穩(wěn)定劑對(duì)滅菌型乳酸菌飲料穩(wěn)定性影響的研究

孫志巖，郝金偉，張志娟，何衛(wèi)加，趙晶

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，哈爾濱150028；2.黑龍江東方學(xué)院，哈爾濱150066；3.丹尼斯克（中國）投資有限公司上海310000）

0 引 言

乳酸菌飲料主要是以鮮乳或再制乳為原料，殺菌之后接種乳酸菌類物質(zhì)發(fā)酵而成的。滅菌型乳酸菌飲料不僅具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和獨(dú)特的風(fēng)味，而且還具有調(diào)節(jié)腸道菌群、改善便秘和腹瀉的作用，受到廣大消費(fèi)者的喜愛，目前銷售量也在不斷地上升[1]。但是滅菌型乳酸菌飲料在銷售和存儲(chǔ)過程中常出現(xiàn)分層、沉淀等問題，給銷售帶來了許多的不變，產(chǎn)生這一問題的原因是滅菌型乳酸菌飲料的pH值一般在3.8～4.2，而牛乳中的乳蛋白有80%是等電點(diǎn)為4.6的酪蛋白，使滅菌型乳酸菌飲料處于不穩(wěn)定狀態(tài)，因此控制飲料的p H值是至關(guān)重要的[2-3]。適合且適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑可以提高滅菌型乳酸菌飲料的穩(wěn)定性，本試驗(yàn)主要是在滅菌型乳酸菌飲料中加入果膠（Pectin888）、海藻酸丙二醇酯（PGA）、大豆多糖（SSPS）來研究單獨(dú)添加單一穩(wěn)定劑對(duì)滅菌型乳酸菌飲料的pH值、黏度、離心沉淀率、lumi斜率、粒徑分布的影響，進(jìn)而研究其穩(wěn)定性，并采用響應(yīng)面方法進(jìn)行復(fù)配，得出最佳的復(fù)配方案，為以后研究滅菌型乳酸菌飲料的穩(wěn)定性提供一些參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂奶粉，雀巢（中國）有限公司；蔗糖，市售；副干酪乳桿菌（Lactobacillusparacasei）、Pectin888，丹尼斯克（中國）有限公司；PGA，鄭州豫龍食品有限公司；SSPS，上海百奧特植物蛋白科技有限公司。

SG 2 pH計(jì)，分析天平上海梅特勒-托利多儀器有限公司；M BL25高速剪切機(jī)，上楚業(yè)生物科技（上海）有限公司；SHP-160生化培養(yǎng)箱、TD 5G離心機(jī)，金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；APV-1000型均質(zhì)機(jī)，丹麥APV公司；微型UHT殺菌機(jī)，上海沃迪實(shí)驗(yàn)設(shè)備；M astersizer3000激光粒度分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；V ISCO黏度計(jì)，愛拓中國分公司；LumiSizer，上海順虞科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 滅菌型乳酸菌飲料的工藝流程

（1）發(fā)酵凝乳的制備[4]

（2）飲料的調(diào)配

1.2.2 穩(wěn)定劑的單因素試驗(yàn)

以滅菌型乳酸菌飲料的pH、黏度、離心沉淀率、Lumi斜率、粒徑分布為試驗(yàn)指標(biāo)，研究Pectin888、PGA、SSPS的添加量對(duì)滅菌型乳酸菌飲料穩(wěn)定性的影響，篩選出最佳條件，進(jìn)行后續(xù)研究。表1為3種穩(wěn)定劑的不同添加量。

表1 各穩(wěn)定劑的添加量

1.2.3 穩(wěn)定劑的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

穩(wěn)定劑之間的復(fù)配可以減少穩(wěn)定劑的用量，還能避免單一穩(wěn)定劑添加過量而影響其飲料的風(fēng)味，考慮到飲料的口感和成本對(duì)各穩(wěn)定劑進(jìn)行復(fù)配[5]。本文以Pectin888（A）、PGA（B）、SSPS（C）為自變量，以黏度、Lumi斜率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面優(yōu)化方法得到最佳穩(wěn)定劑復(fù)配方案，試驗(yàn)方法見表2。

