4種抗氧化劑和5種防腐劑

    2019-07-04 03:32:40李艷美李芳粟有志周均羅瓊王靜文王興磊
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2019年12期
    關(guān)鍵詞:酯類苯甲酸防腐劑

    李艷美,李芳,,粟有志,,周均,,羅瓊,王靜文,王興磊*

    1(伊犁師范大學,污染物化學與環(huán)境治理重點實驗室,新疆 伊寧,835000) 2(伊寧海關(guān)技術(shù)中心,新疆 伊寧,835000)

    酵母產(chǎn)品是指酵母菌以糖類、糧食為原料,添加需要的營養(yǎng)素,利用相關(guān)生物技術(shù)和發(fā)酵工藝,獲得營養(yǎng)豐富的酵母制品或酵母衍生制品,廣泛應用于食品、保健品、生物制藥、釀造發(fā)酵、生物化工、石油及農(nóng)畜牧業(yè)等領(lǐng)域[1]。為提高酵母產(chǎn)品穩(wěn)定性,在生產(chǎn)工藝中加入抗氧化劑和防腐劑[2]。

    食品用防腐劑和抗氧化劑可以分為復合型、天然及化學合成[3],也可根據(jù)其起源和化學結(jié)構(gòu)進行分類。化學合成抗氧化劑和防腐劑使用簡單有效而應用廣泛[4]。但其對人體心肝脾胃腎等臟器產(chǎn)生一定的危害[5],歐盟等大多數(shù)國家的法規(guī)中都對其有嚴格的限量。中國GB 2760—2014也規(guī)定了最大使用限量。

    檢測防腐劑和抗氧化劑的儀器方法有示波極譜法[6]、紫外分光光度法[7]、膠束電動色譜法[8]、薄層色譜法[9]、離子色譜[10]、毛細管電泳技術(shù)[11]、流動注射化學發(fā)光法[12]、紅外光譜法、比值導數(shù)波譜法[13]等,以上檢測方法只適用于特定的樣品基質(zhì),且可檢測的防腐劑、抗氧化劑的品種有限。大部分防腐劑和抗氧化劑均是極性化合物到中等極性化合物,常用的檢測方法為液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)[14-15]、氣相色譜(gas chromatography,GC)[16-17]、氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass,GC-MS)[18-20]、液相質(zhì)譜聯(lián)用儀(liquid chromatography-mass,LC-MS)[21-23]等技術(shù)。而液相和氣相色譜法為半定性,氣相質(zhì)譜法提取時需要大量的有機溶劑;液相質(zhì)譜法檢測準確性好,靈敏度高。

    酵母產(chǎn)品基質(zhì)復雜,前處理需要有效去除基質(zhì)干擾,降低雜質(zhì)對目標化合物的影響,本文采用試劑耗材消耗少,步驟簡單、高效、安全的QuEChERS樣品前處理技術(shù)[14,24-26],結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法確證法,建立檢測酵母產(chǎn)品中4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的方法。該方法準確、可靠、快速、高效,為酵母產(chǎn)品中4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的檢測提供了實用的技術(shù)手段,對監(jiān)測酵母產(chǎn)品中添加劑的使用情況具有現(xiàn)實意義。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    1260-6460A HPLC-ESI-MS/MS高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有自動進樣器、四元泵、電噴霧離子源、色譜質(zhì)譜工作站),美國安捷倫科技公司;miIIi-Q advangtage A10超純水系統(tǒng),Millipore公司;Sigma3-18K臺式冷凍離心機,Sigma公司;ME104E電子天平(萬分之一 天平120 g/0.1 mg),梅特勒托利多公司;SK8210LHC超聲波清洗器,上海科導超聲儀器有限公司;N-EVAP-112 水浴氮吹儀,美國Organomation公司;MS3型渦旋振蕩器,德國IKA公司。

