植物乳桿菌發(fā)酵蘋果汁及菌體活性保持

崔樹茂，徐長悅，毛丙永，王順余，李淵，何建新，陸圓圓，張灝*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(浙江李子園食品股份有限公司，浙江 金華，321015)

目前市場上益生菌的產(chǎn)品日益豐富，但是益生菌發(fā)酵飲品依然以發(fā)酵乳品為主。近年來，果蔬汁因含有豐富的維生素、膳食纖維、甾醇等營養(yǎng)物質(zhì)，及更清爽的口感備受消費(fèi)者喜愛。將益生菌與果蔬汁結(jié)合，研究開發(fā)益生菌發(fā)酵果蔬汁成為新的研究熱點(diǎn)，并具有廣泛的前景。高寅等[1]利用干酪乳桿菌發(fā)酵柑橘汁，并優(yōu)化工藝，得到了富含乳酸菌的發(fā)酵柑橘汁飲品。張玉慧[2]利用植物乳桿菌和干酪乳桿菌混合發(fā)酵藍(lán)莓汁，開發(fā)得到具有抗氧化、營養(yǎng)價(jià)值高、風(fēng)味濃郁的新型乳酸菌飲料。但是，目前的乳酸菌發(fā)酵果蔬汁研究依然存在以下問題：(1)發(fā)酵時(shí)間長；(2)短時(shí)間發(fā)酵乳酸菌的增殖濃度低；(3)發(fā)酵用乳酸菌菌種為普通乳酸菌，不具有明確的益生功能；(4)得到的活性乳酸菌飲品，菌體在儲(chǔ)藏期內(nèi)的活性保持較差。上述幾個(gè)因素均限制了益生菌發(fā)酵果蔬汁的產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)化，目前市場上含活性益生菌的發(fā)酵果蔬汁飲品依然是空白。

植物乳桿菌作為重要的益生菌，其來源于果蔬及自然發(fā)酵果蔬食品，利用其發(fā)酵果蔬汁更具有可行性。但是，不是所有的植物乳桿菌均具有益生功能，研究證明具有特定功效的植物乳桿菌發(fā)酵果蔬汁更具有研究和開發(fā)價(jià)值。植物乳桿菌CCFM8661被證明具有抗氧化、緩解鉛中毒等功能[3-6]，將其應(yīng)用至果蔬汁發(fā)酵開發(fā)含活性菌飲品將賦予果蔬汁新的功效。蘋果汁富含單寧、膳食纖維和VA、VC、鐵和磷等多種營養(yǎng)成分，具有增加胃腸道蠕動(dòng)、潤肺化痰、補(bǔ)充益氣等功效，且制備成本低。在益生菌發(fā)酵乳產(chǎn)品同質(zhì)化的大環(huán)境下，植物乳桿菌CCFM8661與蘋果汁的結(jié)合不僅創(chuàng)造新的口味飲品，而且活性益生菌發(fā)酵蘋果汁亦會(huì)是一種具有排鉛健康功能的發(fā)酵飲品。

但是，蘋果汁酸度高，pH低，且缺少益生菌發(fā)酵所需的生長因子，使得植物乳桿菌發(fā)酵時(shí)間長、增殖的益生菌活菌數(shù)低，植物乳桿菌在蘋果汁中的快速增殖依然是個(gè)難題。另外發(fā)酵后蘋果汁的酸度很高，pH值更低，有機(jī)酸通過酸化細(xì)胞質(zhì)，損害乳酸菌的生存能力，增加維持細(xì)胞內(nèi)pH和抑制酶促反應(yīng)所需能量的消耗[7]。因此，在發(fā)酵果汁的低酸環(huán)境中，大多數(shù)益生菌會(huì)迅速喪失活力。而益生菌產(chǎn)品需擁有足夠的活菌數(shù)(1×107CFU/mL)才可發(fā)揮保健作用，保證產(chǎn)品在貨架期內(nèi)達(dá)到一定的活菌數(shù)是極其必要的。

