• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    蘋(píng)果多酚對(duì)野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠肺血管重構(gòu)的作用和機(jī)制*

    2019-07-04 01:03:34章書(shū)豪邵思銘陳方政陳羅薇項(xiàng)歆惠袁琳波
    關(guān)鍵詞:平滑肌肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞

    章書(shū)豪, 邵思銘, 陳方政, 祝 靜, 陳羅薇, 王 恒, 項(xiàng)歆惠, 袁琳波

    (1. 溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院, 2. 溫州醫(yī)科大學(xué)仁濟(jì)學(xué)院, 3. 溫州醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院, 4. 溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室, 浙江 溫州 325000 )

    肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一類以肺動(dòng)脈壓力進(jìn)行性升高為特點(diǎn)的致命性肺血管疾病,嚴(yán)重的限制了患者的運(yùn)動(dòng)耐受性,且可能會(huì)發(fā)展為心力衰竭、慢性阻塞性肺病等多種心肺疾病[1-2]。肺動(dòng)脈高壓的形成主要和肺血管收縮和重構(gòu)有關(guān),但是具體發(fā)生機(jī)制目前仍不清楚[3]。有研究發(fā)現(xiàn),在肺動(dòng)脈高壓中細(xì)胞受到炎癥刺激,COX-2的含量上升,引起炎癥部位PEG2、PGI2和PGE1含量增加,導(dǎo)致肺動(dòng)脈血管炎癥反應(yīng)和組織損傷[4]。在肺動(dòng)脈高壓中使用COX-2抑制劑和下調(diào)前列腺素,能夠調(diào)控血管內(nèi)細(xì)胞活性[5],因此COX-2可以作為多種抗炎癥藥物靶點(diǎn)。

    蘋(píng)果多酚(apple polyphenol,APP)是從蘋(píng)果中提取的次生植物代謝產(chǎn)物,能通過(guò)ros/MAPK/NF-κB通路在抗氧化和抗炎癥中發(fā)揮重要作用[6]。在心血管疾病研究中發(fā)現(xiàn),蘋(píng)果多酚能夠起到緩解動(dòng)脈粥樣硬化[7],激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS),從而改善內(nèi)皮細(xì)胞效應(yīng),降低肺部血壓[8]。但是目前鮮有研究其在肺動(dòng)脈高壓的作用。在我們的研究中,發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果多酚有助于緩解炎癥反應(yīng)、血管收縮和平滑肌細(xì)胞的增殖作用,從而能夠改善肺動(dòng)脈高壓。

    1 材料與方法

    1.1 試劑與設(shè)備

    蘋(píng)果多酚購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司,野百合堿(MCT)購(gòu)自上海同田生物技術(shù)股份有限公司。COX-2抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司, eNOS抗體和Abcam購(gòu)自Cell Signaling Technology(Danvers, MA,USA),PowerLab 4/35(澳大利亞AD Instruments),生理壓力傳感器(BL—Newcentmry,成都泰盟科技有限公司),CO檢測(cè)器(ml313C, AD儀器),NO測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

    實(shí)驗(yàn)采用雄性SD大鼠,體重(180~200 g),由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(20140038)。購(gòu)入后普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,飼養(yǎng)間溫度22~25℃, 相對(duì)濕度50%~60%。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院所制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用指南》,實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過(guò)溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)會(huì)審批。大鼠采用隨機(jī)編號(hào)分為四組(Con組,MCT組,APP組,MCT+APP組),每組9只(1)Con組:大鼠皮下注射生理鹽水,作為對(duì)照組。(2)APP組:隔天按20 mg/kg的劑量腹腔注射蘋(píng)果多酚。(3)MCT組:按60 mg/kg劑量皮下注射MCT。(4)MCT+APP組:皮下注射60 mg/kg劑量MCT,隔天按20 mg/kg劑量腹腔注射APP,所有處理持續(xù)3周[9]。

    1.3 大鼠體重與3周存活率的測(cè)定

    各組大鼠于處理前和處理后一周、兩周、三周時(shí)分別進(jìn)行稱重,并統(tǒng)計(jì)3周后各組存活大鼠數(shù)量,計(jì)算存活率。

    1.4 肺動(dòng)脈動(dòng)力學(xué)測(cè)量

    處理三周后,大鼠用3 ml/1 kg的水合氯醛麻醉,暴露右頸外靜脈,行頸外靜脈插管術(shù),連接血壓壓力換能器至powerlab生物信號(hào)采集分析系統(tǒng),對(duì)肺動(dòng)脈壓力(mean pulmonary artery pressure,mPAP)進(jìn)行讀值。用熱稀釋法檢測(cè)心輸出量(cardiac output, CO),用CO檢測(cè)器(ml313C, AD儀器)處理數(shù)據(jù)。PVR用公式計(jì)算:PVR=mPAP/CO

