G、g.3844T>A、g.4297C>G、g.4355G>C。其中,g.3501T>"/>
  • <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    斑點(diǎn)叉尾MSTN基因4個(gè)SNP位點(diǎn)及其與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性

    2017-02-27 10:31張世勇王明華鐘立強(qiáng)
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年1期
    關(guān)鍵詞:關(guān)聯(lián)分析

    張世勇+王明華+鐘立強(qiáng)

    摘要:采用DNA混池測(cè)序法篩選斑點(diǎn)叉尾肌肉生長(zhǎng)抑制素(MSTN)基因SNP位點(diǎn),同時(shí)使用SNaPshot法將篩選到的SNP多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行分型,最后與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。共篩選到4個(gè)SNP位點(diǎn),即g.3501 T>G、g.3844 T>A、g.4297 C>G、g.4355 G>C。其中,g.3501 T>G位于第一內(nèi)含子;g.3844 T>A位于第二外顯子,并造成密碼子GUA變?yōu)镚AA,氨基酸由纈氨酸(Val)變?yōu)楣劝彼幔℅lu);g.4297 C>G、g.4355 C>G位于第二內(nèi)含子。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明,SNP位點(diǎn)g.4355 G>C與斑點(diǎn)叉尾的體質(zhì)量和體長(zhǎng)呈顯著性負(fù)相關(guān),具有GG基因型個(gè)體的體質(zhì)量和體長(zhǎng)顯著性低于CC型和CG型(P<0.05),該位點(diǎn)可作為斑點(diǎn)叉尾分子育種的候選分子標(biāo)記。

    關(guān)鍵詞:斑點(diǎn)叉尾;MSTN;SNP;SNaPshot;生長(zhǎng)性狀;關(guān)聯(lián)分析

    中圖分類號(hào): Q953;S917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào):1002-1302(2017)01-0030-03

    肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin,MSTN)是骨形成蛋白家族(bone morphogenetic protein family)和TGF-β超家族成員之一,又被稱為生長(zhǎng)分化因子8(growth and differentiation factor 8,GDF-8)。MSTN基因是肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵基因,它編碼的蛋白是骨骼肌生長(zhǎng)的負(fù)性調(diào)控因子。McPherron等敲除小鼠的MSTN基因,發(fā)現(xiàn)小鼠骨骼肌生長(zhǎng)加快[1];在斑馬魚(yú)中進(jìn)行的MSTN基因敲除試驗(yàn)具有類似的試驗(yàn)結(jié)果[2]。脊椎動(dòng)物中MSTN基因的結(jié)構(gòu)和功能具有較高的保守性[3],因此可將MSTN基因作為哺乳動(dòng)物及魚(yú)類等物種的候選生長(zhǎng)相關(guān)基因。

    斑點(diǎn)叉尾(Ictalures punctatus)別稱美洲鲇、溝鲇,屬于鲇形目(Siluriformes)科(Ictaluridae),原產(chǎn)于美國(guó),是一種重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)類物種,具有肉質(zhì)細(xì)膩、適溫范圍廣、生長(zhǎng)速度快、抗病能力強(qiáng)等特點(diǎn),2013年全世界養(yǎng)殖產(chǎn)量為 419 215 t[4]。斑點(diǎn)叉尾自1984年引入國(guó)內(nèi)后,養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量逐年增加,2013年我國(guó)養(yǎng)殖產(chǎn)量占全世界的一半以上,產(chǎn)量達(dá)224 132 t[5]。隨著我國(guó)斑點(diǎn)叉尾養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展,已經(jīng)出現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)減慢、體色分化、規(guī)格不齊等種質(zhì)衰退現(xiàn)象[6];因此,培育生長(zhǎng)快、抗逆性強(qiáng)的斑點(diǎn)叉尾新品種(系)已成為當(dāng)前斑點(diǎn)叉尾產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展亟待解決的重要問(wèn)題。本研究將MSTN基因作為斑點(diǎn)叉尾生長(zhǎng)發(fā)育性狀的候選基因進(jìn)行了SNP多態(tài)性檢測(cè),并將篩選到的SNP位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,旨在為斑點(diǎn)叉尾分子標(biāo)記輔助育種提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