目前有多種方式可以提高益生菌在酸性等不利環(huán)境下的耐受性，包括菌株選擇、加工過程中適當(dāng)?shù)膲毫μ幚?、添加蛋白或纖維素等保護(hù)劑，及制備微膠囊保護(hù)性載體等[8-11]。

本文的目的是在不明顯改變蘋果汁風(fēng)味的前提下通過優(yōu)化蘋果汁營養(yǎng)組成，使植物乳桿菌能夠在蘋果汁中快速增殖，并研究不同保護(hù)劑及微膠囊化對(duì)發(fā)酵蘋果汁中的植物乳桿菌在貯藏期內(nèi)的活性保持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

植物乳桿菌CCFM 8661，江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心保藏。

1.1.2 試劑

蘋果汁，無錫橙寶食品有限公司；分離乳清蛋白(WPI90)，美國Hilmar公司；抗性糊精，羅蓋特(中國)精細(xì)化工有限公司；酵母提取物，安琪酵母股份有限公司；MRS培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；海藻酸鈉、檸檬酸鈉、K2HPO4、CaCl2等，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GRP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；MLS-3750型高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；K1100型全自動(dòng)凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司；l?ser-om806m型冰點(diǎn)滲透壓測定儀，德國l?ser公司；FE-20型pH計(jì)，梅特勒-托利多集團(tuán)；UV-2450紫外分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 植物乳桿菌種子液的制備

從保菌管內(nèi)吸取100 μL植物乳桿菌CCFM8661菌液，接種到5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下進(jìn)行活化培養(yǎng)12 h，連續(xù)活化2次，將所得菌液離心，并用生理鹽水洗滌1次后離心，得植物乳桿菌菌泥，將其重懸于離心前等體積生理鹽水作為后續(xù)發(fā)酵種子液。

1.3.2 蘋果汁理化性質(zhì)的測定

(1)pH值的測定：FE-20型酸度計(jì)直接測定；

(2)總糖含量的測定：取蘋果汁25 mL，采用斐林試劑法測定；

(3)蛋白質(zhì)含量的測定：取蘋果汁20 mL，按照K1100型全自動(dòng)凱氏定氮儀說明進(jìn)行測定；

(4)滲透壓的測定：取澄清蘋果汁100 μL，采用滲透壓測定儀直接測定。

1.3.3 植物乳桿菌在添加無機(jī)鹽蘋果汁中生長的測定

向蘋果汁中添加5 g/L K2HPO4及適量的檸檬酸鈉以調(diào)節(jié)蘋果汁pH至5.5，以不添加無機(jī)鹽蘋果汁為對(duì)照組。采用80 ℃滅菌15 min，冷卻后以體積分?jǐn)?shù)1%接入植物乳桿菌活化種子液，置于37 ℃下恒溫培養(yǎng)16 h。從發(fā)酵10 h開始，每隔2 h取樣通過平板菌落計(jì)數(shù)法測定發(fā)酵蘋果汁中植物乳桿菌活菌數(shù)量。

1.3.4 植物乳桿菌在添加營養(yǎng)因子蘋果汁中生長的測定

向蘋果汁中添加5 g/L K2HPO4、5 g/L酵母粉及適量的檸檬酸鈉以調(diào)節(jié)蘋果汁pH至5.5，以添加無機(jī)鹽但不添加營養(yǎng)因子的蘋果汁為對(duì)照組。采用80 ℃ 滅菌15 min，冷卻后以體積分?jǐn)?shù)1%接入植物乳桿菌活化種子液，置于37 ℃下恒溫培養(yǎng)16 h。從發(fā)酵10 h開始，每隔2 h取樣通過平板菌落計(jì)數(shù)法測定發(fā)酵蘋果汁中植物乳桿菌活菌數(shù)量。

1.3.5 植物乳桿菌在添加微量元素蘋果汁生長的測定

向蘋果汁中添加5 g/L K2HPO4、5 g/L酵母粉、0.05 g/L硫酸錳及適量的檸檬酸鈉以調(diào)節(jié)蘋果汁pH至5.5，以添加無機(jī)鹽、營養(yǎng)因子但不添加硫酸錳的的蘋果汁為對(duì)照組。采用80 ℃滅菌15 min，冷卻后以體積分?jǐn)?shù)1%接入植物乳桿菌活化種子液，置于37 ℃下恒溫培養(yǎng)16 h。從發(fā)酵10 h開始，每隔2 h取樣通過平板菌落計(jì)數(shù)法測定發(fā)酵蘋果汁中植物乳桿菌活菌數(shù)量。

