G、g.3844T>A、g.4297C>G、g.4355G>C。其中,g.3501T>"/>
  • <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    斑點(diǎn)叉尾MSTN基因4個(gè)SNP位點(diǎn)及其與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性

    2017-02-27 10:31張世勇王明華鐘立強(qiáng)
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年1期
    關(guān)鍵詞:關(guān)聯(lián)分析

    張世勇+王明華+鐘立強(qiáng)

    摘要:采用DNA混池測(cè)序法篩選斑點(diǎn)叉尾肌肉生長(zhǎng)抑制素(MSTN)基因SNP位點(diǎn),同時(shí)使用SNaPshot法將篩選到的SNP多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行分型,最后與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。共篩選到4個(gè)SNP位點(diǎn),即g.3501 T>G、g.3844 T>A、g.4297 C>G、g.4355 G>C。其中,g.3501 T>G位于第一內(nèi)含子;g.3844 T>A位于第二外顯子,并造成密碼子GUA變?yōu)镚AA,氨基酸由纈氨酸(Val)變?yōu)楣劝彼幔℅lu);g.4297 C>G、g.4355 C>G位于第二內(nèi)含子。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明,SNP位點(diǎn)g.4355 G>C與斑點(diǎn)叉尾的體質(zhì)量和體長(zhǎng)呈顯著性負(fù)相關(guān),具有GG基因型個(gè)體的體質(zhì)量和體長(zhǎng)顯著性低于CC型和CG型(P<0.05),該位點(diǎn)可作為斑點(diǎn)叉尾分子育種的候選分子標(biāo)記。

    關(guān)鍵詞:斑點(diǎn)叉尾;MSTN;SNP;SNaPshot;生長(zhǎng)性狀;關(guān)聯(lián)分析

    中圖分類號(hào): Q953;S917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào):1002-1302(2017)01-0030-03

    肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin,MSTN)是骨形成蛋白家族(bone morphogenetic protein family)和TGF-β超家族成員之一,又被稱為生長(zhǎng)分化因子8(growth and differentiation factor 8,GDF-8)。MSTN基因是肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵基因,它編碼的蛋白是骨骼肌生長(zhǎng)的負(fù)性調(diào)控因子。McPherron等敲除小鼠的MSTN基因,發(fā)現(xiàn)小鼠骨骼肌生長(zhǎng)加快[1];在斑馬魚(yú)中進(jìn)行的MSTN基因敲除試驗(yàn)具有類似的試驗(yàn)結(jié)果[2]。脊椎動(dòng)物中MSTN基因的結(jié)構(gòu)和功能具有較高的保守性[3],因此可將MSTN基因作為哺乳動(dòng)物及魚(yú)類等物種的候選生長(zhǎng)相關(guān)基因。

    斑點(diǎn)叉尾(Ictalures punctatus)別稱美洲鲇、溝鲇,屬于鲇形目(Siluriformes)科(Ictaluridae),原產(chǎn)于美國(guó),是一種重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)類物種,具有肉質(zhì)細(xì)膩、適溫范圍廣、生長(zhǎng)速度快、抗病能力強(qiáng)等特點(diǎn),2013年全世界養(yǎng)殖產(chǎn)量為 419 215 t[4]。斑點(diǎn)叉尾自1984年引入國(guó)內(nèi)后,養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量逐年增加,2013年我國(guó)養(yǎng)殖產(chǎn)量占全世界的一半以上,產(chǎn)量達(dá)224 132 t[5]。隨著我國(guó)斑點(diǎn)叉尾養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展,已經(jīng)出現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)減慢、體色分化、規(guī)格不齊等種質(zhì)衰退現(xiàn)象[6];因此,培育生長(zhǎng)快、抗逆性強(qiáng)的斑點(diǎn)叉尾新品種(系)已成為當(dāng)前斑點(diǎn)叉尾產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展亟待解決的重要問(wèn)題。本研究將MSTN基因作為斑點(diǎn)叉尾生長(zhǎng)發(fā)育性狀的候選基因進(jìn)行了SNP多態(tài)性檢測(cè),并將篩選到的SNP位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,旨在為斑點(diǎn)叉尾分子標(biāo)記輔助育種提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