表2 響應(yīng)面因素水平編碼表

1.2.4 穩(wěn)定性的測定方法

1.2.4.1 酸度測定

使用手持式pH計(jì)直接測定滅菌型乳酸菌飲料的酸度。

1.2.4.2 黏度測定

將飲料倒入50 m L燒杯，使用LVI號(hào)轉(zhuǎn)子，設(shè)置黏度計(jì)為25℃，60 rpm下進(jìn)行測定。

1.2.4.3 離心沉淀率測定

在離心管（60 m L，質(zhì)量m1）中加入定量樣品（質(zhì)量m0），4 000 rpm下離心15 min，將上清液棄去得m2，以離心沉淀率公式：

離心沉淀率=(m2-m1)/m0×100%[6]

1.2.4.4 Lumi測定

Lumisizer分析儀是通過高速離心使飲料中的蛋白質(zhì)分子在重力或離心力的作用下發(fā)生懸浮或者沉淀，再利用紅外照射，得到一個(gè)Lumi測定的結(jié)果圖，該圖輸出的數(shù)據(jù)為Lumi斜率，即透光率變化率。滅菌型乳酸菌飲料的穩(wěn)定性可由Lumi斜率來反映，斜率越大，透光率變化越快，飲料的穩(wěn)定性越差；反之亦然。測試條件：在25℃，4 000 r/min下保持42 min。

1.2.4.5 粒徑測定

利用M astersize2000激光衍射粒度分析儀測定滅菌型乳酸菌飲料的粒徑，該儀器可以直接輸出粒徑分布曲線和粒徑分布圖。測試條件為：25℃，2 200 r/min。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用O rigin85對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并制作曲線圖，最后使用Design Expert8.0.5.0軟件對(duì)Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸方差分析[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 穩(wěn)定劑的單因素試驗(yàn)分析

2.1.1 Pectin888對(duì)飲料穩(wěn)定性的影響

（1）Pectin888對(duì)飲料pH的影響如圖1所示。

圖1 Pectin888對(duì)飲料pH的影響

由圖1可知，隨著Pectin888添加量的增加，滅菌型乳酸菌飲料的p H逐漸下降，當(dāng)添加量為0.4%～0.5%時(shí)，p H下降速度變緩。這是因?yàn)镻ectin888屬陰離子多糖，在乳酸菌飲料中與帶正電荷的酪蛋白相互吸引并結(jié)合，形成酪蛋白-果膠復(fù)合物，進(jìn)而穩(wěn)定酪蛋白；隨著Pectin888添加量的增加，陰離子含量逐漸增多，從而使越來越多的果膠分子被吸附在酪蛋白膠體表面，使飲料的總p H下降。

（2）Pectin888對(duì)飲料黏度和離心沉淀率的影響如圖2所示。

由圖2可知，隨著Pectin888添加量的增加，滅菌型乳酸菌飲料的黏度逐漸上升，離心沉淀率逐漸下降，可見蛋白質(zhì)分子的沉降速度與飲料中膠粒的密度呈正比，與飲料的黏度呈反比。Pectin888添加量從0.4%升到0.5%時(shí)，飲料的黏度急劇上升，離心沉淀率緩慢下降，主要是因?yàn)镻ectin888與酪蛋白之間靜電相互作用，吸附周圍的酪蛋白，高濃度的Pectin888可以使酪蛋白達(dá)到飽和吸附，使蛋白質(zhì)膠體分子之間產(chǎn)生空間位阻，進(jìn)而增加飲料的穩(wěn)定性，又因?yàn)镻ectin888屬于多糖，增加其用量黏度會(huì)有顯著的增加[8]。

圖2 Pectin888對(duì)飲料黏度和離心沉淀率的影響

（3）Pectin888對(duì)飲料Lumi斜率的影響如圖3所示。

由圖3可知，滅菌型乳酸菌飲料中的蛋白質(zhì)分子在分離過程中，隨著Pectin888添加量的增加，透光率變化率逐漸減小，沉淀與懸浮分離的速度逐漸變慢，Lumi斜率逐漸減小。由此可見，隨著Pectin888的增加，滅菌型乳酸菌飲料越來越穩(wěn)定。

（4）Pectin888對(duì)飲料粒徑的影響如圖4所示。粒徑分布的分析結(jié)果見表3。

圖4 Pectin888對(duì)飲料粒徑分布的影響

表3 粒徑分布的結(jié)果分析

由圖4和表3可知，滅菌型乳酸菌飲料中加入Pectin888可以使粒徑分布的比較均勻，隨著Pectin888添加量的增加，d(0.1)、d(0.5)、d(0.9)的粒徑雖然在逐漸減小，但是變化不大，進(jìn)而說明Pectin888對(duì)飲料的粒徑?jīng)]有太大的影響。綜合以上結(jié)果可見，隨著Pectin888添加量的增加，飲料體系的p H、離心沉淀率、Lumi斜率逐漸減小，黏度逐漸增加，粒徑分布變化不大，飲料的穩(wěn)定性越來越好。當(dāng)添加量為0.4%和0.5%時(shí)，各因素的該變量不是很大，從節(jié)省原料角度應(yīng)該，最佳的添加量為0.4%。

