植物源咸味肽制備與應(yīng)用研究進展

楊明哲，趙子瑩，湯華成,，李良玉，彭思念，李志江,3,

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.國家雜糧工程技術(shù)中心，黑龍江大慶 163319；3.黑龍江省雜糧加工及質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶 163319）

咸味作為人類不可或缺的基本味之一，是人類感知食物風(fēng)味的重要基礎(chǔ)[1]，但長時間食用鹽過度攝入會引發(fā)高血壓等心血管疾病[2]。為貫徹落實《“健康中國2030”規(guī)劃綱要》，許多食鹽替代物出現(xiàn)在大眾的視野中，如非鈉鹽、咸味肽、咸味增強肽及風(fēng)味改良劑等。非鈉鹽是指與食用鹽性質(zhì)相似，可以呈現(xiàn)咸味的金屬鹽類[3]，但其只能降低食品中部分鈉含量，限制了在食品中的應(yīng)用。風(fēng)味改良劑可以彌補減鹽導(dǎo)致的咸味下降[4]，但需要與其他代鹽劑結(jié)合使用。咸味肽是一種較為理想的食鹽代替物[5]，不僅能夠滿足人類對口味的需求，還可補充人體所需氨基酸，可以真正做到“減鹽不減咸”。

咸味肽是指通過酶解等工序?qū)Ω缓鞍踪|(zhì)的原料進行提取、由氨基酸組成的、呈咸味的活性多肽[6]。按食物來源可分為動物源、植物源和酵母源等，其中植物源咸味肽是源于植物蛋白的多肽，可應(yīng)用于食品減鹽領(lǐng)域，具有安全性高、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點，是一種極具潛力的食源性活性肽[7]。為拓展植物源咸味肽的研究現(xiàn)狀，本文綜述了植物源咸味肽的呈味機理、制備技術(shù)、分離鑒定技術(shù)，并概述了植物源咸味肽的應(yīng)用，為進一步促進植物源咸味肽的深入研究和食品研發(fā)提供理論依據(jù)和參考。

1 咸味肽的研究必要性及結(jié)構(gòu)特點

1.1 咸味肽開發(fā)應(yīng)用的必要性

2022 版膳食指南將食鹽推薦攝入量調(diào)整為小于5 g，但目前中國人均每日食鹽攝入量為9.3 g[8]，因此減鹽成為未來食品科技領(lǐng)域的熱點。研究表明，長期高鈉攝入會提高高血壓等心血管疾病的發(fā)病率[9]。因此，開發(fā)既能滿足人體對咸味的需求，同時又能降低鈉離子攝入的食鹽代替物是非常必要的。咸味肽不僅可以提高人體對咸味的感知，且大部分咸味肽還具有功能特性，是未來食鹽代替物發(fā)展的必然趨勢。Tada 等[10]第一次在酪蛋白水解物中提取出咸味二肽Orn-β-Ala，其咸味強度與NaCl 相當(dāng)。國內(nèi)學(xué)者對郫縣豆瓣醬發(fā)酵過程中產(chǎn)生的呈味肽進行分離和鑒定，結(jié)果表明其中有六種肽具有咸味或者咸味增強作用[11]。對豌豆蛋白進行深度酶解，所獲得的小分子肽具有較明顯的咸味[12]。從中國商業(yè)發(fā)酵豆渣中分離出 4 種呈味肽，其中 EDGEQPRPF具有咸味和增強咸味的作用[13]。不同原料來源的咸味肽咸度及氨基酸序列的差異，導(dǎo)致其在食品中的應(yīng)用各不相同，動物源咸味肽如從魚蝦中提取的咸味肽制成的產(chǎn)品，海鮮過敏的人群不能食用。以植物為原料制成的咸味肽應(yīng)用范圍廣，可以更好地被人體消化利用。由此可見，開發(fā)植物源咸味肽產(chǎn)品尤為重要。

