全基因組測序技術在細菌耐藥性檢測中的研究進展

谷美，劉慧敏，孟璐，董蕾，邢萌茹，蘭圖，王加啟，趙善倉，鄭楠

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室，北京100193；2.山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東泰安271018 3.山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術研究所，濟南250100）

0 引 言

早在20世紀40年代，細菌的耐藥性問題就已經(jīng)出現(xiàn)。近幾年，全球耐藥性問題迅速加劇，耐藥基因的傳播和多重耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，嚴重威脅人類公共衛(wèi)生安全。常用的耐藥性研究方法主要從表型和基因型兩方面進行。表型的檢測方法主要有K-B紙片法等藥敏實驗方法，基因型的檢測方法主要有PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應，簡稱PCR）,qPCR(Real-time Quantitative PCR Detecting System,實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng),簡稱qP-CR)和全基因組測序等。近幾年全基因組測序技術在檢測細菌耐藥性方面發(fā)展迅速，并得到廣泛應用。K?ser等[1]利用全基因組測序技術發(fā)現(xiàn)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)，識別致病菌傳輸路徑，有效控制MRSA的傳播。本文將全基因組測序技術在細菌耐藥性中的最新研究進展進行綜述，對全基因組測序技術在細菌耐藥性方面的應用具有重要意義。

1 全基因組測序技術的原理

全基因組測序技術主要依賴于第二代和第三代測序技術的結合，測序技術在第二代測序技術的基礎上又有了新的發(fā)展[2]。其中測序成本、讀長和通量是評估測序技術是否先進的重要指標。測序技術以測序平臺為依托，測序平臺競爭的重點之一就是測序產(chǎn)生的讀長長度。第三代測序技術包括PacBio公司開發(fā)的Oxford Nanopore Technologies納米孔單分子測序技術和SMRT技術[3]。下面主要介紹第三代測序技術中的PacBio公司的SMRT技術的測序原理。

PacBio SMRT技術采用了邊合成邊測序的思想[4]。其測序原理是：用DNA聚合酶與模板結合，用4色熒光標記dNTP，即A,C,G,T這4種堿基，其中DNA聚合酶的活性是影響讀長的關鍵因素之一，激光是影響酶活性的主要因素之一。利用ZMW（零模波導孔）原理將反應信號與在堿基的配對階段不同堿基加入時產(chǎn)生強大的熒光背景區(qū)別出來。ZMW(零模波導孔)的外徑比檢測激光波長小，激光通過ZMW的底部打上去后不會穿透小孔進入上方的溶液區(qū)，能量會被限制在需要檢測的小范圍里，使得信號只是來自于這個小反應區(qū)域，多余的堿基不會被檢測到，從而達到降低背景噪音的目的[2]。SMRT技術的測序速度很快，每秒約10個dNTP。但是，測序過程中容易出現(xiàn)隨機錯誤，其測序錯誤率較高，達到15%。第三代測序技術在繼續(xù)保持第二代測序技術高通量、低成本的優(yōu)點的同時，有效解決了第二代測序技術存在的缺陷，其單分子測序和不需要PCR擴增的特點有效避免了因PCR擴增產(chǎn)生的偏向性而導致的系統(tǒng)錯誤，并且提高了讀長[2]。

全基因組測序的技術路線主要包括：首先提取樣品中的基因組DNA，隨機打斷之后，通過電泳回收目標DNA片段，然后制備目標DNA片段的基因簇cluster或電子擴增E-PCR目標DNA片段，并利用Mate-Pair或者Paired-End方法進行測序，并組裝成Contig，并利用Paired-End的距離進一步組裝成Scaffold或染色體等，測序深度、覆蓋度和測序質(zhì)量等是影響組裝效果的主要因素[5]。

在全基因組測序中，測序深度是評價測序質(zhì)量的指標之一。測序深度（Sequencing Depth）是指測序得到的堿基總量（bp）與基因組大?。℅enome）的比值[5]。測序深度與基因組覆蓋度之間存在正相關關系，測序深度越高，測序產(chǎn)生的錯誤率或出現(xiàn)假陽性結果的可能性越低。當測序樣品可能包含同一物種的多種菌株時，需要更大的測序深度來識別少數(shù)變異體或分離菌株[6]。在全基因組測序的過程中，盡管整個基因組被測序，但是如果基因組包含重復的DNA片段，并且這個DNA片段比通過測序技術獲得的DNA長度長，這個基因組就不能被完整的組裝[7]。

