咸味覺厭惡模型大鼠鼓索神經(jīng)對味覺刺激的電生理反應(yīng)特性*

李臘梅， 廖瑩瑩， 蔣恩社△

(1. 河南大學(xué)護理與健康研究所， 開封 475004； 2. 鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院， 鄭州 450007)

當(dāng)動物攝食一種新的味覺物質(zhì)，隨后伴隨著一種內(nèi)臟不適或者疾病，那么動物就會記憶這種味覺并減少或拒絕再次攝入這種味覺物質(zhì)，這種現(xiàn)象被稱作條件性味覺厭惡(conditioned taste aversion, CTA)。經(jīng)典的CTA模型可以通過口內(nèi)給予大鼠 0.1%糖精溶液和隨后腹膜內(nèi)注射0.15 mol/L的氯化鋰(LiCl)相結(jié)合建立起來。CTA是動物建立起來的一種學(xué)習(xí)與記憶的范式[1]，是動物在自然界中形成的一種為了避免攝入有害物質(zhì)而建立起來的一種適應(yīng)性自我保護機制。CTA是一種經(jīng)典的巴甫洛夫條件反射類型，但卻具有其自身的特殊性：條件刺激(the conditioned stimulus, CS)和非條件刺激(the unconditioned stimulus, US)的聯(lián)合學(xué)習(xí)僅結(jié)合一次就可以建立起對CS的CTA；CS和US之間的時間間隔可以長達幾個小時；CS和US之間的聯(lián)合學(xué)習(xí)在動物深麻狀態(tài)下也可以進行[2]。CTA的形成機制目前研究最多的是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)味覺相關(guān)核團內(nèi)神經(jīng)元的變化，比如孤束核、臂旁核和杏仁核等[3-5]。在CTA形成的過程中，傳導(dǎo)外周味覺信息到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的外周味覺神經(jīng)在CTA形成中發(fā)揮什么樣的作用？在CTA形成后，這些味覺傳入神經(jīng)對口內(nèi)給予的味覺刺激是否會發(fā)生電生理反應(yīng)的改變？是否是先有味覺傳入神經(jīng)對味覺信號編碼發(fā)生了改變才導(dǎo)致大腦味覺皮層對味覺條件刺激的感受發(fā)生了由喜愛到厭惡的轉(zhuǎn)變？這些問題目前尚不得而知，這也是本實驗探討的目的之一。

傳遞外周味覺信息到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)主要有鼓索神經(jīng)(chorda tympani, CT)、舌咽神經(jīng)和巖淺大神經(jīng)，其中CT和巖淺大神經(jīng)是面神經(jīng)的分支。CT在動物對咸味覺的感知中發(fā)揮著重要的作用，味覺神經(jīng)電生理實驗表明，在CT對口內(nèi)給予的五種基本味覺刺激溶液的反應(yīng)中，NaCl溶液口內(nèi)刺激誘發(fā)的CT反應(yīng)最為強烈[6]。先前的研究表明，咸味覺大部分是由Na+作用于味蕾內(nèi)味覺細胞頂端膜上的上皮鈉離子通道(epithelial Na+channel, ENaC)受體介導(dǎo)產(chǎn)生的[7]。咸味覺信息通過支配舌前2/3味蕾的CT傳導(dǎo)到中樞味覺信息的第一級換元站吻端孤束核。咸味覺信息在此加工整理后通過味覺其它核團進一步上傳到味覺皮質(zhì)，最終形成味覺。在味覺感覺的形成過程中，味覺信息會受到來自內(nèi)環(huán)境和內(nèi)臟信息等各種因素的調(diào)制，研究發(fā)現(xiàn)，在低鈉飲食引起大鼠機體缺鈉時，大鼠對口內(nèi)給予NaCl刺激的電生理反應(yīng)的特異性降低[8]。不適內(nèi)臟信息也會通過與味覺信息在核團內(nèi)的相互作用影響動物的味覺感受[9-11]。

