MC4R和NR6A1基因與大白豬×清平豬F2黑色群體的經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)分析

熊琪 陳文娟 彭健

摘要：選擇MC4R和NR6A1基因分別對大白豬與清平豬雜交群體F2后代中黑色個(gè)體的胴體和生長進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，以期為生產(chǎn)實(shí)踐中對清平豬雜交品系的選育提供理論依據(jù)。結(jié)果表明，MC4R的優(yōu)勢基因?yàn)镚等位基因，不同基因型明顯影響背膘厚，AA型個(gè)體的平均日增重與AG型個(gè)體差異顯著（P<0.05），與GG型個(gè)體差異極顯著（P<0.01），其有利基因型為GG型;NR6A1的優(yōu)勢基因?yàn)锳等位基因，不同基因型對背膘厚的影響差異明顯，其對胴體和生長性狀的有利基因分別為A和G等位基因。

關(guān)鍵詞：清平豬;候選基因;胴體性狀;生長性狀;關(guān)聯(lián)性分析

中圖分類號：S828? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）05-0088-04

MC4R）屬于跨膜G蛋白耦聯(lián)受體（G-Protein Coupled Receptor，GPCRs）家族，是在下丘腦中合成的一種多肽類物質(zhì)[1]。MC4R大量存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，其與配體結(jié)合后通過G蛋白提高腺苷酸環(huán)化酶（Adenylyl cyclase，AC）的活性，再激活蛋白激酶（Protein kinase A，PKA）調(diào)控細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度[2，3]。因此MC4R能調(diào)節(jié)動(dòng)物的脂肪沉積與物質(zhì)代謝，維持體內(nèi)能量的動(dòng)態(tài)平衡，在影響動(dòng)物采食量、體重以及能量穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[1，4]。Kim等[3]首次報(bào)道豬MC4R基因高度保守區(qū)內(nèi)發(fā)生了一個(gè)錯(cuò)義突變Asp298Asn，并指出該位點(diǎn)的多態(tài)性與背膘厚和生長速度有關(guān)。李星潤等[1]對杜洛克、長白、大白共569頭豬的MC4R基因進(jìn)行了研究，結(jié)果表明在杜洛克和大白豬中對生長和胴體性狀有利的基因型分別為GA型和AA型，而長白豬中不同基因型差異不顯著。李慶崗等[5]研究發(fā)現(xiàn)淮豬新品系豬群中GG型與AA型相比，生長速度更快，活體背膘更薄。MC4R基因是公認(rèn)的對豬生長和胴體性能有影響的主效基因之一，很多研究結(jié)果證明，豬MC4R基因的多態(tài)性與生長率、背膘厚和采食量呈強(qiáng)相關(guān)，是畜禽生長性狀的重要候選基因之一[1，5-7]。

生殖細(xì)胞核因子（Nuclear receptor subfamily 6 group A member 1，NR6A1）屬于核受體超家族，該家族是一組配體激活的，通過在信號分子與轉(zhuǎn)錄應(yīng)答間建立聯(lián)系的轉(zhuǎn)錄因子家族。NR6A1位于SSC1與椎骨數(shù)量變化相關(guān)的QTL區(qū)域，能調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理過程，尤其是胚胎干細(xì)胞的生長和分化，影響生殖與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，與脂肪沉積、產(chǎn)仔數(shù)和豬的脊椎數(shù)等性狀有關(guān)[8-10]。Rubin等[11]對豬的全基因組進(jìn)行了測序，分析發(fā)現(xiàn)豬的體長性狀和椎骨數(shù)目的變化與NR6A1、PLAG1和LCORL基因顯著相關(guān)。Yang等[12]檢測了3個(gè)西方豬種和7個(gè)中國豬種共519頭豬NR6A1（c.575T>C）位點(diǎn)等位基因的頻率，結(jié)果表明T等位基因在西方豬種中基本固定，中國豬種里岔黑豬中T等位基因頻率達(dá)到0.585，他們推測里岔黑豬中可能引入了西方豬種的血液，且里岔黑豬較高的椎體數(shù)量（平均脊椎數(shù)為21.5個(gè)）與NR6A1基因的多態(tài)性有關(guān)。范家萌等[13]對東北民豬和荷包豬進(jìn)行了NR6A1基因單核苷酸多態(tài)性檢測，結(jié)果顯示NR6A1基因與體尺性狀相關(guān)，并指出其是調(diào)節(jié)民豬生長性狀的功能基因。

