原花青素對(duì)磷酸三鈣磨損顆粒所致小鼠顱骨溶解的干預(yù)作用及其機(jī)制*

林 琨， 陳佳濠， 方澤浩， 葉鋮龍， 韓超杰， 嚴(yán) 明， 方 劍， 張 云△

(1. 紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部, 浙江 紹興 312000; 2. 杭州電子科技大學(xué)生命信息與儀器工程學(xué)院, 浙江 杭州 310018)

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是指用人工關(guān)節(jié)置換和代替損傷或病損關(guān)節(jié)，是臨床治療晚期髖、膝關(guān)節(jié)等嚴(yán)重關(guān)節(jié)疾病的重要手段，它可有效減輕患者關(guān)節(jié)疼痛、恢復(fù)關(guān)節(jié)功能，提高患者生活質(zhì)量。但是長(zhǎng)期使用關(guān)節(jié)假體容易發(fā)生無菌性松動(dòng)[1]，導(dǎo)致人工關(guān)節(jié)置換失敗和關(guān)節(jié)翻修。新近假體翻修術(shù)回顧性研究發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)假體植入體內(nèi)后，經(jīng)過長(zhǎng)期磨損、碰撞會(huì)產(chǎn)生大量的聚乙烯(polyethylene，PE)、金屬鈦(titanium，Ti)和陶瓷磷酸三鈣(tricalcium phosphate，TCP)等磨損顆粒，這些顆?？杉せ罴袤w周圍組織細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白介素-1β( interleukin-1 β，IL-1β)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)等因子，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化和活化，造成假體周圍骨溶解及關(guān)節(jié)假體松動(dòng)[2-4]。Steinbeck等和我們前期研究表明磨損顆?？烧T導(dǎo)假體周圍發(fā)生氧化應(yīng)激，產(chǎn)生過多的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，破壞假體周圍骨組織氧化/抗氧化平衡，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)假體周圍破骨細(xì)胞生成和骨溶解[5, 6]。因此，氧化應(yīng)激在磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解中發(fā)揮重要的作用。

原花青素(procyanidin)是從葡萄籽中提取分離出的天然多酚類化合物，具有較強(qiáng)的抗氧化和清除自由基及抗炎作用[7-9]。但是，原花青素是否可通過影響氧化應(yīng)激反應(yīng)而調(diào)控假體周圍骨溶解目前還尚不明確。本研究擬應(yīng)用前期成功構(gòu)建的TCP磨損顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨溶解模型，模擬體內(nèi)關(guān)節(jié)假體釋放的磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解病理過程[3, 6]，給予原花青素干預(yù)并分析其對(duì)假體周圍骨溶解、破骨細(xì)胞生成、炎癥因子釋放、氧化應(yīng)激水平及自噬的影響，探討原花青素對(duì)TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解的保護(hù)作用及其分子機(jī)制，為研究防治假體周圍骨溶解候選藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

TCP顆粒由浙江大學(xué)化學(xué)系饋贈(zèng)；原花青素(HPLC≥95%)購(gòu)自上海源葉生物技術(shù)有限公司)；水合氯醛、多聚甲醛和EDTA購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；T-AOC、MDA和SOD試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；超敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；Applied BiosystemTMSYBRTM試劑購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher Scientific公司；TRIzol、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液和SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗Beclin-1抗體、兔抗LC-3抗體和小鼠抗β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.2 動(dòng)物分組與模型構(gòu)建[3, 6]

SPF級(jí)6～8周齡ICR雄性小鼠，體量18～22 g，購(gòu)于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SCXK(浙)2014-0001)。取48只雄性ICR小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組、TCP磨損顆粒(TCP)組和原花青素(0.2 mg/kg，1 mg/kg，5 mg/kg)組，每組12只。腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉小鼠后，無菌條件下取顱頂正中矢狀切口，長(zhǎng)約0.8 cm，分離皮下組織，顯露出1 cm×1 cm顱骨區(qū)域。假手術(shù)組進(jìn)行原位縫合，其余組取TCP顆粒30 mg置于顱頂后縫合皮膚。原花青素組小鼠于術(shù)后第2日顱頂骨膜部位注射原花青素，隔日1次，持續(xù)2周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠取血和顱骨。

1.3 血清制備

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組小鼠分別于眼眶后靜脈叢采血1.0 ml置于EP管中，待血液凝固后于4℃、3 000 r/min離心10 min，分離血清。