    供試斑點(diǎn)叉尾樣本均來(lái)自江蘇省淡水水產(chǎn)研究所祿口試驗(yàn)基地。于2013年6月進(jìn)行家系培育,為減小環(huán)境對(duì)斑點(diǎn)叉尾生長(zhǎng)的影響,苗種培育按照同一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行,即均一的換水速率、投喂量、養(yǎng)殖密度、充氧量、水溫。待稚魚(yú)日齡為30 d時(shí),每個(gè)家系隨機(jī)選取300尾于室外水泥池進(jìn)行培育。家系日齡達(dá)到120 d時(shí),每個(gè)家系隨機(jī)選取50尾魚(yú)注射RFID電子標(biāo)記,并記錄每尾魚(yú)的電子編號(hào)、家系編號(hào)、體質(zhì)量、體長(zhǎng)等信息。標(biāo)記后將魚(yú)移至土池培育,家系平均日齡為520 d時(shí),掃描并記錄存活個(gè)體編號(hào),測(cè)量個(gè)體的體質(zhì)量、體長(zhǎng)等信息。同時(shí)采集每尾魚(yú)的尾鰭組織,放入95%乙醇中,于 -20 ℃ 下保存。

    1.2 基因組DNA提取

    斑點(diǎn)叉尾尾鰭DNA的提取使用UNIQ-10型柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程有限公司),按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取效果,采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA樣品濃度。

    1.3 引物設(shè)計(jì)

    根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)公布的斑點(diǎn)叉尾MSTN基因序列(AF396747.1),采用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)2對(duì)引物(表1)。第1對(duì)引物(P1)主要用于擴(kuò)增第一外顯子及5′非編碼區(qū)、第一內(nèi)含子部分序列,第2對(duì)引物(P2)主要用于擴(kuò)增第二外顯子、第二內(nèi)含子、第三外顯子及第一內(nèi)含子、3′非編碼區(qū)部分序列。

    1.4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

    隨機(jī)抽取40尾斑點(diǎn)叉尾的DNA樣品,將每個(gè)樣品的質(zhì)量濃度調(diào)整至100 ng/μL ,各取1 μL 混合構(gòu)建DNA池。以DNA池和20尾個(gè)體基因組DNA為模板,利用所設(shè)計(jì)的2對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用即用型UtraTaq酶PCR試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。40 μL PCR反應(yīng)體系為:2×UltraTaq Master Mix試劑20 μL、基因組DNA 2 μL、上游及下游引物(質(zhì)量濃度為10 pmol/μL)各2 μL、ddH2O 14 μL 。采用BIOMETRA T1型PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,退火30 s,72 ℃延伸60 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,利用凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。PCR產(chǎn)物純化后送至生工生物工程(上海)股份有限公司,直接采用ABI 3730XL型測(cè)序儀測(cè)序。所得結(jié)果使用Chromas軟件觀察測(cè)序峰圖,并結(jié)合使用ClustalX軟件進(jìn)行DNA序列比對(duì),判斷SNP位點(diǎn)的堿基類型。

    1.5 SNaPshot法SNP分型

    采用SNaPshot法對(duì)4個(gè)家系共176尾魚(yú)進(jìn)行SNP位點(diǎn)分型。根據(jù)SNP位點(diǎn)側(cè)翼序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,使擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為200~500 bp。延伸引物3′端第1個(gè)堿基緊鄰待測(cè)SNP位點(diǎn),Tm值為50 ℃以上,并且在引物的5′末端加上不同長(zhǎng)度的Poly C或Poly T。

    采用Touchdown PCR程序進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增,20 μL 反應(yīng)體系為:0.8 μL MgCl2(50 mmol/L)、2 μL 10×PCR buffer(Mg2+ free)、0.5 μL dNTP(10 mmol/L)、0.5 μL混合引物、1 μL 模板DNA、0.5 μL Platinum Taq(5 U),其余用ddH2O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性15 s,60 ℃ 退火15 s,72 ℃延伸30 s,30個(gè)循環(huán);共11個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.5 ℃;94 ℃變性15 s,54 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s,共24個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。反應(yīng)完成后進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化,10 μL 反應(yīng)體系為:FastAP(Thermosensitive Alkaline Phosphatase,F(xiàn)ermentas)0.8 μL、ExoⅠ 0.2 μL、ExoⅠ buffer 0.7 μL、PCR產(chǎn)物3 μL、H2O 5.3 μL 。反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min,80 ℃ 15 min,純化后進(jìn)行延伸反應(yīng),并預(yù)先混勻延伸引物。