1.3.6 植物乳桿菌在添加不同保護(hù)劑發(fā)酵蘋果汁活性保持的分析

植物乳桿菌發(fā)酵蘋果汁結(jié)束后，無菌條件下分別加入滅菌的分離乳清蛋白(whey protein isolation,WPI)溶液和抗性糊精溶液，終質(zhì)量濃度為10 g/L，以不添加保護(hù)劑發(fā)酵蘋果汁為對(duì)照，然后置于4 ℃貯藏。分別在0、3、7、1、21 d取樣通過平板菌落計(jì)數(shù)法測定植物乳桿菌在不同發(fā)酵蘋果汁貯藏期間的活菌變化。

1.3.7 植物乳桿菌微膠囊的制備

配制1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的海藻酸鈉溶液與5%的CaCl2溶液，在60 ℃條件下滅菌30 min，冷卻至室溫備用。

植物乳桿菌發(fā)酵蘋果汁結(jié)束后，在無菌環(huán)境下以8 000×g離心20 min，收集蘋果汁中植物乳桿菌菌泥，將上清發(fā)酵蘋果汁置于4 ℃冷藏待用。

將植物乳桿菌菌泥在無菌環(huán)境下按1∶1(質(zhì)量比)分別添加至無菌的100 g/L抗性糊精溶液和WPI溶液，混合均勻?；旌暇鷳乙号c無菌的1%海藻酸鈉溶液按1∶5(體積比)混合均勻，用1 mL注射器將上述混合液滴入無菌的CaCl2溶液中，制備成直徑2 mm的微膠囊。

1.3.8 植物乳桿菌微膠囊在發(fā)酵蘋果汁貯藏期菌體活性測定

將1.3.7制備的微膠囊，無菌條件下用紗布過濾，將微膠囊重新投回發(fā)酵的蘋果汁中，4 ℃低溫貯藏。分別在0、3、7、14、21 d取樣，用消毒后的高剪切均質(zhì)機(jī)剪切微膠囊至果汁內(nèi)無肉眼可見顆粒，對(duì)未做微膠囊化處理的WPI組、抗性糊精組、空白對(duì)照組進(jìn)行同樣轉(zhuǎn)速、時(shí)間的高剪切處理，然后通過平板菌落計(jì)數(shù)法測定植物乳桿菌活菌數(shù)。

1.3.9 植物乳桿菌在不同濃度保護(hù)劑制備的微膠囊內(nèi)活性保持的測定

配制100、200、300 g/L的抗性糊精溶液，按照1.3.7 的方法制備不同濃度保護(hù)劑的植物乳桿菌微膠囊，按照1.3.8的方法測定其在發(fā)酵蘋果汁貯藏期菌體活性保持。

1.3.10 植物乳桿菌在不同粒徑大小的微膠囊內(nèi)活性保持的測定

以最適保護(hù)劑濃度和海藻酸鈉濃度按照1.3.7的方法制備2和4 mm粒徑的植物乳桿菌微膠囊，按照1.3.8的方法測定其在發(fā)酵蘋果汁貯藏期菌體活性保持。

1.3.11 蘋果汁風(fēng)味物質(zhì)的測定

室溫下取5 g發(fā)酵蘋果汁樣品裝入20 mL的萃取小瓶中，同時(shí)加入1 g NaCl，采用固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)方法提取發(fā)酵蘋果汁中的風(fēng)味成分，萃取頭是涂抹厚度為85 μm的CAR/PDMS纖維，自動(dòng)進(jìn)樣器將萃取頭插入密封的萃取瓶后，于50 ℃條件下，振蕩平衡30 min；將萃取頭暴露在頂部空間5 min。