    1.5 右心室肥厚指數(shù)測(cè)量

    大鼠處死解剖,將心臟沿著心室邊緣和室間隔將右心室切開(kāi)。用生理鹽水略洗,除去多余心肌組織,用濾紙吸干其表面水分,稱量右心室、左心室、室間隔(left ventricle+ Interventricular septum, LV+S)的重量,右心室肥大指數(shù)計(jì)算公式:RV /(LV + S)×100%。

    1.6 肺血管結(jié)構(gòu)和形態(tài)的組織病理學(xué)觀察

    將大鼠肺組織脫水透明,浸蠟包埋,65℃烘箱中烘干,二甲苯中脫蠟兩次,在濃度分別為100%、95% 、90%、80%、70%的酒精中依次浸泡3 min,再經(jīng)蒸餾水轉(zhuǎn)入蘇木精染色。通過(guò)1%鹽酸乙醇進(jìn)行分化。再將切片用伊紅染色并用蒸餾水洗滌后用70%,85%,95%,100%濃度梯度的乙醇脫水。二甲苯透明化后用中性膠固定。在光學(xué)顯微鏡下觀察肺血管結(jié)構(gòu)和形態(tài),以評(píng)估組織病理學(xué)變化。

    1.7 肺動(dòng)脈血管環(huán)外周長(zhǎng)比值(WT%),肺小血管管壁面積和管總面積比值(WA%)測(cè)量

    采用病理圖像分析軟件 Image-pro Plus,測(cè)量肺動(dòng)脈外徑(the diameter of external vessal, ED),內(nèi)徑(the diameter of internal vessal, ID)和內(nèi)側(cè)壁厚度(medial wall thickness, MWT)。 肺動(dòng)脈介質(zhì)厚度(pulmonary arterial media thickness, PAMT)可以通過(guò)以下公式計(jì)算:PAMT = 2×MWT / ED,計(jì)算壁面積(WA),總面積(total area, TA),血管內(nèi)腔面積(lumen area, LA)。計(jì)算WT%公式:WT%= 2×PAMT / ED×100%,計(jì)算WA%公式:WA%=(TA-LA)/ TA×100%。

    1.8 通過(guò)Q-PCR檢測(cè)基因表達(dá)

    將各組肺組織樣品剪成小塊后碾磨,加入TRIzol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)分離出全部RNA。使用GoScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega,Madison,WI,USA)將RNA用作模板以產(chǎn)生cDNA合成。用于RT-PCR的引物序列如表1:

    Tab. 1 The primer sequences used for RT-PCR

    對(duì)于每個(gè)樣品,三次進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)PCR產(chǎn)量。

    1.9 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)COX-2和eNOS水平

    通過(guò)10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠,切除肺組織。分離肺主動(dòng)脈,剪開(kāi)動(dòng)脈,內(nèi)膜面貼于培養(yǎng)皿置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱0.5 h后加含15%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng),第5日內(nèi)皮細(xì)胞爬出后摘掉除組織塊,取內(nèi)皮細(xì)胞放入EP管中,研磨后加入200 μl細(xì)胞裂解液,再次研磨置于離心機(jī)中14 000g離心15 min,收集上清液。酶標(biāo)儀檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度,加上樣緩沖液煮沸保存。制備SDS-PAGE凝膠。通過(guò)10%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。在通過(guò)多克隆抗COX-2(或抗eNOS)檢測(cè)COX-2(或eNOS)后,使用ECL成像系統(tǒng)顯示條紋灰度級(jí)來(lái)測(cè)量COX-2(或eNOS)的含量。

    1.10 內(nèi)皮細(xì)胞中NO水平檢測(cè)

    內(nèi)皮細(xì)胞分離方法同上,使用NO測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)來(lái)定量測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)NO水平,所有測(cè)量均遵循制造商方案進(jìn)行。