2.1.2 PGA對(duì)飲料穩(wěn)定性的影響

（1）PGA對(duì)飲料pH的影響如圖5所示。

圖5 PGA對(duì)飲料pH的影響

由圖5可知，隨著PGA添加量的增加，滅菌型乳酸菌飲料的p H呈先下降再平穩(wěn)最后上升的趨勢。PGA在水溶液中帶負(fù)電，可以吸附周圍的酪蛋白分子，形成一種黏稠的膠體；當(dāng)添加量超過0.4%時(shí)，PGA將會(huì)破壞PGA與酪蛋白的相互作用，使pH開始上升[9]。

（2）PGA對(duì)飲料黏度和離心沉淀率的影響如圖6所示。

圖6 PGA對(duì)飲料黏度和離心沉淀率的影響

由圖6可知，隨著PGA添加量的增加，滅菌型乳酸菌飲料的黏度逐漸增加，添加量從0.3%增至0.5%范圍內(nèi)，黏度變化較大。主要原因是因?yàn)镻GA大部分被羧基酯化，而且還具有親水和親油基團(tuán)，增加了PGA的空間體積，既可以與脂肪球結(jié)合，防止脂肪上??；又可以與酪蛋白形成一種復(fù)合體，防止酪蛋白發(fā)生沉淀，同時(shí)使飲料內(nèi)部的分子結(jié)構(gòu)排列更加緊密，三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，進(jìn)而提高飲料的黏度，使其穩(wěn)定性增加。PGA具有較強(qiáng)的抗鹽性，即使電解質(zhì)的濃度很高也不會(huì)發(fā)生鹽析，并且也不會(huì)與鈣離子和鈉離子發(fā)生反應(yīng)，降低飲料的沉淀率。

（3）PGA對(duì)飲料Lumi斜率的影響如圖7所示。

圖7 PGA對(duì)飲料的Lumi斜率的影響

由圖7可知，滅菌型乳酸菌飲料中的蛋白質(zhì)分子在在分離過程中，隨著PGA添加量的增加，透光率變化逐漸減小，沉淀與懸浮分的速度逐漸變慢，Lumi斜率逐漸減小。由此可見，隨著PGA添加量的增加，滅菌型乳酸菌飲料越來越穩(wěn)定。

（4）PGA對(duì)飲料粒徑的影響如圖8所示。粒徑分布的分析結(jié)果見表4。

圖8 PGA對(duì)飲料粒徑分布的影響

表4 粒徑分布的結(jié)果分析

由圖8和表4可知，試驗(yàn)1和2的粒徑分布基本一致，分子粒徑相對(duì)較小，此時(shí)最為穩(wěn)定；試驗(yàn)5的粒徑分布較散漫，90%的分子粒徑已經(jīng)達(dá)到了26.963，分子粒徑較大，此時(shí)的飲料很不穩(wěn)定。由此看來，從粒徑分布角度來看，試驗(yàn)2分布較為合理，其主要原因可能是：PGA添加過量，酪蛋白吸附的PGA分子量增加，膠粒體積增加，靜電排斥作用不足以使各蛋白質(zhì)分子穩(wěn)定存在，一些蛋白質(zhì)分子最終聚集在一起，使得大粒徑分子增加。因此，PGA的最佳添加量為0.2%。

2.1.3 SSPS對(duì)飲料穩(wěn)定性的影響

（1）SSPS對(duì)飲料p H的影響如圖9所示。

由圖9可知，隨著SSPS添加量的增加，產(chǎn)品p H值逐漸上升，但是整體變化量并不顯著。

（2）SSPS對(duì)飲料黏度和離心沉淀率的影響如圖10所示。

圖9 SSPS對(duì)飲料pH的影響

圖10 SSPS對(duì)飲料黏度和離心沉淀率的影響

由圖10可知，隨著SSPS添加量的增加，滅菌型乳酸菌飲料的黏度逐漸增加，變化范圍是：1.82～2.20，可見變化不大，主要是因?yàn)镾SPS分子結(jié)構(gòu)近似球形，水溶液的黏度較低，且不受鹽類物質(zhì)影響，且具有良好的熱穩(wěn)定性，適用于制備較低黏度的滅菌型乳酸菌飲料；SSPS中的中性多糖側(cè)鏈?zhǔn)瞧渲饕姆€(wěn)定作用，可以通過靜電作用吸附酪蛋白，這樣就能產(chǎn)生空間阻力，是蛋白質(zhì)不能聚集而沉淀下來，即使在極低的pH環(huán)境下也可以使飲料保持穩(wěn)定[10]。