清平豬是國家級保護(hù)目錄品種，繁殖性能好，但其生長速度較外來豬種慢。目前黑色豬肉在市場上被認(rèn)為是地方優(yōu)質(zhì)豬肉的一個(gè)顯著標(biāo)志。因此，期望利用分子標(biāo)記早期輔助選擇的手段，培育出兼具清平豬和外來豬種優(yōu)良特性的毛色為純黑清平豬新品系。對一些影響清平豬胴體與生長的關(guān)鍵基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，可以為后期高效利用分子標(biāo)記早期輔助選擇，加快培育出新清平豬品系奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)樣品

所有的試驗(yàn)豬群均來自湖北省當(dāng)陽市清平種豬場，其中F1為清平豬（♀）與法系大白豬（♂）的雜交后代，F(xiàn)2群體是F1群體橫交后所選留的黑色個(gè)體。用于基因型頻率分析的F2群體黑豬個(gè)體約600頭。在全部黑色F2群體中，主要記錄了219頭雌性個(gè)體的眼肌面積和100 kg背膘厚等胴體性狀，以及83頭雌性個(gè)體的平均日增重和達(dá)100 kg日齡等生長性狀。利用常規(guī)的酚/氯仿抽提法提取基因組DNA，DNA 樣品被稀釋成50 ng/μL備用。

1.2? 試驗(yàn)所需試劑

PCR擴(kuò)增引物由奧科生物技術(shù)公司合成，引物詳細(xì)信息見表1。Taq酶等分子生物學(xué)試劑購自TaKaRa。試驗(yàn)中常規(guī)試劑購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)備科。

1.3? MC4R基因G158A突變位點(diǎn)與NR6A1基因A200G突變位點(diǎn)的測序分型

根據(jù)候選基因測序引物信息（表1），交測序公司合成測序引物。以樣品的全基因組DNA為模板，配制候選基因的PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。吸取10 μL樣本送往武漢基諾賽克公司進(jìn)行多態(tài)性測序，測序步驟包括：①首先使用捕獲引物捕獲各目標(biāo)位點(diǎn)的DNA序列，然后回收產(chǎn)物并質(zhì)檢合格后依據(jù)Illumina文庫構(gòu)建流程完成Paired-end（PE）測序文庫的構(gòu)建。②取各個(gè)樣本等量DNA構(gòu)建一個(gè)PE文庫并在Illumina Hiseq測序儀上進(jìn)行PE150測序。③對于下機(jī)的原始數(shù)據(jù)，首先進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控，得到高質(zhì)量的cleandata，然后使用BWA軟件將cleandata分解到各目標(biāo)位點(diǎn)，得到SAM格式的比對結(jié)果，再使用軟件samtools將SAM格式的文件轉(zhuǎn)換成BAM格式，接著使用Picard工具中的SortSam對BAM文件中的reads進(jìn)行排序，得到最終的BAM文件。最后，使用GATK確定各目標(biāo)位點(diǎn)的基因型以及測序深度。

1.4? 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel表格對候選基因進(jìn)行基因型頻率和基因頻率的計(jì)算。不同基因型對繁殖性狀值的最小二乘分析使用SAS（8.0版）的GLM（General linear model）軟件包進(jìn)行，關(guān)聯(lián)分析的模型為Y=總體均值+基因型效應(yīng)+殘差，其中Y為性狀表型值。加性效應(yīng)=（XBB-XAA）/2，顯性效應(yīng)=XAB-（XAA+XBB）/2，其中XAA、XAB和XBB分別表示AA型個(gè)體、AB型個(gè)體和BB型個(gè)體對應(yīng)的表型數(shù)據(jù)的平均值。用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，確定有利基因和有利基因型。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 候選基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因和基因型頻率的統(tǒng)計(jì)分析

候選基因的基因和基因型頻率見表2，由表2可知，用測序方法共檢測了1 257頭F2群體的MC4R基因的多態(tài)性，其中F2黑豬318頭，其3種基因型頻率趨勢均為AG>GG>AA，優(yōu)勢基因均為G等位基因;F2群體中NR6A1基因具有多態(tài)性，其A等位基因和G等位基因的基因頻率分別為0.579 3和0.420 7，優(yōu)勢基因?yàn)锳基因。

2.2? MC4R不同基因型與胴體性狀的關(guān)聯(lián)性分析

MC4R不同基因型與F2群體胴體性狀的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果如表3所示。MC4R基因的AA型個(gè)體和AG型個(gè)體的眼肌面積比GG型的分別高0.38 cm2和0.91 cm2，但是3種基因型之間差異不顯著。MC4R不同基因型對100 kg背膘厚的影響為AA>AG>GG，加性效應(yīng)為1.35 mm，且AA型個(gè)體與AG型和GG型個(gè)體差異均顯著（P<0.05）。