1.2 咸味肽結(jié)構(gòu)特性

天然存在的氨基酸分為L 型和D 型。L 型氨基酸及其鹽類大部分呈苦味、甜味，少部分呈咸味、鮮味和酸味，而D 型氨基酸大多呈甜味[14]。咸味肽主要由2 個及2 個以上的L 型氨基酸組成，咸味二肽結(jié)構(gòu)圖見圖1[15]。

2 咸味肽受體與機制

2.1 咸味肽受體通路

目前，研究發(fā)現(xiàn)咸味受體包括瞬時受體電位香草酸亞基（TRPV1）和上皮鈉離子通道（ENaCs）兩種[16]。當(dāng)Na+在口腔中達到一定濃度時，會刺激ENaCs 并感受咸味。TRPV1 不僅對Na+敏感，還對其他離子如K+和Ca2+等敏感。ENaCs 由α、β和γ等3 種亞基組成異源三聚體通道（圖2），α亞基主要負責(zé)Na+進出細胞，β亞基調(diào)控Na+轉(zhuǎn)運的速度，γ亞基負責(zé)剪切ENaCs 的特定位點而調(diào)節(jié)其活性[17]。TRPV1 是介導(dǎo)Ca2+和Na+等單價和二價陽離子的一類跨細胞膜非選擇性陽離子通道，TRPV1 通道開放后可產(chǎn)生Na+內(nèi)流，通過介導(dǎo)細胞內(nèi)Na+濃度來對咸味感受進行調(diào)控[18]?？傊瑑烧呓詾橄涛秱鞲惺荏w，中低鹽濃度可以依靠ENaCs 來感受咸味，而高鹽濃度可以通過刺激TRPV1 來感受咸味。咸味肽主要靠激活ENaCs 表達咸味。Anand 等[19]證實半胱氨酸和絲氨酸可以作為通道激活蛋白，協(xié)助Na+刺激ENaC 受體。

圖2 ENaCs 咸味受體通路Fig.2 Pathway of salty taste receptors of ENaCs

2.2 咸味感受機制

味蕾是位于口腔上皮的感受器官。咸味物質(zhì)與味蕾中味覺感受器細胞中的受體進行特異性結(jié)合，通過味覺神經(jīng)傳遞，最后由大腦中的味覺中樞表達[20]。咸味肽的呈味機理不僅與受體的特異性結(jié)合有關(guān)，還與咸味肽的解離程度和所含特殊陽離子有關(guān)。咸味肽呈味的關(guān)鍵在于咸味肽電離出陽離子后，陽離子刺激處于細胞膜上的ENaCs 通道后發(fā)生相互作用，進而使Ca2+極化。當(dāng)細胞的內(nèi)部帶正電時，咸味傳感受體釋放特定的味覺神經(jīng)介質(zhì)，通過舌后部的舌咽神經(jīng)傳遞到腦干并感受咸味[21]。

3 咸味肽的構(gòu)效關(guān)系

咸味肽的呈味特性與其相對分子質(zhì)量、氨基酸組成、氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)等密切相關(guān)。

3.1 咸味肽相對分子質(zhì)量

咸味肽是一種小分子肽，分子量通常小于1000 Da。劉平等[22]考察分子量不同的五種大豆肽的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對雞湯風(fēng)味的影響，結(jié)果表明小于1000 Da的大豆肽呈現(xiàn)了較好的咸味增強效果，表現(xiàn)出明顯的咸味和鮮味[23]。研究表明，當(dāng)分子量小于1000 Da時，咸味肽的咸味表現(xiàn)能力最強。因此，在開發(fā)應(yīng)用咸味肽時，應(yīng)以相對分子量質(zhì)量較小的肽類為主。

3.2 咸味肽氨基酸組成及序列

目前發(fā)現(xiàn)的咸味肽主要為咸味二肽和咸味三肽，大部分都與谷氨酸、天冬氨酸片段有關(guān)。部分咸味肽來源與結(jié)構(gòu)式見表1。

表1 咸味肽來源與結(jié)構(gòu)式Table 1 Origin and structural formula of salty peptides

3.3 咸味肽的空間結(jié)構(gòu)