氣譜條件為：Rtx-WAX毛細(xì)管柱；柱子規(guī)格：30 m×0.25 mm×0.25 mm，進(jìn)口溫度為240 ℃，不分流，柱流速15.0 mL/min，載氣為氦氣；程序升溫：初始溫度30 ℃，保持3 min；15 ℃/min升溫至225 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件為：離子化方式EI，發(fā)射能量為70 eV，發(fā)射電流為200 μA，檢測器電壓為1.4 kV，離子源溫度240 ℃，質(zhì)荷比30～500?；衔餀z索結(jié)果與NIST和Varian兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行匹配，相似度達(dá)到80%以上確認(rèn)為目的化合物。以4 μL的0.025 g/L癸酸乙酯為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算各風(fēng)味物質(zhì)的含量。

1.3.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)中總糖的測定、總氮的測定、滲透壓的測定、pH的測定及生物量的測定均為3次生物學(xué)重復(fù)的平均值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值與標(biāo)準(zhǔn)差均采用Excel計(jì)算并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果汁的理化性質(zhì)分析

植物乳桿菌的增殖需要碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子和微量元素。因此研究植物乳桿菌CCFM8661能否發(fā)酵蘋果汁并進(jìn)行富集，首先需要綜合分析蘋果汁的營養(yǎng)組成及與菌體增殖相關(guān)的理化性質(zhì)。通過利用斐林試劑法、凱氏定氮法、冰點(diǎn)滲透壓儀、pH計(jì)分別測定了蘋果汁的總糖含量(115.52±0.5)g/L、總氮含量(0.02±0.0)g/L、滲透壓(849±12)g/L和pH值(4.01±0.1)。

蘋果汁內(nèi)含有豐富的碳源，總糖含量達(dá)到(115.52±0.5) g/L，高于培養(yǎng)乳酸菌的MRS培養(yǎng)基含糖量(20 g/L)， 故蘋果汁中總糖含量不會(huì)成為抑制植物乳桿菌發(fā)酵的因素。而蘋果汁中總氮含量為(0.02±0.0)g/L， 較低的氮含量會(huì)影響菌體的增殖，同時(shí)蘋果汁中是否含有菌體增殖的生長因子亦是未知。

滲透壓是影響植物乳桿菌生長的重要因素，前期的研究表明植物乳桿菌CCFM8661可耐受的最高滲透壓達(dá)(2 414±25) mOsm/kg[12]。蘋果汁滲透壓為(849±12) mOsm/kg，故蘋果汁滲透壓不會(huì)限制菌體發(fā)酵增殖。

眾所周知，pH值是抑制乳酸菌生長的最重要的因素。而蘋果汁的pH值僅為(4.01±0.1)，遠(yuǎn)低于植物乳桿菌生長最適pH值。因此，為提高植物乳桿菌在蘋果汁中的增殖，首先需要適當(dāng)提高發(fā)酵體系的pH值。緩沖鹽和偏堿性的無機(jī)鹽的添加可能利于發(fā)酵蘋果中植物乳桿菌的增殖，且添加的無機(jī)鹽的種類和含量應(yīng)符合添加劑國家標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 無機(jī)鹽對(duì)蘋果汁中植物乳桿菌增殖的影響

K2HPO4和檸檬酸鈉被確認(rèn)是可加入果汁的添加劑，二者的添加可提高蘋果汁的pH和緩沖能力。實(shí)驗(yàn)表明，添加5 g/L K2HPO4和7 g/L檸檬酸鈉的蘋果汁pH值達(dá)5.5。在該條件下接菌發(fā)酵蘋果汁，結(jié)果見圖1。添加無機(jī)鹽調(diào)整蘋果汁的pH值，提高了植物乳桿菌CCFM8661的增殖，16 h時(shí)活菌數(shù)達(dá)到(3.2±0.0)×107CFU/mL，是未處理的對(duì)照蘋果汁的1.3倍。雖然無機(jī)鹽的添加對(duì)植物乳桿菌CCFM8661在果汁內(nèi)的增殖起到了促進(jìn)作用，但效果不顯著?？赡艿春蜕L因子的缺乏是主要的限制因素。