    SNP分型采用ABI SNaPshot Multiplex PCR試劑盒(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司),6 μL 反應(yīng)體系為:Snapshot Mix 1 μL、延伸引物0.1 μL、多重PCR產(chǎn)物2 μL、ddH2O 2.9 μL 。反應(yīng)條件為:96 ℃預(yù)變性1 min;96 ℃變性10 s,52 ℃退火5 s,60 ℃延伸30 s,共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后加入1 U FastAP,并以37 ℃ 60 min、85 ℃ 15 min條件進(jìn)行純化。以GeneScan-120Liz Size Standard(ABI)為內(nèi)標(biāo),取1 μL 產(chǎn)物與9 μL 含有Liz的Hi-Di(GS-120Liz ∶Hi-Di=1 ∶200)混合,95 ℃變性3 min,立即冰浴3 min后上測(cè)序儀。采用ABI PRISM 3730 XI型自動(dòng)遺傳分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)及分析,并利用Genemapper v4.1軟件進(jìn)行分型。

    1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

    利用R(3.0.1)軟件對(duì)試驗(yàn)斑點(diǎn)叉尾SNP位點(diǎn)的各基因型體質(zhì)量、體長(zhǎng)進(jìn)行方差齊性分析(homogeneity of variance test)和單因素ANOVA(one-way ANOVA)分析。采用均值多重比較(multiple comparisons of means)方法分析SNP位點(diǎn)各基因型與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)程度。統(tǒng)計(jì)分析模型為:

    Yij=μ+Gi+eij。

    式中:Yij為某個(gè)性狀第i個(gè)標(biāo)記第j個(gè)個(gè)體觀測(cè)值,μ為試驗(yàn)觀測(cè)所有個(gè)體的平均值(即總體平均值),Gi為第i個(gè)標(biāo)記的效應(yīng)值,eij為對(duì)應(yīng)于觀察值的隨機(jī)殘差效應(yīng)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 MSTN基因SNP位點(diǎn)篩選

    利用所設(shè)計(jì)的2對(duì)引物對(duì)40尾斑點(diǎn)叉尾構(gòu)建的DNA池及20尾個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序分析。共篩選出4個(gè)SNP位點(diǎn),即g.3501 T>G、g.3844 T>A、g.4297 C>G、g.4355 G>C,且所有位點(diǎn)均由第2對(duì)引物擴(kuò)增得到。其中,g.3501 T>G位于第一內(nèi)含子;g.3844 T>A位于第二外顯子,密碼子GUA變?yōu)镚AA,氨基酸由纈氨酸(Val)變?yōu)楣劝彼幔℅lu);g.4297 C>G、g.4355 C>G位于第二內(nèi)含子(圖1)。

    2.2 SNP位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析

    對(duì)斑點(diǎn)叉尾4個(gè)家系176尾魚(yú)的體質(zhì)量和體長(zhǎng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。體質(zhì)量、體長(zhǎng)分別為(280.63±13.21) g、(31.26±0.56) cm。采用R軟件將篩選得到的4個(gè)SNP位點(diǎn)與測(cè)量的斑點(diǎn)叉尾體質(zhì)量、體長(zhǎng)進(jìn)行單因素ANOVA分析,并結(jié)合均值多重比較分析得出,4個(gè)SNPs中的1個(gè)(g.4355 G>C)與斑點(diǎn)叉尾體質(zhì)量、體長(zhǎng)呈顯著性負(fù)相關(guān)(表2)。在SNP位點(diǎn)g.4355 G>C,具有GG基因型個(gè)體的體質(zhì)量、體長(zhǎng)顯著性低于CC型和CG型(P<005)。