    1.11 大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

    用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后,分離肺組織中的肺動(dòng)脈,在顯微鏡下剝離肺動(dòng)脈內(nèi)外膜,將肺動(dòng)脈中膜剪為1 mm×1 mm×1 mm的組織塊,接種于25 ml培養(yǎng)瓶中,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育。每4~6 d更換培養(yǎng)液1次(含15%胎牛血清的DMEM/F12)。16 d后細(xì)胞爬出,呈典型峰谷狀分布。經(jīng)抗α-actin單克隆抗體免疫組化鑒定,為純度97%以上的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。經(jīng)胰酶消化傳代培養(yǎng),采用生長(zhǎng)良好的4~7代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.12 平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2 +水平檢測(cè)

    通過(guò)Becton Dickinson FACS Calibur流式細(xì)胞儀,用Ca2++(-)敏感性熒光染料Fluo-3 /乙酰氧基甲酯(Fluo-3 / AM)測(cè)定平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平。使用PerkinElmer LS 55熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光值,每1分鐘激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)為488 nm和526 nm。使用以下等式,用fluo-3熒光強(qiáng)度計(jì)算平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+:[Ca2+] i = Kd [(F-Fmin)/(F max -F)],其中Kd=400 nmol/L。通過(guò)添加0.1%Triton X-100測(cè)定最大Fluo-3熒光強(qiáng)度(Fmax),通過(guò)加入5 mmol/L EGTA抑制Fluo-3熒光測(cè)定最小熒光強(qiáng)度(Fmin)。F是在不添加Triton-X-100或EGTA的情況下測(cè)量的熒光值。

    1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 APP對(duì)MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠的體重和存活率的影響

    在建模和治療的3周中,Con組,APP組和APP + MCT組的平均體重增加,而MCT組的平均體重明顯減少。在治療結(jié)束時(shí),MCT組的平均值低于Con組,APP組和APP + MCT組。 MCT + APP組的存活率高于MCT組,Con組和APP組的100%存活率。結(jié)果表明APP能夠提高大鼠存活率和體重(表2)。

    2.2 APP對(duì)MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺血流動(dòng)力學(xué)的影響

    與Con組和APP組相比,MCT組的mPAP和PVR顯著增加(P<0.05),這意味著成功建立PAH模型。 與MCT組相比,MCT + APP組的mPAP和PVR顯著降低(P<0.05),顯示APP在治療MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠有顯著作用。APP組與Con組結(jié)果相同,說(shuō)明APP無(wú)明顯副作用(表3)。

    2.3 APP對(duì)MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠右心室重塑的影響

    與Con組和APP組相比,MCT組的RVHI顯著升高(P<0.05)。與MCT組相比,MCT + APP組的RVHI顯著降低(P<0.05),表明APP對(duì)MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠右心室肥大有抑制作用(表3)。

    Tab. 2 Effects of APP on body weight and survival rate of MCT-induced PAH rats (g, n=9)

    *P<0.05,**P<0.01vsCon group;#P<0.05,##P<0.01vsMCT group

    GroupmPAPΔPVRRVHICon15.84±2.48213.37±30.290.17±0.03APP15.09±1.49212.93±27.980.16±0.03MCT56.49±7.71**698.68±80.69**0.50±0.09**APP+MCT39.53±8.85##498.59±115.32##0.35±0.10#

    *P<0.05,**P<0.01vsCon group;#P<0.05,##P<0.01vsMCT group

    2.4 APP對(duì)MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺動(dòng)脈重構(gòu)的影響

    組織鏡檢結(jié)果顯示Con組和APP組肺動(dòng)脈壁平滑且內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù),平滑肌細(xì)胞無(wú)異常增厚現(xiàn)象,大多數(shù)肺泡壁完整。MCT組內(nèi)皮細(xì)胞不連續(xù),且有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺動(dòng)脈中層有10~15層的平滑肌,血管出現(xiàn)明顯增厚和重構(gòu)現(xiàn)象。在MCT + APP組中,內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)完整,動(dòng)脈中層8~12層平滑肌APP治療緩解了MCT對(duì)肺組織的結(jié)構(gòu)破壞,抑制了平滑肌細(xì)胞增厚(圖1A)。 MCT組的WT% (40.87%±7.58%)和WA%(82.00%±11.80%)顯著高于Con組的WT%(13.93%±3.00%)和WA%(59.00%±10.90%,P<0.05,圖1B和C),MCT + APP組的WT%(25.36%±4.51%)和WA% (66.00%±10.90%)顯著低于MCT組(P<0.05,圖1B和C)),結(jié)果表明APP能夠緩解MCT誘導(dǎo)的血管重構(gòu)。