圖1 無機(jī)鹽對(duì)蘋果汁中植物乳桿菌CCFM8661增殖的影響Fig.1 Effect of inorganic salts on the growth of Lctobacillus plantarum CCFM8661 in apple juice

2.3 營養(yǎng)因子對(duì)蘋果汁中植物乳桿菌增殖的影響

酵母粉不僅含有適宜植物乳桿菌增殖的氮源，且含有核苷酸、維生素等促進(jìn)乳酸菌生長的重要的生長因子[13]。由圖2可知，添加酵母粉后顯著促進(jìn)了植物乳桿菌CCFM8661在蘋果汁中的增殖，在發(fā)酵12 h活菌數(shù)即達(dá)到(2.5±0.0)×109CFU/mL，是空白對(duì)照組的100倍。酵母粉的添加是植物乳桿菌CCFM8661在蘋果汁中快速增殖的顯著因素，且添加量僅為5 g/L，不會(huì)對(duì)蘋果汁的口感產(chǎn)生顯著影響，是植物乳桿菌發(fā)酵蘋果汁的理想助劑。

圖2 酵母粉對(duì)蘋果汁中植物乳桿菌CCFM8661增殖的影響Fig.2 Effect of yeast extract on the growth of Lctobacillus plantarum CCFM8661 in apple juice

2.4 微量元素對(duì)蘋果汁中植物乳桿菌增殖的影響

微量元素也是乳酸菌生長的關(guān)鍵因子，有研究表明Mn2+是乳桿菌菌體內(nèi)關(guān)鍵酶的輔基[14]，可積極促進(jìn)菌體細(xì)胞的生長。蘋果汁中添加適宜的微量元素Mn2+，顯著提高了植物乳桿菌CCFM8661在蘋果汁中的增殖(圖3)，在發(fā)酵12 h活菌數(shù)達(dá)到(3.4±0.2)×109CFU/mL。

圖3 錳元素對(duì)蘋果汁中植物乳桿菌CCFM8661增殖的影響Fig.3 Effect of Mn on the growth of Lctobacillus plantarum CCFM8661 in apple juice

綜上，在蘋果汁中添加5 g/L K2HPO4和7 g/L檸檬酸鈉可調(diào)節(jié)蘋果汁的初始pH值至5.5，再輔以5 g/L酵母粉和0.05 g/L MnSO4可以顯著促進(jìn)植物乳桿菌CCFM8661的增殖。在發(fā)酵12 h，發(fā)酵蘋果汁中植物乳桿菌CCFM8661的活菌數(shù)達(dá)到(3.4±0.2)×109CFU/mL，是空白對(duì)照組的100多倍。

2.5 保護(hù)劑對(duì)發(fā)酵蘋果汁中植物乳桿菌活性保持的影響

蘋果汁發(fā)酵結(jié)束后，有機(jī)酸積累，pH降低，條件非常不利于植物乳桿菌的存活。即使4 ℃貯藏，在發(fā)酵蘋果汁中植物乳桿菌CCFM8661的活性快速損失，在貯藏期的第7天存活率迅速下降至(14±0.3)%，貯藏第21天存活率下降至(5±1.1)%。添加保護(hù)劑的發(fā)酵蘋果汁中植物乳桿菌CCFM8661的存活率整體高于空白對(duì)照組，在貯藏期前7天，兩者的存活率達(dá)60%左右，顯著高于未加保護(hù)劑的對(duì)照組別，表明抗性糊精和分離乳清蛋白對(duì)蘋果汁中的植物乳桿菌CCFM8661均有保護(hù)效果?？赡芤?yàn)槎咚鶖y帶的氨基、羧基以及羥基可以與菌體細(xì)胞膜表面的磷脂基團(tuán)或蛋白質(zhì)極性基團(tuán)形成氫鍵，降低氫離子對(duì)菌體細(xì)胞的損傷。但在貯藏期第21天，發(fā)酵蘋果汁添加分離乳清蛋白組植物乳桿菌CCFM8661的存活率降至(15±2.8)%，抗性糊精組降至(20±2.0)%(圖4)。 雖然相較于空白對(duì)照組均有提高，但是植物乳桿菌的活性損失超過了80%，還需要進(jìn)一步提高其活性保持。