    乙腈、甲醇、丙酮、甲酸、乙醇和正己烷均為色譜純,德國MERCK公司;冰乙酸(優(yōu)級純)、乙酸銨(優(yōu)級純),成都市科龍化工試劑廠;NaCl(99.8%),天津市光復科技發(fā)展有限公司;試驗用水為Milli-Q超純水(符合GB/T 6682—2008一級水要求);酸性氧化鋁(ALA),北京振翔公司;硫酸化聚苯乙烯/二乙烯苯(PCX)、C18粉、N-丙基乙二胺(PSA)、聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)、石墨化炭黑(GCB)、氨基(-NH2),均購自天津博納艾杰爾科技有限公司;4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑標準品信息詳見表1;分析樣品為實驗室送檢和市售樣品。

    表1 四種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑標準品信息Table 1 The notice for the four antioxidants and five p-hydroxybenzoate antiseptics

    1.2 標準溶液的配制

    添加劑標準儲備溶液:準確稱取標準品10 mg(精確至0.01 mg)于10 mL容量瓶中,用甲醇超聲溶解搖勻稀釋至刻度,配成質(zhì)量濃度為1 g/L的標準儲備液??紤]稱樣量乘以純度后除以體積,配置后各添加劑的最終質(zhì)量濃度如下(mg/L):EPB 999;PP 985.05;MPB 969.03;MPB 993.60,BP 980.10;BHA 968.24;Ionox-100 985.0;HR 975.0,EQ 978.04。儲存于4 ℃冰箱中備用。

    中間混合標準溶液:根據(jù)每種添加劑在儀器上的響應靈敏度,確定其在混合標準溶液中的濃度,用水稀釋添加劑標準儲備溶液至中間混合標準溶液100 mg/L。

    1.3 樣品前處理

    稱取2 g樣品(精確至0.01 g)于50 mL具塞離心管,加入10 mL水,加入5 mL乙腈飽和的正己烷,渦旋振蕩超聲3 min。加入10 mL正己烷飽和的乙腈,2 500 r/min充分渦旋振蕩3 min,加入2 g NaCl,渦旋振蕩3 min后超聲5 min。10 000 r/min離心5 min, 取乙腈層5 mL于15 mL具塞離心管,40 ℃水浴氮吹至干后用流動相(V(10 mmol/L乙酸銨)∶V(甲醇)=1∶1)1 mL振蕩超聲溶解,加入100 mg C18后充分振蕩,8 000 r/min離心10 min。上清液過0.22 μm針頭式濾膜至進樣小瓶,供HPLC-ESI-MS/MS測定。

    1.4 LC-MS/MS條件

    色譜條件:JADE-PAK C18柱(2.1 mm×100 mm, 3 μm);柱溫:30 ℃;進樣量:10.0 μL;流速為0.2 mL/min;流動相:A相為10 mmol/L乙酸銨溶液,B相為甲醇,梯度洗脫程序如表2。

    表2 流動洗脫程序Table 2 Flow elution program

    質(zhì)譜條件:離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:防腐劑EQ正離子掃描,其他防腐劑為負離子掃描;檢測方式:多重反應監(jiān)測(MRM);霧化氣、鞘氣、碰撞氣均為高純氮氣;安裝有霧化器墊片;霧化氣壓力:275.8 kPa;干燥氣流速:10 L/min;干燥氣溫度:350 ℃; 鞘氣流速:11.0 L/min,鞘氣溫度:250 ℃;毛細管電壓:3 500 V;監(jiān)測離子對、碰撞能力、碎裂電壓等參見表3。

    表3 四種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 3 The mass parameters for the 4 antioxidants and 5 p-hydroxybenzoate antiseptics

    注:*表示定量離子。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 儀器條件的優(yōu)化

    2.1.1 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

    根據(jù)4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑本身的電離性質(zhì),配制單一標準溶液,在不接色譜柱,接入兩通的條件下,分別用正離子掃描模式和負離子掃描模式進行母離子全掃描。

    利用Mass Hunter Optimizer軟件,在MRM模式下,對4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的母離子、碎裂電壓、子離子、碰撞能量等參數(shù)進行進一步的優(yōu)化,獲得最佳的質(zhì)譜參數(shù)條件。

    4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑二級質(zhì)譜圖見圖1。

    圖1 四種抗氧化劑和5種防腐劑的二級質(zhì)譜圖Fig.1 MS-MS spectra of four antioxidants and five p-hydroxybenzoate antiseptics