當(dāng)咸味肽含3 個氨基酸以上，必須考慮其空間結(jié)構(gòu)[33]。肽鏈長度的不同會造成空間結(jié)構(gòu)和電荷分布的不同，另外咸味肽結(jié)構(gòu)中羰基、羧基及酸性氨基酸的存在會導(dǎo)致咸味肽一級結(jié)構(gòu)不能解釋和預(yù)測咸味肽結(jié)構(gòu)和呈味特性的關(guān)系。但目前關(guān)于咸味肽空間結(jié)構(gòu)與呈味特性的研究相對較少。

綜上所述，咸味肽的呈味特性與氨基酸的相對分子質(zhì)量、組成、序列及空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，研究咸味肽從咸味肽的構(gòu)效關(guān)系中入手，可以較好的開發(fā)咸味肽及其產(chǎn)品。

4 植物源咸味肽的制備與合成方法

植物源咸味肽的制備方法主要有化學(xué)水解法[34]、酶水解法[35]、生物工程法[36]和微生物發(fā)酵法[37]；合成方法包括化學(xué)合成法中的固相合成法和液相合成方法[38]。制備方法中比較常用的有酶解法及微生物發(fā)酵法，化學(xué)合成法也被廣泛應(yīng)用于咸味肽的合成中。植物源咸味肽的各種制備方法見表2。

表2 植物源咸味肽制備方法比較Table 2 Comparison of preparation methods of plant-derived salty peptides

4.1 天然植物源咸味肽的制備

4.1.1 化學(xué)水解法 化學(xué)水解法分為酸水解法和堿水解法。在酸性或堿性的條件下，蛋白質(zhì)可以發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生氨基酸[39]。Jeon 等[40]向韓國大醬湯中添加經(jīng)過酸水解的植物蛋白，結(jié)果表明酸水解后的植物蛋白具有明顯的增咸作用。蛋白質(zhì)的化學(xué)水解法具有提取快速及徹底的優(yōu)點，但是時間和水解溫度不易控制，并且會引起消旋作用，破壞敏感氨基酸。因此，化學(xué)水解法較少應(yīng)用于生產(chǎn)。

4.1.2 酶水解法 酶水解法是指使用單個或復(fù)合蛋白酶在最適條件下水解蛋白質(zhì)，并獲得具有呈味效果的功能肽[41]。使用酶水解后的植物蛋白與還原糖混合制備美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，其產(chǎn)物具有明顯的咸味和咸味增強作用[42]。酶水解法具有穩(wěn)定性好、操作方便、過程可控、專一性強等優(yōu)點，特別在制備咸味肽方面，可以最大保留咸味肽的風(fēng)味及營養(yǎng)。因此，酶水解法為制備植物源咸味肽最常用、最安全的方法，被廣泛應(yīng)用于植物源咸味肽的制備。

4.1.3 生物工程法 生物工程法是指對植物基因組分的DNA 片段進行分離，而后此DNA 片段被克隆到適宜的載體，并導(dǎo)入受體細胞，通過細胞表達得到咸味肽[43]。已有報道證實，可采用生物工程法制備咸味二肽Gly-Asp[44]。該方法具有原料價格低廉、咸味肽產(chǎn)率高以及特異性高等優(yōu)點，但在DNA 重組過程中對滅菌的要求較為嚴格，并未得到廣泛的應(yīng)用。

4.1.4 微生物發(fā)酵法 微生物發(fā)酵法是指利用微生物發(fā)酵蛋白質(zhì)底物從而來生產(chǎn)咸味肽的方法[45]。Suzuki 等[25]利用地衣芽孢桿菌對大豆蛋白進行發(fā)酵，所得的產(chǎn)物經(jīng)過γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶轉(zhuǎn)化后具有明顯的咸味增強作用。該方法不需要使用化學(xué)試劑，使用的菌種易培養(yǎng)，培養(yǎng)周期短，而且發(fā)酵過程還可以去除底物中存在的高過敏性因子及抗營養(yǎng)因子。但不同的菌種差異較大、發(fā)酵過程難以控制等缺點在應(yīng)用中仍存在限制，有待進一步開發(fā)。