CT作為咸味覺信息傳入最主要的外周味覺神經(jīng)，在大鼠條件性咸味覺厭惡建立后，其對口內(nèi)給予的咸味覺刺激和其他四種基本味覺刺激的電生理反應(yīng)特性是否會受到不適內(nèi)臟信息的調(diào)制而發(fā)生改變，尚未見到有關(guān)報道。研究表明CT中含有兩種類型的神經(jīng)纖維，一種為阿米洛利(amiloride所抑制；此種纖維對口內(nèi)給予NaCl刺激的反應(yīng)可被ENaC受體阻斷劑阿米洛利所抑制；另一種為非阿米洛利敏感性神經(jīng)纖維[12]。CT的這些特征為我們研究大鼠在條件性咸味覺厭惡形成后，其對味覺刺激的電生理反應(yīng)特性是否發(fā)生改變提供了有利條件。本實驗利用CT在體電生理實驗方法，探討了大鼠CTA形成后，CT對口內(nèi)給予的味覺刺激反應(yīng)特性的改變情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年雄性SD雄性大鼠，體重250～300 g，由河南省實驗動物中心提供，所有動物單籠飼養(yǎng)，室溫為21～24℃，光暗周期為12∶12 h，實驗前大鼠自由進食和飲用蒸餾水(distilled water, DW)。適應(yīng)環(huán)境1周后。將兩個帶有刻度的100 ml飲水瓶放置飼養(yǎng)籠前，間隔約5 cm，給予大鼠雙瓶供水。

1.2 實驗分組與處理

動物適應(yīng)環(huán)境后，對大鼠進行定時飲水習(xí)慣化訓(xùn)練，于每天10:00-10:30給予14只自由進食大鼠雙瓶蒸餾水(distilled water, DW)飲食，并每天交換雙瓶左右位置，18:00-18:30給予大鼠雙瓶DW飲食以補充水分，其它時間禁水。4 d飲水訓(xùn)練后依體重將大鼠分為條件性咸味覺厭惡模型組(CTA)和對照組(Ctrl)，每組7只。參照呂波等實驗中的方法建立大鼠對0.1 mol/L NaCl的條件性味覺厭惡[13]。簡言之，于實驗第1日10:00-10:30給予大鼠30 min 的0.1 mol/L NaCl (條件刺激)飲食，隨后給予CTA組大鼠2 ml 0.15 mol/L LiCl(100 mg/kg)腹腔注射一次，給予對照組大鼠2 ml生理鹽水腹腔注射一次。于第2日和第3日10:00-10:30測量兩組大鼠對0.1 mol/L NaCl和DW的飲用量。以上3 d中每天18:00-18:30給予雙瓶DW飲食以補充水分。第4日10:00-10:30測量兩組大鼠對0.1 mol/L NaCl和DW飲用量，計算兩組大鼠對0.1 mol/L NaCl嗜好率。之后對成功建立CTA模型大鼠和Ctrl大鼠分別進行CT電生理記錄實驗，觀察CT對系列濃度NaCl溶液、0.3 mol/L NaCl與0.1 mmol/L阿米洛利混合液和其他四種基本味覺刺激溶液的電生理反應(yīng)。

1.3 鼓索神經(jīng)電生理記錄

大鼠用2%戊巴比妥鈉(75 mg/kg體重)麻醉，行氣管插管，將大鼠頭部固定于大鼠頭頸部手術(shù)頭部固定儀上[14]。通過電子加熱墊調(diào)節(jié)和維持大鼠體溫于36～37℃。從大鼠左側(cè)頜面部切口，移除頜面部肌肉，在手術(shù)顯微鏡下使用玻璃分針尋找并小心游離頜面深部的鼓索神經(jīng)，于近鼓索神經(jīng)進入鼓泡入口處剪斷鼓索神經(jīng)，并剝離鼓索神經(jīng)斷端大約2 mm的髓鞘。將鼓索神經(jīng)斷端置于鉑銥記錄電極上，將另一個無關(guān)電極置于大鼠面部肌肉組織內(nèi)。詳細的鼓索神經(jīng)電生理記錄參照J(rèn)iang E等[15]發(fā)表的研究論文。本實驗采用成都泰盟軟件有限公司生產(chǎn)的生物信號采集與分析系統(tǒng)(BL-420F)觀察和記錄大鼠鼓索神經(jīng)對舌面部給予的不同味覺溶液的反應(yīng)。