    供試斑點(diǎn)叉尾樣本均來(lái)自江蘇省淡水水產(chǎn)研究所祿口試驗(yàn)基地。于2013年6月進(jìn)行家系培育,為減小環(huán)境對(duì)斑點(diǎn)叉尾生長(zhǎng)的影響,苗種培育按照同一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行,即均一的換水速率、投喂量、養(yǎng)殖密度、充氧量、水溫。待稚魚(yú)日齡為30 d時(shí),每個(gè)家系隨機(jī)選取300尾于室外水泥池進(jìn)行培育。家系日齡達(dá)到120 d時(shí),每個(gè)家系隨機(jī)選取50尾魚(yú)注射RFID電子標(biāo)記,并記錄每尾魚(yú)的電子編號(hào)、家系編號(hào)、體質(zhì)量、體長(zhǎng)等信息。標(biāo)記后將魚(yú)移至土池培育,家系平均日齡為520 d時(shí),掃描并記錄存活個(gè)體編號(hào),測(cè)量個(gè)體的體質(zhì)量、體長(zhǎng)等信息。同時(shí)采集每尾魚(yú)的尾鰭組織,放入95%乙醇中,于 -20 ℃ 下保存。

    1.2 基因組DNA提取

    斑點(diǎn)叉尾尾鰭DNA的提取使用UNIQ-10型柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程有限公司),按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取效果,采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA樣品濃度。

    1.3 引物設(shè)計(jì)

    根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)公布的斑點(diǎn)叉尾MSTN基因序列(AF396747.1),采用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)2對(duì)引物(表1)。第1對(duì)引物(P1)主要用于擴(kuò)增第一外顯子及5′非編碼區(qū)、第一內(nèi)含子部分序列,第2對(duì)引物(P2)主要用于擴(kuò)增第二外顯子、第二內(nèi)含子、第三外顯子及第一內(nèi)含子、3′非編碼區(qū)部分序列。

    1.4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

    隨機(jī)抽取40尾斑點(diǎn)叉尾的DNA樣品,將每個(gè)樣品的質(zhì)量濃度調(diào)整至100 ng/μL ,各取1 μL 混合構(gòu)建DNA池。以DNA池和20尾個(gè)體基因組DNA為模板,利用所設(shè)計(jì)的2對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用即用型UtraTaq酶PCR試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。40 μL PCR反應(yīng)體系為:2×UltraTaq Master Mix試劑20 μL、基因組DNA 2 μL、上游及下游引物(質(zhì)量濃度為10 pmol/μL)各2 μL、ddH2O 14 μL 。采用BIOMETRA T1型PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,退火30 s,72 ℃延伸60 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,利用凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。PCR產(chǎn)物純化后送至生工生物工程(上海)股份有限公司,直接采用ABI 3730XL型測(cè)序儀測(cè)序。所得結(jié)果使用Chromas軟件觀察測(cè)序峰圖,并結(jié)合使用ClustalX軟件進(jìn)行DNA序列比對(duì),判斷SNP位點(diǎn)的堿基類型。

    1.5 SNaPshot法SNP分型

    采用SNaPshot法對(duì)4個(gè)家系共176尾魚(yú)進(jìn)行SNP位點(diǎn)分型。根據(jù)SNP位點(diǎn)側(cè)翼序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,使擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為200~500 bp。延伸引物3′端第1個(gè)堿基緊鄰待測(cè)SNP位點(diǎn),Tm值為50 ℃以上,并且在引物的5′末端加上不同長(zhǎng)度的Poly C或Poly T。