2 全基因組測序技術的發(fā)展現(xiàn)狀

20世紀70年代中期，Sanger的雙脫氧鏈終止法和Maxam鏈降解為各種DNA測序技術發(fā)展奠定了基礎，也標志著第一代DNA測序技術的出現(xiàn)。第一代測序技術測序讀長能夠達到1 000 bp，精確度高，其測序準確率高達99.999%，具有易掌握的特點，其缺點是操作過程復雜，耗時長，通量低，費用高，嚴重限制其廣泛大規(guī)模的應用。

20世紀90年代以來，隨著現(xiàn)代計算機技術和生物技術的發(fā)展，以高通量測序為特點的第二代測序技術出現(xiàn)。二代測序技術主要是包括Roche、Illumina和ABI三個公司主導分別推出的454技術、Solexa/Hiseq技術和Solid技術。第二代測序技術大大地降低了測序成本，提高了測序速度，準確度高，能夠一次對一個物種的基因組或轉錄組的幾百萬條DNA分子進行測序，但其測序讀長比第一代測序技術要短，大約是100～150 bp。

2011年以來，PacBio公司推出的SMRT和Oxford Nanopore Technologies的納米孔單分子測序技術標志著第三代測序技術的出現(xiàn)[3]。第三代測序技術的最大的特點是單分子測序，測序過程無需進行PCR擴增，超長讀長，其缺點是測序成本高，測序錯誤率高，并且錯誤率的出現(xiàn)是隨機的[8]。

2012年，Adam Phillippy等人結合第二代和第三代測序技術開發(fā)了長讀取技術。Peters等[9]研究發(fā)現(xiàn)只有600個錯誤堿基存在于人類完整的基因組中，該項研究中人類完整的基因組序列通過利用長片段讀取技術(LFR)中“條形碼”DNA拼接完成，該技術不僅降低了測試過程中DNA的樣本量，也大大地提高了全基因組測序的精度。

3 全基因組測序在細菌耐藥性中的應用

細菌產(chǎn)生耐藥性的遺傳基礎是基因突變或獲得耐藥基因，其表達后對相對應的藥物產(chǎn)生耐藥。針對性的檢測細菌的耐藥基因或基因突變是開展細菌耐藥性分析研究的重要基礎和方式。全基因組測序作為一種新型測序技術，能夠分析確定已知耐藥基因型及其突變情況，預測未知的潛在的耐藥機制和耐藥表型，是一種簡單、高效和快速的耐藥性分析方法[10]。

3.1 全基因組測序在革蘭氏陰性菌耐藥性分析中的應用

Gomi等[11]用全基因組測序成功表征了來自河水的大腸桿菌菌株，并在分離株中檢測出了50多種抗性因子，證明了屬于臨床重要克隆群體的大腸桿菌菌株會導致地表水污染，并建議需要對地表水中的耐藥性致病菌開展進一步的調(diào)查研究。Shridhar等[12]用全基因組測序分析了從牛糞便中分離出來的大腸桿菌O104菌株的不同血清型，對深入研究其遺傳多樣性和致病潛力具有重要意義。

McDermott等[13]利用全基因組測序分析了人體臨床病例和零售肉中的非傷寒沙門氏菌的耐藥基因，并檢出氨基糖苷類、四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類和甲氧芐氨嘧啶類抗生素的耐藥基因，為指導非傷寒沙門氏菌抗生素的使用具有重要意義。Li等[14]用全基因組測序分析了從中國南部沿海地區(qū)的人類糞便和糞便污染的食品樣品中分離出來的44株韋太夫雷登沙門氏菌（Salmonella weltevreden）菌株，并分析了他們的系統(tǒng)發(fā)育關系，研究數(shù)據(jù)表明從中國南部沿海的人的糞便和食品樣品中分離的S.weltevreden菌株與東南亞地區(qū)的菌株之間存在系統(tǒng)發(fā)育的相關性，這也表明了不同國家和地區(qū)之間的細菌可以通過食物進行潛在的內(nèi)在轉移。Kagambèga等[15]利用全基因組測序?qū)Σ∪撕图仪菁S便中多重耐藥的鼠傷寒沙門氏菌進行比較和表征，研究數(shù)據(jù)表明，所測菌株對氨芐西林、氯霉素、鏈霉素、磺胺甲氧芐啶4種抗生素具有耐藥性，并檢出其耐藥基因，對理解鼠傷寒沙門氏菌的基因型和潛在宿主之間的地理傳播具有重要意義。