1.4 味覺刺激及反應(yīng)記錄程序

利用液體灌流系統(tǒng)ALA-VC8 (Scientific Instruments, USA )將不同的味覺刺激溶液遞呈到大鼠舌面前部。給予大鼠兩個味覺刺激序列，下列味覺刺激名稱括號內(nèi)為濃度大小，濃度單位為mol/L。一個刺激序列為： NH4Cl (0.5)、 NaCl濃度系列 (0.03、0.1、0.3)、NaCl (0.3) +阿米洛利 (0.0001)、NH4Cl (0.5)；另一個味覺刺激序列為：NH4Cl (0.5)、鹽酸奎寧 (0.03)、蔗糖 (0.5)、谷氨酸鈉 (0.1)、檸檬酸 (0.1)、NH4Cl (0.5)。這些味覺溶液是味覺電生理研究中常用味覺刺激及適宜濃度。這里序列首尾給予的0.5 mol/L NH4Cl作為標(biāo)準(zhǔn)刺激，可以用來評估CT反應(yīng)的穩(wěn)定性，因為在文獻報道中，口內(nèi)給予0.5 mol/L NH4Cl刺激可以誘導(dǎo)CT產(chǎn)生強烈的反應(yīng)。阿米洛利 (amiloride)是一種上皮鈉通道(epithelial sodium channel，ENaC)阻斷劑，可以強烈抑制CT對口內(nèi)給予的NaCl的反應(yīng)。所有溶液給予的速度為0.3 ml/s，每一個味覺刺激給予20 s，在每個刺激前后皆用蒸餾水沖洗20 s，之后停止給予任何刺激，讓大鼠休息60 s，再開始下一個味覺刺激。序列首尾給予的NH4Cl誘發(fā)的CT反應(yīng)的強度相差大于15%的數(shù)據(jù)舍棄，不進入統(tǒng)計分析。每種味覺刺激誘導(dǎo)的CT反應(yīng)相對值按照以下公式進行計算：味覺刺激誘發(fā)的CT反應(yīng)相對值=(前10 s味覺刺激反應(yīng)值-味覺刺激前10 s水沖洗反應(yīng)值)/平均NH4Cl凈反應(yīng)值，平均NH4Cl凈反應(yīng)值=[(第1個NH4Cl 前10 s反應(yīng)值-味覺刺激前10 s水沖洗反應(yīng)值) + (第2個NH4Cl 前10 s反應(yīng)值-味覺刺激前10 s水沖洗反應(yīng)值)]/2。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析。用重復(fù)測量的方差分析分析兩組在不同濃度的NaCl之間的差別，用獨立樣本t檢分析兩組之間其他四種基本味覺的差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠條件性咸味覺厭惡模型建立

將大鼠對CS嗜好率小于40%作為大鼠CTA建立成功的標(biāo)志，CS嗜好率=CS飲用量/(CS+DW)飲用量。我們的數(shù)據(jù)顯示CS和US結(jié)合后第24小時、第48小時和第72小時， CTA組每只大鼠對0.1 mol/L NaCl的喜好率在10%～20%之間，而對照組每只大鼠對0.1 mol/L NaCl的喜好率皆大于40% (表1)，提示CTA組大鼠條件性咸味覺厭惡模型建立成功。

Group24 h after CS-US association48 h after CS-US association72 h after CS-US associationCTA0.11±0.02**0.12±0.03**0.14±0.03**Ctrl0.44±0.040.43±0.050.49±0.02

CTA: Conditioned taste aversion; Ctrl: Control； CS: Conditioned stimulus; US: Unconditioned stimulus

**P<0.01vsCtrl group

2.2 大鼠CT對不同濃度的NaCl電生理反應(yīng)