    參照歐盟指令657/2002/EEC中有關(guān)規(guī)定,選擇本底干擾最小、離子豐度最高的兩個離子對作為特征離子對,其中選擇豐度比較大的離子作為定量離子,另一個信號較大的離子對作為定性離子對。4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的定量離子和定性離子對及其他質(zhì)譜分析參數(shù)詳見表3。

    2.1.2 流動相的優(yōu)化

    采用液相色譜-質(zhì)譜分析樣品時,流動相體系中有機相一般以乙腈、甲醇為主,水相中適當添加一定量的緩沖物質(zhì)。緩沖鹽溶液盡可能不要用于液相色譜-質(zhì)譜的流動相,因其會污染離子源,使質(zhì)譜靈敏度下降。本章的無機相由不同比例的甲酸水、乙酸銨水、甲酸-乙酸銨水溶液組成,有機相由乙腈和甲醇組成,研究比較不同流動相的分離效果。圖2為不同流動相下9種分析物的總體響應值比較,結(jié)果表明,甲醇-10 mmol/L乙酸銨水溶液為流動相時,各添加劑的響應值較高,通過設(shè)定梯度洗脫程序,4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑基線分離,可在15 min內(nèi)完成測試。

    圖2 不同流動相下9種分析物的總體響應值比較Fig.2 Comparison of response values of 9 analytes in different mobile phase

    2.2 前處理條件的優(yōu)化

    2.2.1 提取溶劑的選擇

    本試驗中的添加劑易溶于乙腈、甲醇、乙醇等溶劑,實驗比較7種不同的提取實驗方案來比較確定最優(yōu)提取劑,比較了甲醇、乙醇、乙腈、甲醇-乙醇(體積比5∶5)、甲醇-乙腈(體積比5∶5)、乙醇-乙腈(體積比5∶5)、正己烷飽和乙腈的提取效果。從圖3不同提取溶劑對4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的提取回收率可以看出,甲醇、乙醇、乙腈、甲醇-乙醇(體積比5∶5)、甲醇-乙腈(體積比5∶5)、乙醇-乙腈(體積比5∶5)提取時大部分防腐劑的回收率低于60%,達不到檢測要求;用純乙腈提取時,雖然提取回收率為86%~123%,但提取上機后基質(zhì)影響比較大;在提取之前先用乙腈飽和的正己烷溶解,降低溶液的黏度,再用正己烷飽和的乙腈進行提取時4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的提取回收率為89.8%~122%,回收率滿足檢測要求。

    圖3 不同提取劑下9種分析物的回收率Fig.3 Recovery of 9 analytes from different extraction agents

    2.2.2 凈化劑的選擇

    為選取實驗前處理所用最為適宜的凈化劑,本實驗比較了酸性氧化鋁(ALA)、硫酸化聚苯乙烯/二乙烯苯(PCX)、C18粉、N-丙基乙二胺(PSA)、聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)、石墨化炭黑(GCB)、氨基(-NH2)7種吸附劑對樣品的凈化效果來進行吸附實驗。實驗中PCX對EPB和PP有吸附,回收率僅為38%~55%;PSA對于Ionox-100回收率為55%左右;SPE對于大部分對羥基苯甲酸類防腐劑的回收率約為65%;-NH2做吸附劑時對EPB有吸附,Al2O3對Ionox-100和HR的回收率達不到檢測要求;PEP對4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑回收率為75%;這7種凈化劑中只有C18對4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑都不吸附,回收率為97%~108%。所以選擇C18可以作為實驗的凈化劑。酵母抽提物樣品中不同凈化劑對4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的回收率效果見圖4。

    圖4 不同凈化劑下4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的凈化回收率Fig.4 Purification and recovery rate of the four antioxidants and five p-hydroxybenzoate antiseptics under different purification agents