1.4 化學(xué)比色法檢測(cè)

取96孔培養(yǎng)板，每孔加入20 μl血清，分別采用T-AOC、MDA和SOD試劑盒檢測(cè)小鼠血清中T-AOC、MDA含量及SOD活性。

1.5 TRAP染色

各組顱骨經(jīng)4%多聚甲醛固定10 min，0.25 mol/L氫氧化銨超聲清洗5 min。然后置于系列乙醇(50%，80%，90%，100%)中梯度脫水，自然晾干后加入TRAP染色液中室溫避光染色60 min。蒸餾水清洗后，置于IX70顯微鏡下觀察顱骨表面侵蝕程度并利用Image Pro Plus 6.0圖像處理軟件分析正中矢狀線區(qū)域骨溶解面積。

1.6 HE染色

各組顱骨經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h和10% EDTA(pH 7.4)脫鈣2周后，石蠟包埋后，顱骨切片厚度為7 μm。HE染色后置于IX70顯微鏡觀察TCP顆粒周圍破骨細(xì)胞生成情況。利用Image Pro-Plus 5.0(美國(guó)Media Cybernetics公司)計(jì)算正中矢狀縫區(qū)域三核及以上破骨細(xì)胞數(shù)。

1.7 骨組織RNA的提取與熒光定量PCR檢測(cè)

每組等重量假體周圍顱骨組織，置于研缽內(nèi)在液氮環(huán)境下研磨成粉末后轉(zhuǎn)移至EP管中，利用TRIzol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后應(yīng)用Applied BiosystemTMSYBRTM試劑盒行熒光定量PCR。設(shè)置程序：95℃ 5 min預(yù)變性，后以95℃ 30 s變性、56℃ 30 s退火、72℃ 40 s延伸等45個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增，最后37℃ 30 s。導(dǎo)出擴(kuò)增曲線，記錄Ct值，以mRNA水平以相對(duì)定量(β-actin)表示，應(yīng)用2-△△Ct測(cè)定，引物序列見表1。

Tab. 1 Sequences of PCR primers

1.8 骨組織蛋白的提取與Western blot[10]檢測(cè)

各組取等重量假體周圍顱骨組織置于研缽內(nèi)，在液氮環(huán)境下研磨成粉末，然后轉(zhuǎn)移至EP管中。加入RIPA裂解液800 μl裂解30 min，于4℃ 12 000 r/min離心15 min，收集上清液。采用BCA法檢測(cè)各組總蛋白質(zhì)濃度。骨組織蛋白提取液中加上樣緩沖液后煮沸 10 min，冷卻后每孔上樣30 μg蛋白，行12%SDS-PAGE分離蛋白，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂牛奶常溫封閉2 h后，分別加入兔抗Beclin-1抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗LC-3抗體(1∶1 000稀釋)和小鼠抗β-actin抗體(1∶1 000稀釋)置于4℃ 孵育過夜。次日用TBST洗滌3次后加入 HRP 標(biāo)記的二抗(1∶2 000稀釋)室溫孵育2 h，TBST清洗3次加入ECL顯色液；通過凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各蛋白表達(dá)的變化。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 原花青素對(duì)TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解的干預(yù)作用

與Sham組比較，TCP組小鼠顱骨假體周圍(正中矢狀縫)發(fā)生明顯骨溶解，骨溶解面積顯著增加(圖1，P<0.05)；與TCP組比較，原花青素組小鼠顱骨表面骨溶解程度顯著減輕，其中高劑量原花青素組(5 mg/kg)骨溶解面積減少更為明顯，僅為TCP組的骨溶解面積的44.83%(P<0.05，圖1)。

A: Representative photographs ofosteolysis in the mouse calvaria (TRAP ×200); B: Osteolysis area measured by NIH image; TRAP: Tartrate resistant acidphosphatase; TCP: Tricalcium phosphate

*P<0.05vsSham group;#P<0.05vsTCP group;△P<0.05vsprocyadinin (0.2 mg/kg) group;▲P<0.05vsprocyadinin (1 mg/kg) group

2.2 原花青素對(duì)TCP磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍破骨細(xì)胞生成的影響

HE染色結(jié)果顯示：與Sham組比較，TCP組假體周圍破骨細(xì)胞生成顯著增加，其數(shù)目明顯增加(P<0.05，圖2)；與TCP組比較，原花青素組假體周圍破骨細(xì)胞生成明顯減少，其數(shù)量分別減少為TCP組的95.32%(0.2 mg/kg)、83.37%(1 mg/kg)和30.29%(5 mg/kg，P<0.05，圖2)。