本實驗以CT對于首尾兩次給予0.5 mol/L NH4Cl反應(yīng)的平均值作為標(biāo)準(zhǔn)參考值，求得CT對各種味覺刺激電生理反應(yīng)的相對神經(jīng)反應(yīng)幅度、相對神經(jīng)放電個數(shù)和相對神經(jīng)反應(yīng)曲線下面積，用這三個測量指標(biāo)來代表大鼠CT對各種味覺刺激反應(yīng)的強度，分析CTA組與Ctrl組大鼠CT對各種味覺刺激反應(yīng)的差異。兩組大鼠CT對口內(nèi)給予的系列濃度NaCl反應(yīng)的結(jié)果如圖1所示，重復(fù)測量統(tǒng)計分析結(jié)果表明，在反映神經(jīng)反應(yīng)強度的三個指標(biāo)(相對神經(jīng)反應(yīng)幅度、相對神經(jīng)放電個數(shù)和相對神經(jīng)反應(yīng)曲線下面積)上，兩組大鼠CT對于系列濃度的NaCl反應(yīng)均具有很好的濃度反應(yīng)依賴性(P<0.01)，但是CTA組大鼠和對照組大鼠之間相比，CT對不同濃度的NaCl刺激的反應(yīng)在三個反應(yīng)指標(biāo)上沒有差異(P>0.05)，并且分組和濃度兩個因素之間沒有交互作用 (P>0.05，表2)。這些結(jié)果說明，大鼠對NaCl味覺刺激是否產(chǎn)生條件性味覺厭惡，不影響CT對NaCl的反應(yīng)大小，并且CT對NaCl反應(yīng)的濃度依賴性不受分組因素的影響。

Fig.1The relative amplitude (A), number of spikes (B) and AUC (C) of CT electrophysiological responses to different concentrations of NaCl in the rat of CTA and Ctrl groups. Here the magnitude of CT responses to different concentration of NaCl was calculated relative to the CT response to 0.5 mol/L NH4Cl which was taken as the standard (n=7)

CTA: Conditioned taste aversion; Ctrl: Control; AUC: Area under the curve

Tab.2Summary of ANOVA results for CT responses to series of NaCl concentration across groups (n=7)

ResponsesAmplitudeFPNumber of spikesFPAUCFPGroup0.000.980.320.580.110.73Concentration199.10<0.001119.50<0.001325.21<0.001Interaction0.170.850.130.900.500.60

2.3 阿米洛利對大鼠口內(nèi)給予0.3 mol/L NaCl 刺激誘發(fā)的CT反應(yīng)的影響

阿米洛利是舌上皮Na+通道的特異性阻斷劑，它可以顯著抑制CT對口內(nèi)給予的NaCl溶液刺激的反應(yīng)。實驗結(jié)果表明，兩組大鼠口內(nèi)給予0.3 mol/L NaCl和0.1 μmol/L 阿米洛利混合液可以顯著抑制CT對口內(nèi)給予0.3 mol/L NaCl溶液的反應(yīng)強度 (包括相對神經(jīng)反應(yīng)幅度、相對神經(jīng)放電個數(shù)和相對神經(jīng)反應(yīng)曲線下面積三個反應(yīng)指標(biāo)) (P< 0.01)。而在反映CT反應(yīng)強度的三個指標(biāo)上，兩組大鼠CT對0.3 mol/L NaCl或0.3 mol/L NaCl + 0.1 μmol/L阿米洛利的反應(yīng)強度都沒有顯著差異(圖2)。這一方面說明本實驗記錄到的信號是CT對NaCl的反應(yīng)信號，而不是對機械和溫度等的反應(yīng)，另一方面也說明CTA組大鼠對咸味覺的厭惡并沒有影響到CT的電生理反應(yīng)特性。

Fig.2The relative amplitude(A), number of spikes (B) and AUC (C) of CT electrophysiological responses to 0.3 mol/L NaCl with or without 0.1mM amiloride in the two groups of rats. Here the magnitude of CT responses to 0.3 mol/L NaCl or to 0.3 mol/L NaCl mixed with 0.1m mol/L Amiloride was calculated relative to the CT responses to 0.5 mol/L NH4Cl which was taken as the standard (n=7)

CTA: Conditioned taste aversion; Ctrl: Control; Ami, amiloride; AUC: Area under the curve

**P<0.01vs0.3 mol/L NaCl

2.4 兩組大鼠CT對其他四種基本味覺刺激的反應(yīng)