4.2 植物源咸味肽的化學(xué)合成

化學(xué)合成法是指通過氨基酸的縮合反應(yīng)形成酰胺鍵來合成咸味肽，主要有液相合成法和固相合成法[46]。目前化學(xué)合成法仍為合成呈味肽的首選方法，因為此方法可以合成大量的所需目標肽。

4.2.1 液相合成法 液相合成法作為最早應(yīng)用于多肽合成的方法，主要分為逐步偶聯(lián)反應(yīng)和肽段偶聯(lián)反應(yīng)[47]。逐步偶聯(lián)反應(yīng)是將多肽鏈的C 端逐步與氨基酸連接直到整個多肽鏈完成。肽段偶聯(lián)反應(yīng)大多先合成各個所需片段，再將各個所需片段合成目標肽[48]。液相合成法具有成本相對較低、中間產(chǎn)物可以優(yōu)化等優(yōu)點，主要用于合成長肽鏈。因咸味肽大部分為二肽或者三肽，液相合成法并未廣泛應(yīng)用在咸味肽的合成中。

4.2.2 固相合成法 固相合成法是指以共價鍵的方式將肽鏈末端的羥基與高分子樹脂連接，氨基酸通過縮合反應(yīng)將脫保護的N 端與第二個氨基酸的活化羧基結(jié)合，進行縮合，洗脫，再縮合的重復(fù)操作，從而達到目標肽的長度，而后從高分子樹脂上裂解下來，分離后純化，最后獲得目標多肽[49]。固相合成法可以根據(jù)α-氨基酸保護基不同，可分為Boc 法和Fmoc法。Feng 等[50]通過固相合成法合成Gly-Leu-Pro-Asp 和Gly-His-Gly-Asp 兩種咸味肽并添加到雞肉湯中，可以顯著增強雞肉湯的咸味和鮮味。對比液相合成法，固相合成法操作簡便，技術(shù)成熟，合成的多肽純度較高。目前，固相合成法被廣泛用于多肽的合成中。

5 植物源咸味肽分離純化與鑒定技術(shù)

5.1 植物源咸味肽分離純化技術(shù)

植物源咸味肽的分離純化通常采用超濾技術(shù)、凝膠過濾色譜技術(shù)以及高效液相色譜技術(shù)等。但只使用一種分離純化技術(shù)很難獲得較為純凈的植物源咸味肽，一般采用多種分離純化技術(shù)聯(lián)用。

5.1.1 超濾技術(shù) 超濾技術(shù)是指將溶液中的物質(zhì)通過不同孔徑的超濾膜而逐步達到分離純化及濃縮的技術(shù)手段[51]。超濾技術(shù)作為一種快速、經(jīng)濟和環(huán)保的技術(shù)手段，其原理是利用空氣壓力使物質(zhì)溶液穿透超濾膜，小于孔徑的小分子物質(zhì)透過超濾膜被收集，大于孔徑的大分子物質(zhì)被截留在超濾膜上，從而完成物質(zhì)溶液的分離純化，常用于>10 kDa、5～10 kDa、3～5 kDa、1～3 kDa 及<1 kDa 分子量肽段的分離[52]，結(jié)合其他分離純化技術(shù)聯(lián)用得到單一純化的肽。Kong 等[53]利用超濾技術(shù)與其他技術(shù)聯(lián)合使用，成功從大豆種子水解物中分離出咸味肽，該咸味肽可作為味覺增強劑添加到食品中。