    采用Touchdown PCR程序進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增,20 μL 反應(yīng)體系為:0.8 μL MgCl2(50 mmol/L)、2 μL 10×PCR buffer(Mg2+ free)、0.5 μL dNTP(10 mmol/L)、0.5 μL混合引物、1 μL 模板DNA、0.5 μL Platinum Taq(5 U),其余用ddH2O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性15 s,60 ℃ 退火15 s,72 ℃延伸30 s,30個(gè)循環(huán);共11個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.5 ℃;94 ℃變性15 s,54 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s,共24個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。反應(yīng)完成后進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化,10 μL 反應(yīng)體系為:FastAP(Thermosensitive Alkaline Phosphatase,F(xiàn)ermentas)0.8 μL、ExoⅠ 0.2 μL、ExoⅠ buffer 0.7 μL、PCR產(chǎn)物3 μL、H2O 5.3 μL 。反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min,80 ℃ 15 min,純化后進(jìn)行延伸反應(yīng),并預(yù)先混勻延伸引物。

    SNP分型采用ABI SNaPshot Multiplex PCR試劑盒(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司),6 μL 反應(yīng)體系為:Snapshot Mix 1 μL、延伸引物0.1 μL、多重PCR產(chǎn)物2 μL、ddH2O 2.9 μL 。反應(yīng)條件為:96 ℃預(yù)變性1 min;96 ℃變性10 s,52 ℃退火5 s,60 ℃延伸30 s,共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后加入1 U FastAP,并以37 ℃ 60 min、85 ℃ 15 min條件進(jìn)行純化。以GeneScan-120Liz Size Standard(ABI)為內(nèi)標(biāo),取1 μL 產(chǎn)物與9 μL 含有Liz的Hi-Di(GS-120Liz ∶Hi-Di=1 ∶200)混合,95 ℃變性3 min,立即冰浴3 min后上測(cè)序儀。采用ABI PRISM 3730 XI型自動(dòng)遺傳分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)及分析,并利用Genemapper v4.1軟件進(jìn)行分型。

    1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

    利用R(3.0.1)軟件對(duì)試驗(yàn)斑點(diǎn)叉尾SNP位點(diǎn)的各基因型體質(zhì)量、體長(zhǎng)進(jìn)行方差齊性分析(homogeneity of variance test)和單因素ANOVA(one-way ANOVA)分析。采用均值多重比較(multiple comparisons of means)方法分析SNP位點(diǎn)各基因型與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)程度。統(tǒng)計(jì)分析模型為:

    Yij=μ+Gi+eij。

    式中:Yij為某個(gè)性狀第i個(gè)標(biāo)記第j個(gè)個(gè)體觀測(cè)值,μ為試驗(yàn)觀測(cè)所有個(gè)體的平均值(即總體平均值),Gi為第i個(gè)標(biāo)記的效應(yīng)值,eij為對(duì)應(yīng)于觀察值的隨機(jī)殘差效應(yīng)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 MSTN基因SNP位點(diǎn)篩選

    利用所設(shè)計(jì)的2對(duì)引物對(duì)40尾斑點(diǎn)叉尾構(gòu)建的DNA池及20尾個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序分析。共篩選出4個(gè)SNP位點(diǎn),即g.3501 T>G、g.3844 T>A、g.4297 C>G、g.4355 G>C,且所有位點(diǎn)均由第2對(duì)引物擴(kuò)增得到。其中,g.3501 T>G位于第一內(nèi)含子;g.3844 T>A位于第二外顯子,密碼子GUA變?yōu)镚AA,氨基酸由纈氨酸(Val)變?yōu)楣劝彼幔℅lu);g.4297 C>G、g.4355 C>G位于第二內(nèi)含子(圖1)。