支配大鼠舌前2/3味蕾的CT不僅對口內(nèi)給予的咸味覺刺激有較強的反應(yīng)，而且對口內(nèi)給予的其他四種基本的味覺刺激也都有強弱不等的反應(yīng)，其中CT對0.1 mol/L的檸檬酸刺激反應(yīng)較為強烈，其次是0.1 mol/L 谷氨酸單鈉、0.5 mol/L蔗糖，CT對0.03 mol/L的奎寧反應(yīng)較弱。圖3是1只CTA組大鼠和1只對照組大鼠CT對系列濃度NaCl、0.3 mol/L NaCl + 0.1m mol/L amiloride、0.5 mol/L蔗糖、0.1 mol/L檸檬酸、0.03 mol/L奎寧和0.1 mol/L谷氨酸單鈉的代表性反應(yīng)曲線圖。從反應(yīng)CT對味覺刺激反應(yīng)強度的三個指標(biāo)上來看，兩組大鼠CT對0.1 mol/L檸檬酸、0.5 mol/L蔗糖、0.03 mol/L奎寧和0.1 mol/L谷氨酸單鈉沒有顯著性差異(P>0.05)。提示大鼠咸味覺厭惡形成后，CT對其他酸、甜、苦、鮮四種基本味覺刺激的電生理反應(yīng)特性也沒有發(fā)生改變(圖4)。

Fig.3The representative traces of rectified and integrated CT responses to a series of NaCl concentration (A) and four basic taste stimuli (B) from 2 adult rats with one from CTA group and the other one from control group

CTA: Conditioned taste aversion; Ami: Amiloride; MSG: Monosodium glutamate; CA: Citric acid

Fig.4The relative amplitude (A), number of spikes (B) and AUC (C) of CT electrophysiological responses to the other four taste stimuli in the two groups of rats. Here the magnitude of CT responses to 0.5 mol/L sucrose, 0.1 mol/L CA, 0.03 mol/L quinine, and 0.1 mol/L MSG was calculated relative to the CT responses to 0.5 mol/L NH4Cl which was taken as the standard (n=7)

CTA: Conditioned taste aversion; Ctrl: Control; AUC: Area under the curve; CA: Citric acid; MSG: Monosodium glutamate

3 討論

鼓索神經(jīng)作為NaCl的優(yōu)勢反應(yīng)神經(jīng)，在咸味覺信息從外周到中樞的傳遞過程中發(fā)揮著重要作用。CT切除可以顯著升高大鼠和小鼠對NaCl的覺察閾值[16,17]，并削弱大鼠對NaCl和KCl的分辨能力[18]。然而在大鼠條件性咸味覺厭惡建立與維持過程中，傳遞外周咸味覺信息的CT扮演著什么角色至今還不清楚。阿米洛利是舌上皮味覺細胞膜鈉離子通道阻斷劑，可強烈抑制CT對NaCl刺激的反應(yīng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠條件性咸味覺厭惡建立后，其CT對不同濃度的NaCl刺激誘發(fā)的反應(yīng)依然具有濃度依賴性，并且阿米洛利可以強烈抑制CTA大鼠CT對NaCl刺激的反應(yīng)。CTA大鼠CT對其他四種基本味覺刺激的反應(yīng)特性也沒有發(fā)生變化，本研究從另一個方面證明，在CTA形成過程中，外周味覺神經(jīng)沒有參與對味覺信息的編碼，大鼠CTA形成主要發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