    2.5 APP對(duì)MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺組織COX-2 和炎癥因子表達(dá)的影響

    MCT組中MPO ,IL-1 ,IL-6 ,TNF-α表達(dá)顯著高于Con組和APP組中的炎性因子表達(dá)(P<0.05,圖2A,B和C)。 APP可緩解MCT引起的肺組織炎癥,因?yàn)镸CT + APP組MPO ,IL-1,IL-6 ,TNF-α表達(dá)明顯低于MCT組(P<0.05,圖2A,B和 C)。MCT組的COX-2表達(dá)(3.483±0.671)顯著高于Con組中的表達(dá),而MCT + APP組的COX-2表達(dá)(1.815± 0.215)顯著低于MCT組(P<0.05,圖2E),結(jié)果表明APP能夠抑制炎癥反應(yīng)。

    Fig.1The effects of APP on the morphological and structural changes of pulmonary arterioles in the rats

    A: Results of HE staining in rat lung tissue(× 200) ; B: Percentage of wall thickness to vascular diameter (WT%); C: Percentage of wall area to total vascular area (WA%).n=9

    *P<0.05,**P<0.01vsMCT group

    Fig.2The effects of APP on the expressions of MPO, IL-1, IL-6, TNF-α and COX-2 in the lung tissues(n=9)

    A,B,C,D: Qrt-PCR results of MPO, IL-1, IL-6 and TNFα expressions in rats; E: Western blot results of COX-2 expression

    *P<0.05,**P<0.01vsMCT group

    2.6 APP對(duì)肺內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)eNOS表達(dá)及NO合成和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2 +濃度的影響

    MCT組的肺內(nèi)皮細(xì)胞NO合成水平(26.887±9.897)μmol/ L顯著低于Con組和APP組(55.777±9.823)μmol/ L(P<0.05,圖3A)。與MCT組相比,MCT + APP組肺內(nèi)皮NO合成水平(42.161± 3.948)μmol/ L明顯升高(P<0.05,圖3A)。同時(shí),四組eNOS表達(dá)量顯示出同樣的結(jié)果。MCT組的eNOS表達(dá)(0.234±0.0705)顯著低于Con組(P< 0.05,圖3B),MCT + APP組(0.545±0.154)顯著高于MCT組(P<0.05,圖3B)。MCT刺激和APP治療也引起了四組細(xì)胞內(nèi)Ca2 +濃度差異。MCT組的平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2 +濃度顯著高于Con組和APP組(P<0.05,圖3C和D)。與MCT組相比,MCT + APP組顯著降低(P<0.05,圖3C和D)。這些結(jié)果表明APP可以緩解MCT造成的內(nèi)皮細(xì)胞eNOS表達(dá)下調(diào)的效應(yīng),同時(shí)可以降低肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。

    Fig.3The effects of APP on the protein expression of eNOS and concentration of NO in endothelial cells and Ca2 +in pulmonary artery smooth muscle cells(n=9)

    A: NO synthesis ofendothelial cells; B: eNOS expression of endothelial cells; C: The curves of intracellular Ca2+concentration varying along with time; D: Intracellular Ca2+concentration levels differed in pulmonary arterial smooth muscle cells

    *P<0.05,**P<0.01vsCon group

    3 討論

    肺血管的收縮和重構(gòu)是各種病理類型肺動(dòng)脈高壓發(fā)生發(fā)展的共同環(huán)節(jié)[10]。目前研究認(rèn)為炎癥反應(yīng)會(huì)引起肺血管收縮和重構(gòu)的產(chǎn)生。一方面炎癥因子的過(guò)度表達(dá)會(huì)改變平滑肌細(xì)胞內(nèi)代謝通路關(guān)鍵酶的含量,誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞過(guò)度增殖,血管腔狹窄,導(dǎo)致肺血管阻力升高[11]。另一方面炎癥因子的釋放,白細(xì)胞的聚集誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷和凋亡,上調(diào)平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2 +[12]。胞漿內(nèi)游離的Ca2 +[(Ca2 +)i]是肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMC)收縮,分化和增殖的關(guān)鍵作用因子,Ca2 +上調(diào)會(huì)導(dǎo)致血管重構(gòu)的發(fā)生[13],兩者相互作用導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓的形成。同時(shí),COX-2作為COX家族的同工酶,其在正常細(xì)胞中的含量極低。但在炎癥因子的刺激下,COX-2會(huì)過(guò)度表達(dá)并上調(diào)炎癥反應(yīng)中關(guān)鍵酶含量和活性。因此COX-2是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵指標(biāo)[14]。COX-2也被認(rèn)為是抗炎藥物的治療靶點(diǎn)[15]。