（3）SSPS對(duì)飲料Lumi斜率的影響如圖11所示。

圖11 SSPS對(duì)飲料Lumi斜率的影響

由圖11可知，在飲料中的蛋白質(zhì)分子分離過程中的前2 000 s內(nèi)，隨著SSPS添加量的增加，透光率變化率逐漸減小，沉淀與懸浮分離速度逐漸減慢，Lumi斜率逐漸?。? 000 s以后，5個(gè)試驗(yàn)的Lumi斜率基本不變，可能是在該階段酪蛋白已經(jīng)完全沉淀，隨著SSPS的繼續(xù)添加，飲料穩(wěn)定性基本無變化。

（4）SSPS對(duì)飲料粒徑的影響

SSPS對(duì)飲料粒徑的影響如圖12所示。粒徑分布的結(jié)果分析見表5。

圖12 SSPS對(duì)飲料粒徑分布的影響

表5 粒徑分布的結(jié)果分析

由圖12和表5可知，隨著SSPS添加量的增加，粒徑分布變化不大，可見SSPS對(duì)滅菌型乳酸菌飲料的粒徑分布沒有影響。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以Pectin888、PGA、SSPS的添加量為自變量，Lumi試驗(yàn)的斜率和黏度為響應(yīng)值，做3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，做3次平行。表6為試驗(yàn)結(jié)果。

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 穩(wěn)定劑對(duì)飲料Lumi斜率的影響

使用Design-Exper8.0.5.0處理數(shù)據(jù)，得到穩(wěn)定劑對(duì)滅菌型乳酸菌飲料Lumi斜率的影響的回歸方程：Y1=0.26-0.069A-0.071B+7.050E-003C+0.098AB+3.425E-003AC+0.030BC+0.065A2+0.029B2-0.013C2。由表7可知，該模型F值為23.01，說明該試驗(yàn)的擬合較好；P＜0.01，表示該模型具有極顯著性，可以進(jìn)行響應(yīng)值的預(yù)測。校正后修復(fù)系數(shù)R2Adj=0.9253，說明有92.53%的響應(yīng)值變化可以被模型解釋，相關(guān)系數(shù)R2=0.9673，說明Lumi試驗(yàn)斜率與預(yù)測值非常接近，擬合程度較高，可以用來分析預(yù)測滅菌型乳酸菌飲料的穩(wěn)定性。從表7中還可以看到，A項(xiàng)、B項(xiàng)均、AB項(xiàng)達(dá)到極顯著水平，各穩(wěn)定劑對(duì)Lumi斜率的影響程度為：A＞B＞C，即Pectin888＞PGA＞SSPS。

圖13 Pectin888、PGA、SSPS對(duì)飲料Lumi斜率的影響

由圖13中（a）可知，當(dāng)PGA為固定值，隨著Pectin888的增加，Lumi斜率逐漸減小；當(dāng)Pectin888為固定值，隨著PGA的增加，Lumi斜率先減小后增大，可見Pectin888與PGA添加量過低或過高都會(huì)使飲料的穩(wěn)定性降低，Pectin888與PGA的交互作用顯著。由圖13中（b）和（c）可知，Pectin888與SSPS的交互作用、PGA

表7 Lumi斜率回歸模型及方差分析

與SSPS的交互作用對(duì)Lumi斜率的影響都比較弱，說明Pectin888和SSPS、PGA和SSPS穩(wěn)定劑復(fù)合對(duì)飲料的穩(wěn)定性沒有太大的影響。由回歸模型得出響應(yīng)面試驗(yàn)的最優(yōu)條件為：Pectin888添加量為0.20%，PGA添加量為0.15%，SSPS添加量為0.17%時(shí)，Lumi斜率最小，為0.1853。