    2.2 SNP位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析

    對(duì)斑點(diǎn)叉尾4個(gè)家系176尾魚(yú)的體質(zhì)量和體長(zhǎng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。體質(zhì)量、體長(zhǎng)分別為(280.63±13.21) g、(31.26±0.56) cm。采用R軟件將篩選得到的4個(gè)SNP位點(diǎn)與測(cè)量的斑點(diǎn)叉尾體質(zhì)量、體長(zhǎng)進(jìn)行單因素ANOVA分析,并結(jié)合均值多重比較分析得出,4個(gè)SNPs中的1個(gè)(g.4355 G>C)與斑點(diǎn)叉尾體質(zhì)量、體長(zhǎng)呈顯著性負(fù)相關(guān)(表2)。在SNP位點(diǎn)g.4355 G>C,具有GG基因型個(gè)體的體質(zhì)量、體長(zhǎng)顯著性低于CC型和CG型(P<005)。

    3 結(jié)論與討論

    MSTN基因具有多種重要功能,它在哺乳動(dòng)物中的主要功能為調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育過(guò)程中肌纖維的數(shù)量,以及抑制肌纖維的生長(zhǎng)[1]。MSTN基因多態(tài)性及其與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析研究最早于哺乳動(dòng)物中進(jìn)行,綿羊、豬、中國(guó)肉牛等[7-11]均已發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀之間存在相關(guān)性。近年來(lái),在鯉魚(yú)、羅非魚(yú)、黃顙魚(yú)、圓斑星鰈、鱸魚(yú)、鳙魚(yú)等[3,12-18]重要的水產(chǎn)動(dòng)物中也開(kāi)展了相關(guān)研究。唐永凱等在吉富羅非魚(yú)中篩選到1個(gè)與增質(zhì)量顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)[13]。朱媛媛等、陳校輝等先后對(duì)黃顙魚(yú)MSTN基因進(jìn)行研究,均發(fā)現(xiàn)了造成不同個(gè)體間生長(zhǎng)性狀顯著性差異的SNP位點(diǎn)[14-15]。

    本研究在斑點(diǎn)叉尾MSTN基因中共篩選到4個(gè)SNP位點(diǎn),其中1個(gè)SNP位點(diǎn)位于第二外顯子,其余3個(gè)均位于內(nèi)含子區(qū)域。將篩選到的SNP位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果表明SNP g.4355 C>G與生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)。具有GG型個(gè)體的體質(zhì)量、體長(zhǎng)顯著低于CC型和CG型, GG型個(gè)體的平均體質(zhì)量、平均體長(zhǎng)分別比4個(gè)家系所有個(gè)體體質(zhì)量、體長(zhǎng)的平均值小30%、10%。4個(gè)家系中的個(gè)體以CC型和CG型為主,具有GG型的個(gè)體較少。綜合推測(cè)該位點(diǎn)GG型屬于隱性突變,由于該位點(diǎn)堿基突變?cè)斐蒑STN基因的表達(dá)量升高,進(jìn)而抑制了斑點(diǎn)叉尾的生長(zhǎng)。這種現(xiàn)象也存在于豬[9]、牛[11]、紅鰭東方鲀[3]的研究中。

    本研究獲得的與生長(zhǎng)性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)位于內(nèi)含子區(qū)域。盡管內(nèi)含子不具有編碼蛋白質(zhì)的能力,但其發(fā)生單核苷酸突變能夠顯著影響基因的表達(dá)效率。已有研究表明,內(nèi)含子的功能主要為轉(zhuǎn)錄調(diào)控,即在轉(zhuǎn)錄階段對(duì)相應(yīng)的基因進(jìn)行調(diào)控進(jìn)而影響生長(zhǎng)性狀[19]。越來(lái)越多的試驗(yàn)結(jié)果證明,內(nèi)含子在調(diào)控mRNA剪切、轉(zhuǎn)錄、基因表達(dá)方面起著重要作用[20-21],例如內(nèi)含子長(zhǎng)鏈非編碼RNA(intronic lncRNA)發(fā)生單核苷酸突變將使其調(diào)控的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平發(fā)生改變。然而,本研究中該SNP位點(diǎn)參與調(diào)控MSTN基因功能的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