    蘋(píng)果多酚是一種提取自蘋(píng)果的多酚類物質(zhì),以往研究發(fā)現(xiàn)其具有很強(qiáng)的抗炎活性[15]。在我們的實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果多酚不僅可以通過(guò)抑制炎癥因子COX-2和IL-1,IL-6,TNF-α,MPO 的表達(dá),減輕炎癥反應(yīng)和血管壁內(nèi)白細(xì)胞聚集。還可以通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞合成eNOS,釋放NO,起到緩解血管收縮和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。保持血管壁內(nèi)皮細(xì)胞的完整,能夠通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞,胞間信號(hào)傳導(dǎo)降低平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2 +含量,抑制平滑肌細(xì)胞增殖,從而逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu),改善血液動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。此外,還有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),蘋(píng)果多酚能夠通過(guò)NF-κB通路減輕內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)[16],介導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡,于在心血管疾病中,蘋(píng)果多酚還能夠通過(guò)抑制ox-LDL誘導(dǎo)MAPK的激活預(yù)防早期動(dòng)脈粥樣硬化[17]。

    我們的研究發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果多酚主要通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)NO和Ca2 +,保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞,抑制平滑肌細(xì)胞增殖,來(lái)逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)過(guò)程,并且沒(méi)有副作用。目前還有研究指出蘋(píng)果多酚能夠通過(guò)代謝途徑和其他炎癥通路,抑制肺平滑肌細(xì)胞增殖,但具體機(jī)制尚不清楚,仍有待研究。但其是天然植物提取物,易提取純化,且無(wú)明顯毒副作用,具有良好的廣泛應(yīng)用前景。