圖4 保護(hù)劑對(duì)發(fā)酵蘋果汁中植物乳桿菌CCFM8661貯藏期存活率的影響Fig.4 Effect of protectant on survival rate of of Lctobacillus plantarum CCFM8661 in fermented apple juice during storage

2.6 微膠囊對(duì)發(fā)酵蘋果汁中植物乳桿菌活性保持的影響

將植物乳桿菌CCFM8661與保護(hù)劑混合后以1%海藻酸鈉制備微膠囊進(jìn)行包埋，將其至于發(fā)酵蘋果汁。結(jié)果表明，經(jīng)微膠囊化后可顯著提高植物乳桿菌CCFM8661在發(fā)酵蘋果汁貯藏期間的存活率(圖5)。

WPI-W-100 g/L分離乳清蛋白作保護(hù)劑，1%海藻酸鈉進(jìn)行微囊化； K-空白對(duì)照組； RD-W-100 g/L抗性糊精作保護(hù)劑，1%海藻酸鈉進(jìn)行微囊化圖5 微膠囊化對(duì)植物乳桿菌CCFM8661在發(fā)酵蘋果汁貯藏期存活率的影響Fig.5 Effect of microencapsulation on survival rate of of Lctobacillus plantarum CCFM8661 in fermented apple juice during storage

以分離乳清蛋白做保護(hù)劑對(duì)菌體進(jìn)行的微膠囊包埋，貯藏21 d植物乳桿菌CCFM8661存活率達(dá)(27±1.8)%，高于未包埋的實(shí)驗(yàn)組。以抗性糊精作保護(hù)劑對(duì)菌體微膠囊包埋后，貯藏21 d植物乳桿菌CCFM8661的存活率得到更顯著的提高，達(dá)到(50±1.4)%。海藻酸鈉形成的微膠囊減緩了H+的侵入，微膠囊內(nèi)保護(hù)劑不僅對(duì)菌體細(xì)胞有保護(hù)作用，且起到了緩沖作用，更好地延緩了植物乳桿菌CCFM8661活性的損失?；谏鲜龇治?，增加保護(hù)劑濃度或增加微膠囊粒徑提高微膠囊內(nèi)保護(hù)劑對(duì)H+的緩沖能力是否會(huì)進(jìn)一步提高植物乳桿菌CCFM8661在貯藏期的存活率，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.7 不同濃度保護(hù)劑制備的微膠囊對(duì)發(fā)酵蘋果汁植物乳桿菌活性保持的影響

根據(jù)圖5和圖6可知，適量增加抗性糊精的濃度會(huì)提高植物乳桿菌CCFM8661在發(fā)酵蘋果汁中的貯藏存活率。在圖5中，10%抗性糊精制備的微膠囊在發(fā)酵蘋果汁中貯藏21 d后，植物乳桿菌CCFM8661存活率為(50±1.4)%。由圖6可知，提高抗性糊精質(zhì)量濃度至200 g/L，制備的微膠囊在貯藏21 d時(shí)植物乳桿菌CCFM8661的存活率達(dá)(78±3.6)%，優(yōu)于100 g/L的保護(hù)效果。但是，繼續(xù)增加抗性糊精的質(zhì)量濃度至300 g/L時(shí)，保護(hù)效果會(huì)下降，可能是因?yàn)闈B透壓的升高影響了菌體的活性，但是300 g/L的抗性糊精組依然優(yōu)于100 g/L的實(shí)驗(yàn)組。綜上，適當(dāng)提高微膠囊內(nèi)保護(hù)劑的濃度可提高其對(duì)菌體在發(fā)酵蘋果汁貯藏期的活性保持，但濃度應(yīng)適宜，濃度太高會(huì)影響保護(hù)效果。

圖6 不同濃度保護(hù)劑制備的微膠囊對(duì)植物乳桿菌CCFM8661在發(fā)酵蘋果汁貯藏期存活率的影響Fig.6 Effect of microcapsules prepared with different concentrations of protectant on survival rate of of Lctobacillus plantarum CCFM8661 in fermented apple juice during storage