    猜你喜歡
    關(guān)聯(lián)分析
    “鷹眼”大數(shù)據(jù)安全管控平臺(tái)的技術(shù)實(shí)現(xiàn)解析
    基于隨機(jī)函數(shù)Petri網(wǎng)的系統(tǒng)動(dòng)力學(xué)關(guān)聯(lián)分析模型
    午夜免费成人在线视频| 香蕉国产在线看| 天堂动漫精品| 91字幕亚洲| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久久久精品国产欧美久久久| 啪啪无遮挡十八禁网站| 精品国产美女av久久久久小说| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 性欧美人与动物交配| 国产精品二区激情视频| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产一区二区激情短视频| 亚洲 国产 在线| 亚洲一区二区三区不卡视频| 免费在线观看黄色视频的| 91成年电影在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 亚洲美女黄片视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 欧美zozozo另类| 国产真人三级小视频在线观看| www日本在线高清视频| 美女扒开内裤让男人捅视频| 精品久久久久久久末码| 91麻豆精品激情在线观看国产| 欧美亚洲日本最大视频资源| 91老司机精品| 亚洲免费av在线视频| 桃红色精品国产亚洲av| 国产精品免费一区二区三区在线| 少妇粗大呻吟视频| 我的亚洲天堂| 后天国语完整版免费观看| 天天添夜夜摸| 男人舔女人的私密视频| 热re99久久国产66热| 最新在线观看一区二区三区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 黑丝袜美女国产一区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| av有码第一页| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 麻豆成人av在线观看| 中文在线观看免费www的网站 | 日本 av在线| 日本黄色视频三级网站网址| 国产激情偷乱视频一区二区| av片东京热男人的天堂| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲第一青青草原| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 可以在线观看的亚洲视频| 两个人视频免费观看高清| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 亚洲精品av麻豆狂野| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 69av精品久久久久久| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 校园春色视频在线观看| 大香蕉久久成人网| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 97碰自拍视频| 搡老岳熟女国产| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 深夜精品福利| 免费高清视频大片| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 母亲3免费完整高清在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 日韩三级视频一区二区三区| 亚洲精品在线美女| 亚洲专区字幕在线| 日本在线视频免费播放| 欧美一级毛片孕妇| 香蕉国产在线看| 久久久国产成人免费| 午夜精品久久久久久毛片777| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 免费av毛片视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| av天堂在线播放| 亚洲全国av大片| 久久久久久人人人人人| 999久久久精品免费观看国产| netflix在线观看网站| 精品国产乱子伦一区二区三区| 成人亚洲精品av一区二区| 在线观看日韩欧美| 好男人在线观看高清免费视频 | 日日夜夜操网爽| 国产成人av激情在线播放| 国产精品永久免费网站| 1024手机看黄色片| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 成人亚洲精品一区在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 人人澡人人妻人| 久久伊人香网站| 亚洲一区高清亚洲精品| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲五月天丁香| 日本免费a在线| 啦啦啦 在线观看视频| 国产精品,欧美在线| 黄色女人牲交| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产精品久久久av美女十八| 国产野战对白在线观看| 亚洲全国av大片| 12—13女人毛片做爰片一| 一边摸一边做爽爽视频免费| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 精品电影一区二区在线| 成人国产综合亚洲| 国产亚洲精品av在线| 91麻豆av在线| 国产区一区二久久| 精品无人区乱码1区二区| 性欧美人与动物交配| 少妇的丰满在线观看| 99精品久久久久人妻精品| av片东京热男人的天堂| 久久精品91无色码中文字幕| 露出奶头的视频| 亚洲,欧美精品.