5.1.2 凝膠過濾色譜技術(shù) 凝膠過濾色譜技術(shù)是利用分子篩原理，根據(jù)大小分子在不同的時間流出從而達到分離的目的[54]。被分離的咸味肽組分隨著流動相在不同時間流出，分子越大越易收集，從而實現(xiàn)咸味肽的分離。Xia 等[55]通過凝膠過濾色譜技術(shù)從秀珍菇蛋白水解物中成功分離γ-谷酰胺肽，結(jié)果證明，γ-谷酰胺肽可以顯著地增加咸味和鮮味。

5.1.3 高效液相色譜技術(shù) 高效液相色譜技術(shù)是植物源咸味肽分離純化最常用的技術(shù)之一。其原理是利用物質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)差異，隨著流動相的洗脫，不同性質(zhì)的組分在不同時間流出，進而達到分離純化的目的[56]。此技術(shù)因其分離范圍廣、分離效果好及選擇性好等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于咸味肽分離純化中。熊建等[57]使用高效液相色譜技術(shù)對酵母源咸味肽進行相對分子量測定，結(jié)果表明，酵母抽提物中<1 kDa 肽段的咸味肽顯著提升咸味和咸味。

5.2 植物源咸味肽的鑒定技術(shù)

由于咸味肽已成為國內(nèi)外的研究熱點，為促進咸味肽的發(fā)展，越來越多的鑒定方法應(yīng)用于咸味肽中。目前主要的鑒定方法有質(zhì)譜法、傅里葉變換紅外光譜技術(shù)、核磁共振技術(shù)及分子對接技術(shù)等。

5.2.1 質(zhì)譜法 質(zhì)譜法是利用磁場和電場將運動中的離子按照其質(zhì)荷比分離后進行鑒定的方法[58]。因為此方法具有高特異性、靈敏度、鑒定速度快及操作簡便等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用在咸味肽氨基酸序列和相對分子質(zhì)量鑒定中。利用液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)對以大豆為原料的發(fā)酵食品中的咸味肽進行定性和定量分析，研究結(jié)果表明醬油及大醬等大豆發(fā)酵食品中咸味肽的含量最高可達620 μg/g[27]。

5.2.2 傅里葉變換紅外光譜技術(shù) 傅里葉變換紅外光譜技術(shù)利用紅外吸收光譜的譜峰位置來鑒定咸味肽，可以根據(jù)咸味肽不同結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同的特征吸收帶，以此確定咸味肽的二級結(jié)構(gòu)[59]。利用傅里葉變換紅外光譜技術(shù)成功鑒別出咸味肽的二級結(jié)構(gòu)[60]。傅里葉變換紅外光譜技術(shù)具有成本低、鑒定損失少、制樣簡單等優(yōu)點，應(yīng)用于鑒定咸味肽。

5.2.3 核磁共振技術(shù) 隨著核磁共振技術(shù)的廣泛應(yīng)用，該技術(shù)已經(jīng)成為蛋白多肽分析的主要技術(shù)之一[61]。已有報道利用核磁共振技術(shù)可以成功鑒定出多肽的結(jié)構(gòu)[62]。目前，核磁共振技術(shù)已逐漸成為蛋白質(zhì)多肽鑒定的主要技術(shù)之一，未來此技術(shù)可以應(yīng)用與鑒定咸味肽的氨基酸序列和咸味肽混合物中各組分的含量的測定中。

5.2.4 分子對接技術(shù) 分子對接技術(shù)是呈味肽與受體蛋白進行特異性結(jié)合，進而識別出咸味肽氨基酸的序列，是一種快速且準確的新型鑒定技術(shù)[63]。目前，已經(jīng)有T1R1/T1R3[64]及TMC4[65]等受體應(yīng)用于咸味肽鑒定。Shan 等[66]將酵母抽提物與T1R1/T1R3 進行特異性結(jié)合，結(jié)果表明，KLLLLPKP、GGISTGNLN、LVKGGLIP 和SSAVK 具有咸味及咸味增強作用，其中GGISTGNLN 的咸味閾值為157.47 mg/L。Shen等[67]利用TMC4 對酵母抽提物中的咸味肽進行鑒定，進一步確定PN、NSE、NE、SPE 為咸味肽。綜上所述，利用受體蛋白可以大大提高咸味肽的可識別性，作為一種新型技術(shù)可以進一步提高咸味肽的開發(fā)及應(yīng)用。