2.3 原花青素對(duì)TCP磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍破骨細(xì)胞生成相關(guān)基因mRNA水平的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示：與Sham組比較，TCP組假體周圍骨組織中破骨細(xì)胞生成相關(guān)基因TRAP、capthesin K、c-Fos和NFATc1表達(dá)顯著上調(diào)，其mRNA水平明顯升高(P<0.05，表2)；與TCP組比較，原花青素組假體周圍骨組織中TRAP、capthesin K、c-Fos和NFATc1表達(dá)明顯下調(diào)，其mRNA水平顯著減少(P<0.05，表2)。

A: Representative photographs of osteoclastogenesis in the mouse calvaria (HE ×200); B: Osteoclasts number measured by NIH image; HE: Hematoxylin eosin; TCP: Tricalcium phosphate

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsTCP group;△P<0.05vsprocyadinin (0.2 mg/kg) group;▲P<0.05vsprocyadinin (1 mg/kg) group

2.4 原花青素對(duì)TCP磨損顆粒誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的影響

與Sham組比較，TCP組小鼠血清中MDA含量明顯增加、T-AOC含量和SOD活性顯著降低，分別為Sham組的7.55倍、45.53%和57.82%(P<0.05，表3)；與TCP組比較，原花青素組小鼠血清中MDA含量明顯降低，T-AOC含量和SOD活性顯著升高，其中原花青素組(5 mg/kg)小鼠血清中MDA和T-AOC含量及SOD活性分別是TCP組的 53.67%、1.42倍和1.32倍(P<0.05，表3)。

2.5 原花青素對(duì)TCP磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨組織自噬的影響

由于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示低劑量組(0，2 mg/kg)對(duì)TCP磨損顆粒所致小鼠顱骨溶解及其相關(guān)指標(biāo)的影響不明顯，且與TCP(模型組)比較，差異不明顯(P>0.05)，故在此處僅設(shè)1 mg/kg和5 mg/kg兩組。Western blot結(jié)果顯示：與Sham組比較，TCP組小鼠假體周圍骨組織中自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC-3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，LC-3I向LC-3II轉(zhuǎn)換明顯增加，造成LC-3II/LC-3I比值升高(P<0.05，圖3)；與TCP組比較，原花青素組小鼠假體周圍骨組織Beclin-1和LC-3表達(dá)及LC-3II/LC-3I明顯降低(P<0.05，圖3)。

Tab. 2 Effects of procyanidin on mRNA levels of osteoclastic genes such as TRAP, capthesin K, c-Fos and NFATc1 in the mouse calvaria n=6)

TRAP: Tartrate resistant acid phosphatase; NFATc1: Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1; TCP: Tricalcium phosphate.

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsTCP group;△P<0.05vsprocyadinin (0.2 mg/kg) group;▲P<0.05vsprocyadinin (1 mg/kg) group

GroupMDA(mmol/L)T-AOC(mmol/L)SOD(U/ml)Sham2.56±1.051035.74±50.5490.48±5.61TCP19.34±3.94*471.56±15.27*52.32±3.77*Procyanidin (0.2 mg/kg)18.98±3.74*489.12±20.87*57.57±4.69*Procyanidin (1 mg/kg)17.77±4.51*#△968.74±33.18*#△81.65±6.93*#△Procyanidin (5 mg/kg)10.38±2.46*#△▲667.83±41.20*#△▲88.97±7.34*#△▲

MDA: Malondialdehyde; T-AOC: Total antioxidation capacity; SOD: Superoxide dismutase; TCP: Tricalcium phosphate

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsTCP group;△P< 0.05vsprocyadinin (0.2 mg/kg) group;▲P<0.05vsprocyadinin (1 mg/kg) group

A: Activation of autophagy examined by Western blot; B, C: Densitometric analysis data in Fig. 3A

LC-3: Microtubule-associated protein I/II-light chain 3; TCP: Tricalcium phosphate.