| 国产又爽黄色视频| 国产三级在线视频| 丝袜在线中文字幕| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产精品永久免费网站| 亚洲免费av在线视频| 欧美色欧美亚洲另类二区| 男人操女人黄网站| 久久精品成人免费网站| 亚洲七黄色美女视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 两个人免费观看高清视频| 啦啦啦免费观看视频1| 久久国产乱子伦精品免费另类| 老司机靠b影院| 欧美激情久久久久久爽电影| 超碰成人久久| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲一区高清亚洲精品| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲av成人av| 久久香蕉国产精品| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 成人午夜高清在线视频 | 老司机福利观看| 久久久久精品国产欧美久久久| xxx96com| 午夜免费鲁丝| 99国产精品99久久久久| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 精品卡一卡二卡四卡免费| 一本综合久久免费| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 手机成人av网站| 免费无遮挡裸体视频| 午夜激情av网站| 999精品在线视频| 自线自在国产av| 国产精品久久久av美女十八| 草草在线视频免费看| 丰满的人妻完整版| 亚洲第一青青草原| 国产精品九九99| 久久久国产精品麻豆| 一夜夜www| 中亚洲国语对白在线视频| 一本一本综合久久| 首页视频小说图片口味搜索| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产av一区在线观看免费| 国产精品永久免费网站| 亚洲天堂国产精品一区在线| 日韩大尺度精品在线看网址| 中文资源天堂在线| 中文亚洲av片在线观看爽| 老司机靠b影院| 神马国产精品三级电影在线观看 | 美女国产高潮福利片在线看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 熟女电影av网| 亚洲色图av天堂| 麻豆久久精品国产亚洲av| 成人三级黄色视频| 天堂动漫精品| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 18禁美女被吸乳视频| 黄片大片在线免费观看| 桃色一区二区三区在线观看| 国产av一区在线观看免费| 色播在线永久视频| 国产视频一区二区在线看| 男人舔女人的私密视频| 亚洲精品一区av在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲中文av在线| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 51午夜福利影视在线观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 免费人成视频x8x8入口观看| 视频在线观看一区二区三区| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲激情在线av| 日韩成人在线观看一区二区三区| 一进一出好大好爽视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 久久久久久久久免费视频了| 91九色精品人成在线观看| 不卡一级毛片| 丁香欧美五月| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 一边摸一边抽搐一进一小说| 在线看三级毛片| 观看免费一级毛片| 欧美乱色亚洲激情| 中文亚洲av片在线观看爽| www日本黄色视频网| 国产成年人精品一区二区| 69av精品久久久久久| 亚洲成人久久爱视频| 国产v大片淫在线免费观看| 制服人妻中文乱码| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产亚洲av高清不卡| 久久久国产欧美日韩av| 变态另类丝袜制服| 99riav亚洲国产免费| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 免费观看精品视频网站| 亚洲三区欧美一区| 黄色女人牲交| 国产精品精品国产色婷婷| 99国产综合亚洲精品| 一进一出抽搐动态| 久久国产精品人妻蜜桃| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产av在哪里看| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产精品久久视频播放| 特大巨黑吊av在线直播 | 国产精品,欧美在线| 欧美zozozo另类| 欧美丝袜亚洲另类 | 麻豆成人午夜福利视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 一区二区三区国产精品乱码| 麻豆成人av在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 日韩欧美三级三区| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 女警被强在线播放| www.熟女人妻精品国产| 中文字幕高清在线视频| 动漫黄色视频在线观看| 久久狼人影院| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 夜夜爽天天搞| 99热6这里只有精品| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 免费在线观看日本一区| 白带黄色成豆腐渣| 国产精品亚洲av一区麻豆| 一级毛片女人18水好多| 脱女人内裤的视频| 国产伦在线观看视频一区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 日本黄色视频三级网站网址| 精品人妻1区二区| www日本黄色视频网| 久久精品影院6| 国产精品日韩av在线免费观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 男人的好看免费观看在线视频 | 久久99热这里只有精品18| 久久狼人影院| 香蕉av资源在线| 免费高清在线观看日韩| 国产精品久久视频播放| 99久久综合精品五月天人人| 