    2.2.3 凈化劑使用量的選擇

    凈化劑C18用量的優(yōu)化:實驗加入C18的量分別為25、50、100、150、200、300 mg。酵母產(chǎn)品中C18加入不同量時對4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的回收率效果發(fā)現(xiàn),加入量為25和50 mg時凈雜質(zhì)峰去除不明顯,當加入至100 mg時,基線明顯平穩(wěn),加入量為150、200、300 mg時與加入100 mg時吸附雜質(zhì)效果相當。最終選擇的凈化劑用量為100 mg。

    2.3 線性范圍、檢出限和定量限

    經(jīng)過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,以選擇離子監(jiān)測模式掃描進行分析測定,以防腐劑的濃度為橫坐標(x),特征碎片離子的峰面積為縱坐標(y),作線性回歸,繪制標準曲線,4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑在0.1~10 mg/L的相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.992??瞻讟悠钒凑?.2.1節(jié)方法前處理樣品,以信噪比(S/N)≥3時確定方法的檢出限(limits of detection,LOD),其范圍為0.03~0.15 mg/kg;以S/N≥10確定方法的定量限(limits of quantification,LOQ),為0.10~0.5 mg/kg。4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限詳見表4。

    表4 四種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的線性方程、檢出限和定量限Table 4 Regression equation, correlation coefficient, limits of detection, limits of quantification of four antioxidants and five p-hydroxybenzoate antiseptics

    2.4 方法的準確度和精密度

    以活性干酵母和酵母抽提物陰性樣品為空白,以1、3、10 倍LOQ為加標水平進行回收率實驗。添加了防腐劑在酵母產(chǎn)品中混合標準溶液的樣品,按照1.2節(jié)方法和儀器條件進行前處理和儀器測定,每個水平重復6次?;厥章屎拖鄬藴势钜姳??;钚愿山湍钢?種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的回收率在78.9%~108.6%,相對標準偏差4.2%~15.8%; 酵母抽提物中4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的回收率在82.9%~107.4%,相對標準偏差4.7%~14.5%,表明該方法的準確度高,通用性好。

    2.5 實際樣品測定

    應用本方法對36批活性干酵母和28份酵母抽提物中 4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑進行分析,在這些樣品中均未檢出,應用本方法能有效降低基質(zhì)干擾,加標回收率良好,滿足實際樣品分析的要求。

    表5 不同酵母產(chǎn)品中4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類 防腐劑的回收率和相對標準偏差(n=6)Table 5 Recoveries and RSDs of four antioxidants and five p-hydroxybenzoate antiseptics by standard addition method with yeast products

    續(xù)表5

    抗氧化劑加標水平/(mg·kg-1)活性干酵母酵母抽提物回收率/%RSDs/%回收率/%RSDs/%0.2092.312.388.810.3BHA0.60106.410.2105.112.42.0095.48.287.78.20.1086.49.982.95.9Ionox-1000.30103.612.198.610.51.0094.710.095.413.10.5095.214.186.89.1HR1.00101.66.390.85.05.0093.84.295.34.70.1082.58.8102.56.4EQ0.3081.511.198.37.81.0096.910.5106.65.6

    3 結(jié)論

    本章研究建立了以正己烷飽和的乙腈為提取劑,經(jīng)QuEChERS前處理,C18凈化,酵母粉和酵母抽提物中對羥基苯甲酸乙酯(EPB)、對羥基苯甲酸丙酯(PP)、對羥基苯甲酸甲酯(MPB)、對羥基苯甲酸正丁酯(BP)、叔丁基對羥基苯甲醚(BHA)、2,6-二叔丁基-4-羥甲基苯酚(Ionox-100)、4-正己基間苯二酚(HR)乙氧喹啉(EQ)共計4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法,在0.1~10 mg/L相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.992,3個加標水平(1、3、10倍定量限)下,活性干酵母中的回收率78.9%~108.6%,相對標準偏差4.2%~15.8%;酵母抽提物中的回收率82.9%~107.4%,相對標準偏差4.7%~14.5%。 該方法快速簡便、準確可靠,精密度好、回收率高,方法可以滿足實驗室高通量復酵母產(chǎn)品中4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的檢測需求??蔀榻湍府a(chǎn)品中此類物質(zhì)的檢測提供可靠的技術(shù)支持,為建立行業(yè)標準奠定基礎(chǔ)。

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