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsTCP group;△P< 0.05vsprocyadinin (1 mg/kg) group

3 討論

人工關(guān)節(jié)置換常用于治療嚴(yán)重關(guān)節(jié)疾病，重建關(guān)節(jié)功能的重要手段。但是關(guān)節(jié)假體經(jīng)過長(zhǎng)期磨損、碰撞會(huì)產(chǎn)生大量的磨損顆粒包埋于假體周圍組織中，這些顆?？烧T導(dǎo)大量炎癥因子釋放，促進(jìn)假體周圍破骨細(xì)胞分化和骨溶解，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)置換失敗和關(guān)節(jié)翻修[1-4]。目前由于翻修術(shù)治療假體松動(dòng)其療效低于初次手術(shù)。手術(shù)創(chuàng)傷大、價(jià)格昂貴等原因，臨床上多應(yīng)用雙膦酸鹽(阿侖膦酸鈉和依班膦酸鈉等)抑制假體周圍骨溶解，但是這類藥物中遠(yuǎn)期療效欠佳，而且容易誘發(fā)股骨頭壞死及心房顫動(dòng)等。此外，近年也有學(xué)者嘗試通過基因療法治療假體周圍骨溶解，并取得一定的效果，然而基因療法在國(guó)內(nèi)外均處于起步階段，存在影響范圍大、毒副作用不清楚等風(fēng)險(xiǎn)。因此，從天然藥用植物中尋找高效、低毒藥物抑制假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動(dòng)十分必要。

原花青素是從葡萄籽中分離得到的多酚類化合物，可有效清除多種ROS，具有極強(qiáng)的抗氧化、抗炎、抗腫瘤和降血糖等多方面活性[7-9, 11, 12]。Zhong等[13]研究表明，原花青素可抑制H2O2誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞氧化損傷而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。本研究應(yīng)用小鼠顱骨溶解模型進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，原花青素可明顯阻止TCP磨損顆?？烧T導(dǎo)假體周圍骨溶解和破骨細(xì)胞生成，并呈一定的劑量依賴性，其中高劑量組(5 mg/kg)的抑制作用稍弱于本研究組前期所報(bào)道的抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)對(duì)小鼠顱骨溶解的影響[6]。提示：原花青素對(duì)TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解具有干預(yù)作用，并有望成為治療假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)晚期松動(dòng)的一種潛在候選藥物。

另有報(bào)道松動(dòng)假體周圍組織中ROS水平較高，大量的ROS攻擊假體周圍組織細(xì)胞后引起GSH和MDA含量上升，T-AOC含量和SOD活性明顯下降，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)及假體周圍骨溶解[5, 6, 14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，原花青素可減輕TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為：與TCP組比較，原花青素組小鼠血清中MDA含量明顯減少，T-AOC含量和SOD活性顯著增加。另一方面，原花青素含有的多個(gè)酚性羥基在體內(nèi)可被氧化后可釋放出H+，競(jìng)爭(zhēng)性與自由基及氧化產(chǎn)物結(jié)合，阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[15]，使脂質(zhì)過氧化作用最終分解產(chǎn)物MDA含量明顯減少。以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)原花青素具有較好的抗氧化能力，它可通過減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)TCP磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解的保護(hù)作用。

有研究顯示氧化應(yīng)激能通過耗竭抗氧化物質(zhì)而引發(fā)自噬，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化、存活和骨吸收[16, 17]，抑制自噬可阻止假體周圍骨溶解[18]。2017年胡等[10]報(bào)道PC12細(xì)胞在缺氧下發(fā)生氧化損傷，促進(jìn)自噬的發(fā)生。而自噬作為一種重要的細(xì)胞代謝方式，其發(fā)生受到自噬標(biāo)志蛋白Beclin-1和LC-3等的嚴(yán)格調(diào)控[19, 20]。Beclin-1是自噬體形成過程中不可或缺的成分，而LC-3則直接參與自噬體的形成。因此，Beclin-1和LC-3蛋白表達(dá)上調(diào)及LC-3II/LC-3I比值的增加表示自噬水平增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，原花青素干預(yù)可顯著減弱TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的自噬，下調(diào)Beclin-1和LC-3蛋白表達(dá)、減少LC-3I向LC-3II的轉(zhuǎn)換及LC-3II/LC-3I比值，其趨勢(shì)與原花青素對(duì)MDA、SOD和T-AOC等氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響基本一致，這提示原花青素可通過減輕氧化應(yīng)激、調(diào)控自噬而阻止TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解。

綜上，原花青素可通過減輕TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)和自噬而發(fā)揮對(duì)假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動(dòng)的干預(yù)作用，而原花青素減輕氧化應(yīng)激和自噬的具體分子機(jī)制尚需深入探討。