国产成人av激情在线播放| 欧美精品亚洲一区二区| av电影中文网址| 亚洲精品在线美女| 美女午夜性视频免费| 男女下面进入的视频免费午夜 | 亚洲av电影在线进入| 中亚洲国语对白在线视频| 男人操女人黄网站| 人妻久久中文字幕网| 9191精品国产免费久久| 中文亚洲av片在线观看爽| 自线自在国产av| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲黑人精品在线| 日韩有码中文字幕| 亚洲免费av在线视频| 国产av一区在线观看免费| 无限看片的www在线观看| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 免费高清视频大片| 午夜福利视频1000在线观看| 久久久国产成人精品二区| 亚洲精品av麻豆狂野| 欧美精品啪啪一区二区三区| av天堂在线播放| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 看黄色毛片网站| 动漫黄色视频在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 在线观看一区二区三区| 亚洲av美国av| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 婷婷亚洲欧美| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲熟妇熟女久久| 国产精品 国内视频| 高清毛片免费观看视频网站| 伦理电影免费视频| 天天一区二区日本电影三级| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产精品久久久av美女十八| 成人亚洲精品一区在线观看| 免费在线观看成人毛片| 99精品在免费线老司机午夜| 久久精品国产综合久久久| 动漫黄色视频在线观看| 久久天堂一区二区三区四区| cao死你这个sao货| 中文字幕精品亚洲无线码一区 | 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 免费在线观看亚洲国产| 午夜成年电影在线免费观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 欧美在线黄色| 18禁美女被吸乳视频| 男女视频在线观看网站免费 | 久久中文字幕一级| www.www免费av| 成年女人毛片免费观看观看9| 欧美最黄视频在线播放免费| 身体一侧抽搐| 国产精品,欧美在线| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 午夜老司机福利片| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 男女下面进入的视频免费午夜 | 久久精品91无色码中文字幕| 国产成人欧美在线观看| 亚洲av成人一区二区三| 韩国精品一区二区三区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 俺也久久电影网| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 免费无遮挡裸体视频| 国产成人系列免费观看| 日韩三级视频一区二区三区| 黄频高清免费视频| 大香蕉久久成人网| 午夜福利成人在线免费观看| 国产精品野战在线观看| 午夜视频精品福利| 亚洲无线在线观看| 久久九九热精品免费| 精品久久久久久久久久久久久 | 美国免费a级毛片| 日韩免费av在线播放| 精品国产美女av久久久久小说| 搡老妇女老女人老熟妇| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 久久午夜综合久久蜜桃| 99国产精品一区二区三区| 丁香欧美五月| 国产高清有码在线观看视频 | 国产av在哪里看| 精华霜和精华液先用哪个| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 精品国产美女av久久久久小说| 免费看美女性在线毛片视频| 人人妻人人澡人人看| 色av中文字幕| www日本在线高清视频| 久久狼人影院| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 久久青草综合色| 一边摸一边做爽爽视频免费| 丰满的人妻完整版| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 美女国产高潮福利片在线看| 国产一区在线观看成人免费| 18禁美女被吸乳视频| 在线看三级毛片| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 精品人妻1区二区| 变态另类丝袜制服| 亚洲免费av在线视频| 国产成+人综合+亚洲专区| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产精品久久电影中文字幕| 日韩国内少妇激情av| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 男人的好看免费观看在线视频 | 可以在线观看的亚洲视频| 中文字幕高清在线视频| 亚洲电影在线观看av| 国产一区二区在线av高清观看| 久99久视频精品免费| 窝窝影院91人妻| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日韩av在线大香蕉| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 日韩av在线大香蕉| 亚洲av片天天在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 女人被狂操c到高潮| 欧美黑人巨大hd| 美女扒开内裤让男人捅视频| 熟女电影av网| 天堂√8在线中文| 精品一区二区三区四区五区乱码| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 日韩精品免费视频一区二区三区| 中国美女看黄片| 精品久久久久久久久久久久久 | 日韩国内少妇激情av| 国产真人三级小视频在线观看| 老鸭窝网址在线观看| 