Rupa Iyer等[16]利用全基因組測序?qū)拿绹驴怂_斯州圣哈辛托河的沉積物中分離出來的產(chǎn)氣克雷伯氏菌PX 01進行測序，發(fā)現(xiàn)了其基因組序列草圖，其編碼在97個重疊群中共計5 262 952 bp。Palmieri等[17]利用全基因組測序闡述了頭霉素和β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥機理。

3.2 全基因組測序在革蘭氏陽性菌耐藥性分析中的應用

金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性菌的代表。Gordon等[18]研究表明全基因組測序?qū)瘘S色葡萄球菌耐藥基因型預測的總體靈敏性和特異性是97%和99%，這表明全基因組測序在金黃色葡萄球菌和其他主要細菌病原體的耐藥性預測方面具有廣闊發(fā)展前景。

Zhang等[19]利用全基因組測序分析了植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum ATCC14917）對鏈霉素的耐藥

機制，研究證實，L.plantarum ATCC14917中的移動因子不存在耐藥基因，即結合轉座子等可動遺傳因子中不存在與鏈霉素耐藥相關的突變基因。本研究通過生物信息學和全基因組測序結合的方法，對L.plantarum ATCC14917的耐藥基因進行研究，并初步評價了鏈霉素抗藥性益生菌與抗生素鏈霉素聯(lián)合應用的安全性，對有效評價潛在耐藥基因及其遷移率具有重要意義。Metcalf等[20]利用全基因組測序檢測無乳鏈球菌的抗生素抗性機理，研究結果表明，以全基因組測序為基礎的耐藥性檢測比常規(guī)傳統(tǒng)的藥敏試驗更有效，特別是在大規(guī)模和長期菌株監(jiān)測方面，全基因組測序技術比常規(guī)測試方法更實用，為促進全基因組測序在革蘭氏陽性菌耐藥性方面的應用具有重要作用。

微桿菌屬是以產(chǎn)抗生素為特征的革蘭氏陽性菌，能夠在陸地和水生環(huán)境中生長。最近研究發(fā)現(xiàn)，微桿菌也成為一種罕見的機會性人類病原體。Iyer等[21]通過利用全基因組測序?qū)拿绹驴怂_斯州的圣哈辛托河中的沉積物中分離出來的微桿菌進行分析，得出了232個微桿菌株AISO3在支架水平上組裝的3 696 310 bp的基因組序列草圖(染色體和質(zhì)粒)，為進一步研究微桿菌耐藥性及其耐藥基因的轉移奠定基礎。

Phelan[22]等用全基因組測序檢測了抗結核病藥物的耐藥性，該研究比較了兩種測序平臺的重現(xiàn)性，證實了某些基因組區(qū)域的平臺特異性可能會影響對特定藥物的耐藥性預測，這些發(fā)現(xiàn)可能會影響臨床實踐，對以后改善治療結核病的藥物使用具有指導作用。

4 細菌耐藥性其他檢測方法

4.1 K-B法

藥敏試驗是檢測細菌耐藥性的常規(guī)方法，藥敏試驗具有國際化的操作流程，且敏感性高，其中K-B紙片法（Kirby-Bauer紙片法，K-B法）是最常用也是最經(jīng)典的藥敏定性檢測方法，它能夠在抑菌濃度范圍內(nèi)抑制待測菌的生長，形成透明的抑菌圈，根據(jù)抑菌圈的大小可判斷待測菌對測定藥物的敏感度[23]。K-B紙片法具有可重復性好、操作簡便、靈活性高，結果判讀直觀容易，成本低等優(yōu)點，并且易于向?qū)嶒灄l件較差的邊遠地區(qū)普及，但是不能獲得相對精確的藥物最低抑菌濃度(minimuminhibitory concentration，MIC)，并且易受人為因素的影響，影響結果準確性[24]。

Gautam等[25]研究表明K-B紙片法可以可靠地用于檢測鮑曼不動桿菌復合菌株中碳青霉烯類藥物的耐藥性。Joseph等[26]研究表明K-B紙片法可以可靠地用于檢測非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌的美羅培南耐藥性。Karami A等[27]研究證實紙片擴散法具有較低的靈敏性和特異性。Qin等[28]用K-B紙片擴散法檢測出95株臨床菌株中有76%的菌株對第三代頭孢菌素具有誘導性耐藥性，研究表明，K-B紙片擴散法是檢測菌株耐藥表型的重要方法。