6 植物源咸味肽的應(yīng)用

植物源咸味肽作為咸味肽中的一種，不僅可以增強咸味感知，還具有一定的功能特性，效果優(yōu)于非鈉鹽和風(fēng)味改良劑。隨著咸味肽的不斷發(fā)展，目前已經(jīng)應(yīng)用在咸味香精、增咸烹飪鹽及咸味增強劑等方面。

6.1 咸味香精

自20 世紀80 年代開始，我國咸味香精的研究已經(jīng)過快速發(fā)展，目前在咸味香精領(lǐng)域已經(jīng)處于世界前列[68]。目前，利用美拉德反應(yīng)制備咸味香精已成為研究重點，其制備的咸味香精與調(diào)制香精相比，具有香氣飽滿及口感細膩等優(yōu)點。咸味香精是植物蛋白酶解后產(chǎn)生的咸味肽與還原糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。以大豆粕酶解液為原料，通過美拉德反應(yīng)制備咸味香精，并利用高效液相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜對咸味香精進行分析，檢測出癸醛、2-癸酮、2-己基呋喃等物質(zhì)，對肉香味的生成具有重要作用[69]。

6.2 增咸烹飪鹽

為響應(yīng)國家低鈉減鹽的號召，利用咸味肽可以增強咸味的特點開發(fā)的增咸烹飪鹽已經(jīng)成為了一種新的趨勢。咸味肽可以提高食用鹽的咸度，因此可以減少食鹽中的鈉含量，進而減少因過度攝入鈉離子導(dǎo)致的高血壓等心血管疾病。當(dāng)前已有產(chǎn)品將酵母源咸味肽、水果有機酸按照一定比例加入精制食鹽中，其咸度在精制食鹽的基礎(chǔ)上提高30%，做到真正的減鹽不減咸[70]。

6.3 咸味增強劑

咸味增強劑是利用酶解技術(shù)制備的具有咸鮮風(fēng)味，并且具有營養(yǎng)保健的功能，可用于開發(fā)功能性食品。王欣等[71]利用0.1%的木瓜蛋白酶對哈氏仿對蝦蛋白進行酶解，得到的咸味肽咸度能將10 mmol/L提高到55 mmol/L。同時也有研究使用木瓜蛋白酶酶解淘汰蛋雞來獲得咸味肽，結(jié)果表明，咸味肽可以將50 mmol/L NaCl 的咸度提高26.2%[72]。

7 結(jié)論與展望

咸味肽作為具有一定的增咸、增鮮作用的天然咸味劑，在響應(yīng)國家低鈉減鹽號召的同時，也滿足消費者對天然產(chǎn)品的需求，因此開發(fā)咸味肽產(chǎn)品，受到了眾多消費者的歡迎。我國作為農(nóng)業(yè)大國，擁有豐富的農(nóng)業(yè)資源，但對植物源咸味肽的探究相對較少。目前，關(guān)于植物源咸味肽的制備及應(yīng)用過程中需要解決以下問題：a.目前對于植物源咸味肽的呈味機理、構(gòu)效關(guān)系、制備鑒定及應(yīng)用方面仍需進一步深入；b.如何基于鑒定技術(shù)客觀反映不同制備方法產(chǎn)出的植物源咸味肽的呈味效果；c.目前制備植物源咸味肽的成本較高，應(yīng)探索出更簡便、高效的制備技術(shù)。植物源咸味肽不僅可以降低人體鈉離子的攝入量，而且還具有一定的咸度，可以在一定條件下起到代替食用鹽的作用，同時可以降低人體高血壓等心血管疾病的發(fā)病率，植物源咸味肽的開發(fā)與應(yīng)用具有廣闊的前景。