久久这里只有精品19| www国产在线视频色| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 啦啦啦免费观看视频1| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产高清videossex| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 国产三级在线视频| 日本免费a在线| 成熟少妇高潮喷水视频| 久热爱精品视频在线9| 香蕉av资源在线| tocl精华| 精品卡一卡二卡四卡免费| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲成人久久性| 日本精品一区二区三区蜜桃| 三级毛片av免费| 少妇熟女aⅴ在线视频| 一a级毛片在线观看| 一本久久中文字幕| 免费一级毛片在线播放高清视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 欧美在线一区亚洲| 久久久久久久久免费视频了| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 久久这里只有精品19| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产精品久久久久久精品电影 | 国产熟女午夜一区二区三区| 观看免费一级毛片| 亚洲电影在线观看av| 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲一区高清亚洲精品| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 搞女人的毛片| 日韩精品免费视频一区二区三区| 成年人黄色毛片网站| 真人做人爱边吃奶动态| 美女午夜性视频免费| 制服诱惑二区| 国产熟女xx| 91麻豆精品激情在线观看国产| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| www日本在线高清视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 老鸭窝网址在线观看| 黄色毛片三级朝国网站| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 高清在线国产一区| 日韩欧美 国产精品| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产人伦9x9x在线观看| av中文乱码字幕在线| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲人成网站高清观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲精品av麻豆狂野| 婷婷精品国产亚洲av在线| 大型av网站在线播放| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 美女午夜性视频免费| 亚洲精华国产精华精| 中文资源天堂在线| 欧美午夜高清在线| 亚洲欧美激情综合另类| 午夜激情av网站| 宅男免费午夜| 成人国语在线视频| 又紧又爽又黄一区二区| 叶爱在线成人免费视频播放| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 久久人人精品亚洲av| 国产亚洲欧美精品永久| 国产av一区二区精品久久| 日韩欧美国产在线观看| 欧美在线黄色| 性欧美人与动物交配| 国产一区在线观看成人免费| 成年人黄色毛片网站| 在线观看66精品国产| 满18在线观看网站| 黑人操中国人逼视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 欧美大码av| 成人三级黄色视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 老汉色av国产亚洲站长工具| 男女之事视频高清在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 哪里可以看免费的av片| 午夜精品久久久久久毛片777| 久久午夜综合久久蜜桃| 两个人免费观看高清视频| 免费在线观看成人毛片| 国产精品影院久久| 亚洲成人久久爱视频| 老司机靠b影院| 欧美乱妇无乱码| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲一码二码三码区别大吗| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产av一区二区精品久久| 亚洲精品国产一区二区精华液| 波多野结衣av一区二区av| 好男人在线观看高清免费视频 | 村上凉子中文字幕在线| 一进一出抽搐动态| 中文亚洲av片在线观看爽| 成人午夜高清在线视频 | 制服丝袜大香蕉在线| 中文字幕高清在线视频| 99在线人妻在线中文字幕| 欧美一级a爱片免费观看看 | 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 十八禁人妻一区二区| 精品福利观看| 黄色视频,在线免费观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 午夜a级毛片| 成年免费大片在线观看| 韩国精品一区二区三区| 香蕉国产在线看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产精品久久久久久精品电影 | 中文字幕久久专区| 欧美中文日本在线观看视频| 婷婷亚洲欧美| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 中文资源天堂在线| 国产黄a三级三级三级人| 高潮久久久久久久久久久不卡| 久久久水蜜桃国产精品网| 亚洲av电影不卡..在线观看| 午夜影院日韩av| 国产精品亚洲av一区麻豆| 一区二区三区高清视频在线| 一本久久中文字幕| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 1024香蕉在线观看| aaaaa片日本免费| 91字幕亚洲| 亚洲成a人片在线一区二区| 精品电影一区二区在线| 国产精华一区二区三区| 少妇粗大呻吟视频|