2.8 微膠囊粒徑對(duì)發(fā)酵蘋果汁植物乳桿菌活性保持的影響

由圖7知，以200 g/L抗性糊精做保護(hù)劑，制備直徑4 mm的微膠囊，其提高了植物乳桿菌CCFM8661在發(fā)酵蘋果汁中的貯藏存活率，貯藏21 d后存活率達(dá)(81±3.1)%；且在整個(gè)貯藏期內(nèi)，4 mm粒徑的實(shí)驗(yàn)組菌體存活率普遍高于2 mm實(shí)驗(yàn)組。說明適當(dāng)增加粒徑對(duì)植物乳桿菌CCFM8661在整個(gè)貨架期內(nèi)的活性保持有積極作用。亦驗(yàn)證了2.6中的推測，隨著粒徑增大，微膠囊內(nèi)保護(hù)劑的量增加，提高了其對(duì)菌體的保護(hù)作用。

圖7 微膠囊粒徑對(duì)植物乳桿菌CCFM8661在發(fā)酵蘋果汁貯藏期存活率的影響Fig.7 Effect of microcapsule size on survival rate of of Lctobacillus plantarum CCFM8661 in fermented apple juice during storage

2.9 發(fā)酵及保護(hù)劑添加對(duì)蘋果汁風(fēng)味物質(zhì)的影響

根據(jù)表1，蘋果汁經(jīng)植物乳桿菌CCFM8661發(fā)酵后風(fēng)味得到顯著改善，具有辛辣氣味的丙酮、窒息性氣味的丁醛、令人不愉悅氣味的三氯甲烷、苯酚等不好的風(fēng)味物質(zhì)在發(fā)酵后含量明顯降低；而具有果香味、堅(jiān)果香味、芳香味等香味的庚酮、苯甲醛、2-十一酮、嘧啶等，及對(duì)人體健康有益的乙酸、丁酸、癸烯酸等經(jīng)發(fā)酵后顯著提高。且發(fā)酵后添加抗性糊精作為保護(hù)劑，并未對(duì)發(fā)酵蘋果汁的風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生顯著影響。

表1 蘋果汁的風(fēng)味物質(zhì)Table 1 The falavor of apple juice

3 結(jié)論

(1)蘋果汁中缺乏適宜乳酸菌增殖的氮源和微量元素，且pH值太低，植物乳桿菌CCFM8661無法在蘋果汁中快速生長。

(2)蘋果汁中添加5 g/L K2HPO4和7 g/L檸檬酸鈉，可調(diào)整蘋果汁pH值至5.5，基于此添加5 g/L酵母粉和適量微量元素錳，可顯著促進(jìn)植物乳桿菌CCFM8661在蘋果汁中的增殖。發(fā)酵12 h后，蘋果汁中植物乳桿菌CCFM8661的活菌數(shù)達(dá)(3.4±0.2)×109CFU/mL。

(3)發(fā)酵蘋果汁中添加分離乳清蛋白或抗性糊精均會(huì)提高植物乳桿菌CCFM8661在4 ℃貯藏期的活性保持，且抗性糊精效果優(yōu)于分離乳清蛋白，且抗性糊精的添加不會(huì)對(duì)發(fā)酵蘋果汁風(fēng)味產(chǎn)生影響。

(4)以分離乳清蛋白作為保護(hù)劑，以海藻酸鈉為壁材，包埋菌體與保護(hù)劑的混合液制備微膠囊，可顯著提高植物乳桿菌CCFM8661在發(fā)酵果汁中儲(chǔ)藏期間的存活率。

(5)微膠囊內(nèi)保護(hù)劑的濃度和微膠囊粒徑大小均會(huì)影響其對(duì)植物乳桿菌CCFM8661在發(fā)酵蘋果汁貯藏期的存活率，適當(dāng)增加保護(hù)劑濃度和粒徑大小會(huì)進(jìn)一步提高微膠囊的保護(hù)效果。