    猜你喜歡
    平滑肌肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞
    81例左冠狀動(dòng)脈異常起源于肺動(dòng)脈臨床診治分析
    肺動(dòng)脈肉瘤:不僅罕見(jiàn)而且極易誤診
    淺議角膜內(nèi)皮細(xì)胞檢查
    原發(fā)性腎上腺平滑肌肉瘤1例
    喉血管平滑肌瘤一例
    雌激素治療保護(hù)去卵巢對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的初步機(jī)制
    腸系膜巨大平滑肌瘤1例并文獻(xiàn)回顧
    細(xì)胞微泡miRNA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)控
    體外膜肺氧合在肺動(dòng)脈栓塞中的應(yīng)用
    咽旁巨大平滑肌肉瘤一例MRI表現(xiàn)
    麻豆成人av视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 在线观看国产h片| 春色校园在线视频观看| 亚洲av不卡在线观看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲精品自拍成人| 少妇的逼好多水| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 另类精品久久| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 久久久久久久久久久久大奶| 多毛熟女@视频| 五月天丁香电影| 午夜福利视频在线观看免费| 国产男女超爽视频在线观看| 视频区图区小说| 观看美女的网站| 国产精品一区www在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 男女国产视频网站| 久久精品国产亚洲网站| 欧美人与善性xxx| 这个男人来自地球电影免费观看 | 极品少妇高潮喷水抽搐| 欧美日本中文国产一区发布| 久久精品国产自在天天线| 亚洲情色 制服丝袜| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产色婷婷99| 中文天堂在线官网| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久久久网色| 久久久精品免费免费高清| 在线看a的网站| 爱豆传媒免费全集在线观看| 熟女电影av网| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲综合色惰| 亚洲色图综合在线观看| 欧美日韩av久久| 91精品国产九色| av专区在线播放| 久久久久国产网址| 两个人的视频大全免费| 久久久亚洲精品成人影院| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲国产精品专区欧美| 在线观看三级黄色| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 欧美激情国产日韩精品一区| 国产精品.久久久| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 欧美精品亚洲一区二区| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲在久久综合| 黄片无遮挡物在线观看| 免费观看无遮挡的男女| 自线自在国产av| 女性生殖器流出的白浆| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 免费观看无遮挡的男女| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 99精国产麻豆久久婷婷| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产精品久久久久成人av| 亚洲第一av免费看| 国产免费福利视频在线观看| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲五月色婷婷综合| 熟女av电影| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 男女高潮啪啪啪动态图| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产成人一区二区在线| 观看av在线不卡| 亚洲,一卡二卡三卡| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 99国产综合亚洲精品| 亚洲伊人久久精品综合| 国产片特级美女逼逼视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 在线播放无遮挡| 超色免费av| 人人澡人人妻人| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 成人国产麻豆网| 国产成人a∨麻豆精品| 纯流量卡能插随身wifi吗| 看免费成人av毛片| 爱豆传媒免费全集在线观看| 在线 av 中文字幕| 亚洲在久久综合| 国产国语露脸激情在线看| 丝袜美足系列| 国产高清三级在线| 久久久午夜欧美精品| 亚洲国产精品一区三区| 免费看av在线观看网站| 久久国产精品大桥未久av| 七月丁香在线播放| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产毛片在线视频| 99热网站在线观看| 少妇 在线观看| 在线播放无遮挡| 日本午夜av视频| 91久久精品国产一区二区成人| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 少妇的逼水好多| 超色免费av| 免费观看无遮挡的男女| 日韩一区二区视频免费看| 这个男人来自地球电影免费观看 | 日本-黄色视频高清免费观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| av女优亚洲男人天堂| 国产成人午夜福利电影在线观看| 男人操女人黄网站| 日韩亚洲欧美综合| 99国产精品免费福利视频| 日韩精品有码人妻一区| 国产片特级美女逼逼视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 久久久久久久精品精品| 国产在线一区二区三区精| 中文字幕人妻丝袜制服| 夫妻午夜视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 免费观看av网站的网址| 国产综合精华液| 九九爱精品视频在线观看| 国产av精品麻豆| 亚洲综合色网址| 少妇人妻精品综合一区二区| 18+在线观看网站| 国产熟女午夜一区二区三区 | 久久久亚洲精品成人影院| 人人澡人人妻人| av线在线观看网站| 免费人成在线观看视频色| 国产极品天堂在线| 免费观看性生交大片5| 国产深夜福利视频在线观看| 日本-黄色视频高清免费观看| 激情五月婷婷亚洲| 久久精品国产亚洲网站| 成人免费观看视频高清| 多毛熟女@视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 大码成人一级视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 在线天堂最新版资源| 欧美另类一区| 乱码一卡2卡4卡精品| 91久久精品电影网| 91精品国产国语对白视频| 新久久久久国产一级毛片| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 中国国产av一级| 18禁动态无遮挡网站| 免费观看av网站的网址| 久久97久久精品| av在线老鸭窝| 午夜日本视频在线| 亚洲欧美清纯卡通| 精品少妇黑人巨大在线播放| 精品一区二区免费观看| 午夜激情福利司机影院| 国产成人精品在线电影| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 高清毛片免费看| 我的老师免费观看完整版| 在线观看国产h片| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 久久热精品热| 亚洲国产最新在线播放| 久久婷婷青草| 一级毛片 在线播放| 九色亚洲精品在线播放| 国产精品.