2.3? MC4R不同基因型與生長性狀的關(guān)聯(lián)性分析

MC4R不同基因型與F2群體生長性狀的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果如表4所示。MC4R基因不同基因型對平均日增重的影響趨勢為GG>AG>AA，GG型和AG型個(gè)體比AA型個(gè)體分別高0.06 kg和0.05 kg，且AA型個(gè)體和AG型個(gè)體差異顯著（P<0.05），與GG型個(gè)體差異極顯著（P<0.01）。3種基因型對達(dá)100 kg日齡的加性效應(yīng)為2.61 d，其中GG型個(gè)體比AG型個(gè)體短4.1 d，3種基因型差異不顯著。

這些結(jié)果表明MC4R GG基因型的背膘最薄，日增重最大，且不同基因型之間的差異明顯，因此該基因的多態(tài)性位點(diǎn)可以作為F2群體選育的指標(biāo)之一。

2.4? NR6A1不同基因型與胴體性狀的關(guān)聯(lián)性分析

NR6A1不同基因型與F2群體胴體性狀的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果如表5所示。NR6A1不同基因型對眼肌面積的影響趨勢為AA>AG>GG，加性效應(yīng)為0.19 cm2，3種基因型差異均不顯著。NR6A1對100 kg背膘厚的影響為AA

2.5? NR6A1不同基因型與生長性狀的關(guān)聯(lián)性分析

NR6A1不同基因型與F2群體生長性狀的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果如表6所示。NR6A1 3種基因型對平均日增重的影響為AG>GG>AA，AG型和GG型個(gè)體的平均日增重比AA型的分別高0.053 kg和0.037 kg，且AA型與GG型差異接近顯著水平（P≈0.05）。NR6A1不同基因型對達(dá)100 kg日齡的影響為GG

3? 小結(jié)與討論

MC4R不同基因型與背膘厚相關(guān)性的研究結(jié)果并不一致，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MC4R基因的GG型和AG型個(gè)體背膘厚比AA型平均薄2.70 mm和2.53 mm，二者均與AA型差異顯著（P<0.05），與李慶崗等[5]對淮豬新品系的研究結(jié)果相符。MC4R基因?qū)ρ奂∶娣e的影響為AG>AA>GG，差異不顯著。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，推測MC4R基因的GG型能降低背膘厚，從而提高胴體瘦肉率。目前對NR6A1基因多態(tài)性的研究主要集中于肋骨數(shù)、體長和體尺等性狀[11，13]，對該基因與胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析研究較少。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)NR6A1基因的AA型比AG型和GG型的平均眼肌面積分別高0.22 cm2和1.18 cm2，平均背膘厚分別薄0.19 mm和2.25 mm，且3種基因型對背膘厚的影響差異明顯，推測NR6A1基因的AA型個(gè)體可能具有更優(yōu)良的胴體性能，即GG突變型個(gè)體對脊椎數(shù)等生長性狀有利，但是可能與某些胴體性狀負(fù)相關(guān)，這一結(jié)果與Huang等[14]在PIC豬上的發(fā)現(xiàn)相符。因此在進(jìn)行清平豬雜交后代胴體性狀的選育時(shí)，可以選擇性淘汰部分NR6A1基因的GG型個(gè)體和MC4R基因的AA型個(gè)體，篩選出AA-GG（NR6A1-MC4R）個(gè)體，從而提高有利基因在群體中的頻率。同時(shí)需要擴(kuò)大胴體性狀分析的樣本容量，對候選基因繼續(xù)進(jìn)行驗(yàn)證，以確定其對群體的選育是否有準(zhǔn)確的指導(dǎo)作用。

MC4R基因不同基因型對平均日增重的影響趨勢為GG>AG>AA，3種基因型對達(dá)100 kg日齡的加性效應(yīng)為2.61 d，推測MC4R對生長性狀的有利基因?yàn)镚等位基因，該基因可能能提高豬的生長速度，降低育種周期，這與李慶崗等[5]、韓雪蕾等[15]、肖石軍等[16]的研究結(jié)果相符，表明MC4R基因?qū)Σ煌i種的影響可能具有一致性，因此可以將其作為清平豬雜交群體生長性狀選育的候選基因。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，對F2群體胴體和生長性能的選育工作提出如下建議：①NR6A1基因的AA野生型對胴體性能有利，但是大量文獻(xiàn)報(bào)道其突變型GG與脊椎數(shù)正相關(guān)，因此需要針對具體的育種目標(biāo)對群體的NR6A1基因進(jìn)行選育。②MC4R基因?qū)﹄伢w和生長性狀的有利基因均為G等位基因，因此在進(jìn)行F2群體的選育時(shí)應(yīng)保留GG型個(gè)體，從而在降低群體背膘厚的同時(shí)提高生長速度。

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