CTA的建立是一個與動物記憶有關(guān)的聯(lián)想學(xué)習(xí)過程。在此過程中，外周味覺神經(jīng)僅僅起到了味覺信息的傳遞作用，更復(fù)雜的味覺信息和內(nèi)臟不適刺激的相互作用發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)。腦干孤束核和臂旁核是處理味覺信息和內(nèi)臟信息的重要核團。神經(jīng)元c-Fos蛋白表達是外周刺激誘發(fā)腦內(nèi)神經(jīng)元激活的生物標(biāo)記物之一，味覺刺激和內(nèi)臟刺激對腦內(nèi)孤束核和臂旁核神經(jīng)元c-Fos表達影響的研究表明，甜味覺刺激和不適內(nèi)臟刺激在孤束核尾端內(nèi)臟亞核和吻端味覺亞核可以相互減弱對方的作用[9]；臂旁核的外部內(nèi)側(cè)亞核參與了味覺信息和內(nèi)臟信息相互作用的處理過程[10]。核團損毀實驗表明，PBN損毀大鼠不能形成CTA[19]，這可能是因為PBN損毀后，味覺條件刺激和非條件刺激不能在此進行信息處理，大鼠不能進行聯(lián)想學(xué)習(xí)的原因。前腦杏仁核也是動物處理味覺信息和內(nèi)臟信息的重要核團，在CTA形成中，在大鼠對味覺條件刺激由喜愛到厭惡的情感轉(zhuǎn)變過程中，發(fā)揮著重要的作用。有研究表明電損毀杏仁基底外側(cè)核的大鼠不能建立CTA，提示杏仁基底外側(cè)核在對CTA的記憶維持方面具有重要作用[5]。另外在味覺信息從外周到中樞的傳遞過程中，大鼠對攝入物質(zhì)的味覺感受還受到眾多因素的影響，味覺神經(jīng)和味覺核團對味覺信息的編碼會受到內(nèi)環(huán)境因素和內(nèi)臟信息的影響。例如，體內(nèi)缺鈉大鼠對口內(nèi)給予NaCl刺激的電生理反應(yīng)的特異性降低[8]。損毀大鼠杏仁中央核降低大鼠對NaCl、檸檬酸及鹽酸奎寧溶液的攝入量，提示杏仁中央核可通過改變大鼠對味覺刺激欣快閾值的評估參與對味覺攝食的調(diào)控[20]。動物攝食后引發(fā)的內(nèi)臟信息通過迷走神經(jīng)傳入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并在中樞與味覺信息發(fā)生作用，迷走神經(jīng)切除可顯著降低大鼠對甜味覺溶液攝食[21]，而且給予大鼠內(nèi)臟不適刺激也顯著影響大鼠對5種基本味覺溶液的攝食[11]。本研究發(fā)現(xiàn)， CTA大鼠在清醒狀態(tài)下對0.1 mmol/L NaCl攝食量和嗜好率顯著下降，即CTA大鼠對0.1 mmol/L NaCl發(fā)生了由喜愛到厭惡 (拒絕攝食) 的轉(zhuǎn)變，而在麻醉狀態(tài)下其鼓索神經(jīng)對系列濃度的NaCl電生理反應(yīng)特性沒有發(fā)生改變，這提示在條件性味覺厭惡形成中，CTA大鼠外周味覺神經(jīng)對味覺刺激的反應(yīng)沒有受到內(nèi)臟不適刺激的影響， CTA大鼠對味覺刺激由喜愛到厭惡的轉(zhuǎn)變主要是受到中樞神經(jīng)系統(tǒng)活動的影響。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是如何參與CTA大鼠對味覺刺激由喜愛到厭惡的轉(zhuǎn)變需要進一步的研究。這些結(jié)果從側(cè)面證明了CTA形成機制發(fā)生在中樞，而外周神經(jīng)作為味覺信息傳入通路沒有參與大鼠CTA的形成。然而CTA形成的機制及其復(fù)雜，中樞神經(jīng)系統(tǒng)是如何參與CTA形成的，還有待進一步的深入研究。

鼓索神經(jīng)作為咸味覺信號上傳至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要傳遞通路，其功能的完整性是大鼠建立條件性咸味覺厭惡不可缺少的因素。在大鼠咸味覺厭惡建立的后，給予大鼠咸味覺刺激，大鼠對咸味覺溶液的攝食減少。由于大鼠CT對咸味覺刺激的反應(yīng)特性沒有發(fā)生改變，CT傳遞的仍是舌上皮味覺細胞產(chǎn)生的咸味覺信息，外周味覺神經(jīng)并沒有參與味覺信息編碼的改變，大鼠感受到的仍舊是咸味感覺，但是大鼠對咸味刺激誘發(fā)的情感卻由喜愛感受轉(zhuǎn)變到厭惡感受，這種對味覺刺激復(fù)雜的情感轉(zhuǎn)變主要發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)。