久久久| 国产男女内射视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 啦啦啦啦在线视频资源| 国产成人精品福利久久| 一级毛片电影观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 在线天堂最新版资源| 在线观看国产h片| av黄色大香蕉| 中文欧美无线码| 亚洲综合精品二区| 久久久久国产网址| 免费av中文字幕在线| 自线自在国产av| 我的老师免费观看完整版| 五月玫瑰六月丁香| 毛片一级片免费看久久久久| 久久国内精品自在自线图片| 涩涩av久久男人的天堂| 大香蕉久久网| 欧美精品一区二区免费开放| 各种免费的搞黄视频| 国产免费现黄频在线看| 精品熟女少妇av免费看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 男女高潮啪啪啪动态图| 最近的中文字幕免费完整| 国产成人精品一,二区| 精品人妻偷拍中文字幕| 日本av手机在线免费观看| 嘟嘟电影网在线观看| 国产精品一区二区在线观看99| 各种免费的搞黄视频| 国产 精品1| 国产又色又爽无遮挡免| 91久久精品电影网| 日日撸夜夜添| 久久国内精品自在自线图片| 国产精品人妻久久久久久| 免费观看a级毛片全部| 午夜福利视频精品| 晚上一个人看的免费电影| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲图色成人| 国产免费福利视频在线观看| 成人影院久久| 久热久热在线精品观看| 国产成人精品在线电影| 精品久久久久久电影网| 日本av手机在线免费观看| 婷婷成人精品国产| 熟女av电影| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 韩国高清视频一区二区三区| 成人综合一区亚洲| 国产免费福利视频在线观看| 久久久久久伊人网av| 丝袜美足系列| 极品少妇高潮喷水抽搐| 看十八女毛片水多多多| 91aial.com中文字幕在线观看| 免费av中文字幕在线| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲图色成人| 最近中文字幕2019免费版| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久青草综合色| 国产日韩欧美视频二区| 国产成人午夜福利电影在线观看| 天堂中文最新版在线下载| 精品午夜福利在线看| 久久国内精品自在自线图片| 国产免费又黄又爽又色| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 久久ye,这里只有精品| 老熟女久久久| 一区在线观看完整版| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产av精品麻豆| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产淫语在线视频| av又黄又爽大尺度在线免费看| 内地一区二区视频在线| 26uuu在线亚洲综合色| 国产视频内射| 久久久午夜欧美精品| 老司机亚洲免费影院| 国产精品.久久久| 青青草视频在线视频观看| 久久婷婷青草| 国产男女内射视频| 中文字幕久久专区| 亚洲综合色网址| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产成人91sexporn| 久热久热在线精品观看| 成人黄色视频免费在线看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产有黄有色有爽视频| 国模一区二区三区四区视频| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲国产最新在线播放| 色网站视频免费| 日本爱情动作片www.在线观看| 午夜免费观看性视频| 十分钟在线观看高清视频www| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲精品自拍成人| 亚洲精品第二区| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产精品一区二区在线不卡| 精品视频人人做人人爽| 少妇的逼好多水| 久久久久久久亚洲中文字幕| 日韩制服骚丝袜av| 高清毛片免费看| 五月伊人婷婷丁香| 纯流量卡能插随身wifi吗| 成人手机av| 久久精品国产亚洲网站| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲人与动物交配视频| av网站免费在线观看视频| 日韩免费高清中文字幕av| 伦理电影大哥的女人| 视频中文字幕在线观看| 国产成人freesex在线| 日韩强制内射视频| 熟女av电影| 国产片内射在线| 久久婷婷青草| 激情五月婷婷亚洲| 91精品一卡2卡3卡4卡| 一级毛片电影观看| 亚洲精品一二三| 国产亚洲最大av| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 日本午夜av视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 少妇熟女欧美另类| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产成人aa在线观看| 边亲边吃奶的免费视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲精品自拍成人| 99热这里只有是精品在线观看| 日韩av不卡免费在线播放| 曰老女人黄片| 日韩一本色道免费dvd| 丝袜脚勾引网站| 99视频精品全部免费 在线| 91精品伊人久久大香线蕉| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产精品久久久久久精品古装| 久久99精品国语久久久| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 久久久久国产精品人妻一区二区| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲精品第二区| 国产黄色免费在线视频| 久久精品久久久久久久性| 国产黄频视频在线观看| 如何舔出高潮| 少妇人妻 视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 一区在线观看完整版| 久热久热在线精品观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 欧美97在线视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 一个人免费看片子| 亚洲av福利一区| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产日韩欧美在线精品| 夫妻午夜视频| 午夜福利,免费看| 国产综合精华液| 精品少妇黑人巨大在线播放| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产在线免费精品| 大片免费播放器 马上看| 国产高清不卡午夜福利| 国内精品宾馆在线| 人成视频在线观看免费观看| a级毛片黄视频| 永久免费av网站大全| 国产精品久久久久成人av| 在线看a的网站| 人妻少妇偷人精品九色| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲人成网站在线播| 亚洲怡红院男人天堂| av线在线观看网站| 一级毛片 在线播放| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 在线观看三级黄色| 午夜免费男女啪啪视频观看| 18禁在线播放成人免费| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲精品国产av成人精品| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 