4.2 微量肉湯稀釋法

微量肉湯稀釋法是細菌藥物敏感性定量檢測的經(jīng)典方法。其基本原理是在含有一系列稀釋濃度藥物的肉湯或瓊脂培養(yǎng)基上，接種菌株，并觀察菌株的生長狀況，獲得相對精確的藥物最低抑菌濃度MIC。微量肉湯稀釋法以測定菌株的最小抑菌濃度的大小為依據(jù)來判斷細菌對抗菌藥物的敏感情況，最小抑菌濃度值越小，說明細菌對這種抗生素的敏感度越高。微量肉湯稀釋法是一種操作簡便、成本低，既快速又準確細菌耐藥性常規(guī)檢測方法，對監(jiān)測菌株藥物敏感性的變遷、研究菌株耐藥性的流行趨勢具有重要意義[29]。

Karami等[30]比較了紙片擴散法和微量肉湯稀釋法檢測細菌耐藥性結果的一致性，研究表明，后者在檢測細菌耐藥性方面具有較高的敏感性和特異性。Zhang等[31]研究表明，微量肉湯稀釋法在對多重耐藥肺結核菌株中的乙胺丁醇耐藥表型檢測中有較高的準確性和相關性。江培濤等[32]用微量肉湯稀釋法監(jiān)測金黃色葡萄球菌誘導型克林霉素耐藥，結果顯示金黃色葡萄球菌的誘導型克林霉素耐藥發(fā)生率很高，對監(jiān)控林可霉素類抗生素的使用，減少患者損失和耐藥菌株的流行具有重要意義。

4.3 PCR方法

PCR方法是檢測基因型的常用檢測方法。PCR方法主要包括普通PCR和qPCR，其原理都是在目的基因特異片段基礎上的擴增。最初PCR僅用于鑒定菌種和定量分析，但是隨著近幾年細菌耐藥機制研究地不斷深入，PCR也在細菌耐藥基因的檢測中得到廣泛應用。與PCR相比，qPCR完成了定性到定量的飛躍，且耗時短，靈敏度高、特異性好，在操作過程中可有效避免樣品之間的污染，實時監(jiān)控實驗過程、分析實驗結果，PCR產(chǎn)物無需進行凝膠電泳分析，還能檢測目標基因豐度，檢測細菌生長狀況，縮短細菌的培養(yǎng)時間，為細菌耐藥性研究分析奠定基礎[33]。

PCR技術在細菌耐藥基因檢測應用中具有穩(wěn)定性和靈敏度高、重復性好、快速簡便的優(yōu)勢。Ghoddusi等[34]用PCR技術對從家養(yǎng)雞分離出來嬰兒沙門氏菌（Salmonella Infantis）進行分子鑒定和耐藥基因的檢測，結果表明嬰兒沙門氏菌的耐藥表型和耐藥基因型完全符合，并且對四環(huán)素類抗生素有較高的耐藥率。因為家養(yǎng)雞中的嬰兒沙門氏菌對四環(huán)素類有較高的耐藥率。Rebelo等[35]在PCR技術的基礎上開發(fā)了一種復合PCR技術，該技術可以快速地檢測目前腸桿菌科中所有的mcr基因，該研究表明來自西班牙、德國、法國和意大利的牛和豬的菌株結果與全基因組測序數(shù)據(jù)完全相符，這個方法能夠快速確認mcr陽性細菌并克服粘菌素耐藥表型檢測的局限性。

Schmidt等[36]研究表明qPCR可以檢測個體動物中抗生素的耐藥水平，可以更準確地量化抗生素耐藥基因。Clasen等[37]研究表明qPCR可以準確測定丹麥豬群中的erm B，erm F，tet(M)，tet(O)和tet(W)5種耐藥基因。Sartori等[38]評估了qPCR檢測牛奶樣品中金黃色葡萄球菌基因型B（Staphylococcus aureus genotype B）的敏感性和特異性，研究表明qPCR檢測S.aureus GTB具有較高的靈敏性，準確度高。

4.4 基因芯片法

基因芯片（genochip）技術是一種高通量自動化檢測技術，主要是通過基因特異性擴增和準確的基因鑒別來達到細菌耐藥性檢測的目的[33]。Pang等[39]研究表明，在檢測結核桿菌多重耐藥性方面，基因芯片方法比常規(guī)藥敏試驗成本低、效率高、安全性高。近年來隨著基因芯片技術在實驗方法、信號采集、和樣品分析等性能方面的極大提高和市場價格的降低，更有利于其在細菌耐藥基因檢測中的應用[40]。