2.2.2 穩(wěn)定劑對(duì)黏度的影響

使用Design-Exper8.0.5.0處理數(shù)據(jù)，得出穩(wěn)定劑對(duì)滅菌型乳酸菌飲料黏度影響的回歸方程：Y2=10.20+1.69A+2.33B+0.46C+1.25AB+0.63AC+0.40BC-0.088A2+0.91B2-0.088C2。P＜0.01，表示該模型極顯著，可以進(jìn)行響應(yīng)值的預(yù)測。校正后修復(fù)系數(shù)R2Adj=0.9442，說明有94.42%的響應(yīng)值變化可以被模型解釋，相關(guān)系數(shù)R2=0.9756，說明飲料的黏度與預(yù)測值非常接近，擬合程度較高，可以用來分析預(yù)測滅菌型乳酸菌飲料的穩(wěn)定性及黏度大小。從表8中還可以看到，A項(xiàng)、B

表8 方差及回歸系數(shù)分析表

項(xiàng)、AB項(xiàng)、B2項(xiàng)均達(dá)到極顯著水平，可以看出各因素對(duì)黏度的影響程度為：B＞A＞C，即PGA＞Pectin888＞SSPS。

由圖14中（a）可知，當(dāng)Pectin888為固定值時(shí)，隨著PGA增加，黏度逐漸增大；當(dāng)PGA為固定值時(shí)，隨著Pectin888增加，黏度逐漸增大，可見Pectin888與PGA的交互作用顯著。由圖14中（b）和（c）可知，Pectin888與SSPS的交互作用、PGA與SSPS的交互作用對(duì)飲料黏度的影響都比較弱，說明Pectin888和SSPS、PGA和SSPS穩(wěn)定劑復(fù)合對(duì)飲料的穩(wěn)定性沒有太大的影響。由回歸模型得出響應(yīng)面試驗(yàn)的最佳提取條件為：Pectin888添加量為0.25%，PGA添加量為0.15%，SSPS添加量為0.25%時(shí)，黏度最高為18.04×10-3Pa·s。

2.2.3 最終優(yōu)化參數(shù)的確定及驗(yàn)證

圖14 Pectin888、PGA、SSPS對(duì)飲料黏度的影響

表9 使用Design Expert8.0.5.0設(shè)置RSM優(yōu)化中的自變量和相應(yīng)函數(shù)

該試驗(yàn)主要是讓3種穩(wěn)定劑進(jìn)行復(fù)配，使滅菌型乳酸菌飲料的Lumi斜率最小的同時(shí)使飲料的黏度最佳。由上述響應(yīng)面分析可知，Lumi斜率最小與黏度適宜的工藝條件并不一樣，因此使用Design-Exper8.0.5.0的數(shù)據(jù)優(yōu)化程序，通過組合得到的數(shù)據(jù)，最終確定出最佳的條件。對(duì)參數(shù)進(jìn)行以下的設(shè)定，見表9。

根據(jù)響應(yīng)面模型及表9的設(shè)定條件可以得到最優(yōu)的方案為：Pectin888為0.25%、PGA為0.15%、SSPS為0.19%時(shí)，預(yù)測的滅菌型乳酸菌飲料的Lumi斜率為0.2985，黏度為16.03×10-3Pa·s。對(duì)該條件進(jìn)行驗(yàn)證，得到滅菌型乳酸菌飲料的Lumi斜率為0.2985±0.002，黏度為(16.04±0.13)×10-3Pa·s，與回歸方程的預(yù)測值基本一致，驗(yàn)證了試驗(yàn)的合理性。

3 結(jié) 論

本文研究了Pectin88、PGA、SSPS 3種穩(wěn)定劑單獨(dú)使用和復(fù)合使用對(duì)滅菌型乳酸菌飲料穩(wěn)定性的影響。當(dāng)Pectin88添加量為0.5%時(shí)p H值最小，黏度相對(duì)較大，離心沉淀率、Lumi斜率、粒徑分布相對(duì)達(dá)到最小值；PGA添加量在0.2%時(shí)，穩(wěn)定性相對(duì)較好；SSPS添加量對(duì)Lumi斜率和粒徑基本沒有影響，隨著添加量的增加離心沉淀率逐漸減小，說明飲料的穩(wěn)定性增加。使用響應(yīng)面的復(fù)配優(yōu)化結(jié)果為：Pectin888為0.25%、PGA為0.15%、SSPS為0.19%時(shí)，滅菌型乳酸菌飲料的Lumi斜率為0.2985±0.002，黏度為(16.04±0.13)×10-3Pa·s。該試驗(yàn)為研究滅菌型乳酸菌飲料提供了一些理論依據(jù)。