最近手机中文字幕大全| 精品人妻偷拍中文字幕| 另类精品久久| 国产伦精品一区二区三区视频9| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产一区亚洲一区在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 中文字幕最新亚洲高清| 久久久久国产网址| av电影中文网址| 我的老师免费观看完整版| 日韩 亚洲 欧美在线| 18在线观看网站| 久久99热6这里只有精品| 日本与韩国留学比较| 欧美亚洲日本最大视频资源| 日韩精品有码人妻一区| 老女人水多毛片| av又黄又爽大尺度在线免费看| 一级毛片aaaaaa免费看小| 搡老乐熟女国产| 国产精品99久久久久久久久| 久久韩国三级中文字幕| 国产精品久久久久久久电影| 下体分泌物呈黄色| 欧美精品一区二区免费开放| 99热这里只有精品一区| 亚州av有码| 日本欧美视频一区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 久久ye,这里只有精品| 精品少妇黑人巨大在线播放| 美女内射精品一级片tv| 久久99一区二区三区| 国产精品一区www在线观看| 免费高清在线观看视频在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产淫语在线视频| 国产成人av激情在线播放 | 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 丰满迷人的少妇在线观看| 18禁观看日本| 最新中文字幕久久久久| 日本欧美视频一区| 9色porny在线观看| 国产免费现黄频在线看| 亚洲国产色片| 91aial.com中文字幕在线观看| 欧美成人午夜免费资源| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 亚洲丝袜综合中文字幕| 一级二级三级毛片免费看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲av日韩在线播放| 三级国产精品片| 成人国产麻豆网| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 丰满饥渴人妻一区二区三| av免费观看日本| 丁香六月天网| 中文字幕最新亚洲高清| 国产免费现黄频在线看| 久久久久精品性色| 欧美日韩视频精品一区| 免费黄频网站在线观看国产| 精品久久国产蜜桃| 午夜免费男女啪啪视频观看| 午夜福利视频精品| 中文天堂在线官网| 亚洲av不卡在线观看| 各种免费的搞黄视频| 9色porny在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 熟女人妻精品中文字幕| 久久精品国产自在天天线| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 成人影院久久| 免费av不卡在线播放| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 国产不卡av网站在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 全区人妻精品视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 26uuu在线亚洲综合色| 黄色欧美视频在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲成人av在线免费| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 老熟女久久久| 男女国产视频网站| 久久女婷五月综合色啪小说| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 26uuu在线亚洲综合色| 日韩视频在线欧美| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产免费福利视频在线观看| 婷婷成人精品国产| 在线观看三级黄色| 亚洲精品美女久久av网站| 春色校园在线视频观看| 成人手机av| 日本91视频免费播放| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 一区二区三区四区激情视频| 国产成人精品久久久久久| 妹子高潮喷水视频| 成人国语在线视频| 国产伦理片在线播放av一区| 精品国产国语对白av| 午夜日本视频在线| 97在线人人人人妻| 青春草亚洲视频在线观看| 国产av精品麻豆| 国产乱来视频区| 七月丁香在线播放| 国产毛片在线视频| 国产亚洲精品久久久com| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 成人国产av品久久久| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 黄色毛片三级朝国网站| 伊人亚洲综合成人网| 99热这里只有精品一区| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 两个人免费观看高清视频| av卡一久久| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲不卡免费看| 激情五月婷婷亚洲| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 日韩一区二区三区影片| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲性久久影院| 99久久精品国产国产毛片| 国产 一区精品| 青春草视频在线免费观看| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 男人爽女人下面视频在线观看| 久久久亚洲精品成人影院| 人妻系列 视频| 成人国产麻豆网| 日本91视频免费播放| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲av中文av极速乱| av黄色大香蕉| 视频中文字幕在线观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 亚洲人成网站在线播| 激情五月婷婷亚洲| 全区人妻精品视频| 如何舔出高潮| 男女高潮啪啪啪动态图| 99国产综合亚洲精品| 超碰97精品在线观看| 亚洲国产欧美在线一区| 国产精品.久久久| 亚洲五月色婷婷综合| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 一个人看视频在线观看www免费| 国产精品熟女久久久久浪| 男人操女人黄网站| 日韩欧美一区视频在线观看| 大片免费播放器 马上看| 欧美日韩成人在线一区二区| 免费少妇av软件| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 18在线观看网站| 午夜影院在线不卡| 久久国产亚洲av麻豆专区| 久久久午夜欧美精品| 亚洲av成人精品一区久久| 免费观看无遮挡的男女| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲欧美色中文字幕在线| 91久久精品国产一区二区成人| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲精品自拍成人| 国产一区有黄有色的免费视频| 啦啦啦视频在线资源免费观看| freevideosex欧美| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 卡戴珊不雅视频在线播放| 这个男人来自地球电影免费观看 | 青青草视频在线视频观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产在线一区二区三区精| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 22中文网久久字幕| av在线app专区| 日韩成人av中文字幕在线观看| 久久热精品热| av在线老鸭窝| 91精品伊人久久大香线蕉| 成人手机av|