Zhang等[41]利用基因芯片分析中國長春地區(qū)的結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）的耐藥性和基因突變，研究證實基因芯片檢測結核分枝桿菌耐藥性的結果準確可靠，此方法可以用來檢測臨床菌株中的耐藥基因突變型，為未來結核分枝桿菌耐藥性研究提供參考。Zhu等[42]研究表明基因芯片技術為結核分支桿菌耐藥性的檢測提供了一種簡單快速、可靠、準確的臨床檢測方法，該技術有望成為結核分枝桿菌耐藥性高度流行地區(qū)重要的診斷工具。

Low等[43]分別調(diào)研了城市具有不同土地利用類型的兩個非點源集水區(qū)中抗生素耐藥水平，利用基因芯片技術識別確認了城市集水區(qū)中的耐藥基因組中的耐藥細菌群體，揭示了兩個集水區(qū)具有相似的抗生素耐藥基因。研究結果表明，不同土地利用類型的兩個集水區(qū)識別的耐藥細菌和基因與抗生素抗性和生物合成有關，環(huán)境中的細菌是抗生素耐藥基因的潛在攜帶者。這項研究是基因芯片研究城市水流域中的耐藥基因的第一次應用，有利于開發(fā)基因芯片技術在細菌耐藥性方面的應用，為進一步開展耐藥基因的風險監(jiān)測和風險評估提供依據(jù)。

4.5 LAMP技術

環(huán)介導等溫擴增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）技術是由日本學者Notomi T于2000年發(fā)明的具有獨特的核酸擴增機制的一種新型恒溫核酸擴增技術，用瓊脂糖凝膠電泳驗證其擴增產(chǎn)物，會呈現(xiàn)出典型的階梯狀條帶[44]。LAMP通過鏈置換擴增反應，將靶基因快速擴增，并針對靶基因的6個區(qū)域設計4種特異引物，在恒溫條件下，在聚合酶的作用下進行核酸擴增，具有操作簡單特異性強的特點[45]。

Le等[46]用環(huán)介導等溫擴增PCR雜交-熱酶聯(lián)免疫吸附試驗方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的PCR擴增方法來擴增少量的目標DNA，結合高分辨率的熱熔工藝篩選在結核分枝桿菌M.tuberculosis的抗性突變體中的熱點突變，研究表明該方法可以直接快速的從臨床樣本中檢測出多重耐藥M.tuberculosis菌株。這是檢測抗性突變體高分辨率熱熔煉方法的第一份研究報告，該研究使用PCR技術和ELISA讀取器，可有效降低實驗成本。Gong等[47]在LAMP基礎上發(fā)展了一種復合LAMP方法，該方法能夠快速，特異靈敏的檢測三種已知的磺胺耐藥基因（sul1，sul2，sul3），并快速篩查臨床菌株中的磺胺耐藥基因，對指導相關抗生素的使用具有重要意義，該方法將會成為研究細菌耐藥基因發(fā)展演變機理的重要工具。Mu等[48]利用LAMP檢測金黃色葡萄球菌S.aureus攜帶的耐藥基因msr A，研究結果表明LAMP方法是檢測耐藥基因msr A的最佳方法，該方法簡單快速，并具有較高的靈敏度和特異性，為臨床控制含有msr A耐藥基因的細菌病原體，有利于促進LAMP方法在細菌耐藥性方面的應用。

綜上所述，細菌耐藥性檢測方法在細菌耐藥性方面的應用范圍廣，作用大，現(xiàn)將主要的細菌耐藥性檢測方法的優(yōu)缺點概括如下（見表1）。

表1 主要的細菌耐藥性檢測方法優(yōu)缺點比較

5 展 望

通過全基因組測序技術全面準確地分析基因組的堿基序列，破譯基因組所包含的遺傳機制等所有信息，揭示基因組的復雜性和多樣性，對提高各種細菌發(fā)生、發(fā)展的認知具有重要意義，也為細菌耐藥性分析奠定了基礎[55]。全基因組測序可以快速識別細菌耐藥性機理，可以用來研究不同條件下的細菌耐藥性的發(fā)展演變，測量耐藥性出現(xiàn)速率，檢測臨床抗生素耐藥性。隨著測序技術的發(fā)展，全基因組測序已經(jīng)成為細菌耐藥性研究的重要工具[6]。