    3 結(jié)論與討論

    MSTN基因具有多種重要功能,它在哺乳動(dòng)物中的主要功能為調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育過(guò)程中肌纖維的數(shù)量,以及抑制肌纖維的生長(zhǎng)[1]。MSTN基因多態(tài)性及其與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析研究最早于哺乳動(dòng)物中進(jìn)行,綿羊、豬、中國(guó)肉牛等[7-11]均已發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀之間存在相關(guān)性。近年來(lái),在鯉魚(yú)、羅非魚(yú)、黃顙魚(yú)、圓斑星鰈、鱸魚(yú)、鳙魚(yú)等[3,12-18]重要的水產(chǎn)動(dòng)物中也開(kāi)展了相關(guān)研究。唐永凱等在吉富羅非魚(yú)中篩選到1個(gè)與增質(zhì)量顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)[13]。朱媛媛等、陳校輝等先后對(duì)黃顙魚(yú)MSTN基因進(jìn)行研究,均發(fā)現(xiàn)了造成不同個(gè)體間生長(zhǎng)性狀顯著性差異的SNP位點(diǎn)[14-15]。

    本研究在斑點(diǎn)叉尾MSTN基因中共篩選到4個(gè)SNP位點(diǎn),其中1個(gè)SNP位點(diǎn)位于第二外顯子,其余3個(gè)均位于內(nèi)含子區(qū)域。將篩選到的SNP位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果表明SNP g.4355 C>G與生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)。具有GG型個(gè)體的體質(zhì)量、體長(zhǎng)顯著低于CC型和CG型, GG型個(gè)體的平均體質(zhì)量、平均體長(zhǎng)分別比4個(gè)家系所有個(gè)體體質(zhì)量、體長(zhǎng)的平均值小30%、10%。4個(gè)家系中的個(gè)體以CC型和CG型為主,具有GG型的個(gè)體較少。綜合推測(cè)該位點(diǎn)GG型屬于隱性突變,由于該位點(diǎn)堿基突變?cè)斐蒑STN基因的表達(dá)量升高,進(jìn)而抑制了斑點(diǎn)叉尾的生長(zhǎng)。這種現(xiàn)象也存在于豬[9]、牛[11]、紅鰭東方鲀[3]的研究中。

    本研究獲得的與生長(zhǎng)性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)位于內(nèi)含子區(qū)域。盡管內(nèi)含子不具有編碼蛋白質(zhì)的能力,但其發(fā)生單核苷酸突變能夠顯著影響基因的表達(dá)效率。已有研究表明,內(nèi)含子的功能主要為轉(zhuǎn)錄調(diào)控,即在轉(zhuǎn)錄階段對(duì)相應(yīng)的基因進(jìn)行調(diào)控進(jìn)而影響生長(zhǎng)性狀[19]。越來(lái)越多的試驗(yàn)結(jié)果證明,內(nèi)含子在調(diào)控mRNA剪切、轉(zhuǎn)錄、基因表達(dá)方面起著重要作用[20-21],例如內(nèi)含子長(zhǎng)鏈非編碼RNA(intronic lncRNA)發(fā)生單核苷酸突變將使其調(diào)控的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平發(fā)生改變。然而,本研究中該SNP位點(diǎn)參與調(diào)控MSTN基因功能的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

    猜你喜歡
    關(guān)聯(lián)分析
    “鷹眼”大數(shù)據(jù)安全管控平臺(tái)的技術(shù)實(shí)現(xiàn)解析
    基于隨機(jī)函數(shù)Petri網(wǎng)的系統(tǒng)動(dòng)力學(xué)關(guān)聯(lián)分析模型
    久久精品影院6| 少妇被粗大的猛进出69影院| 男女下面进入的视频免费午夜| 久久久水蜜桃国产精品网| a级毛片在线看网站| 国产成人欧美在线观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| av中文乱码字幕在线| 日韩三级视频一区二区三区| 午夜精品久久久久久毛片777| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 不卡av一区二区三区| 97碰自拍视频| 成在线人永久免费视频| tocl精华| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 色综合亚洲欧美另类图片| 51午夜福利影视在线观看| 成年人黄色毛片网站| 日本在线视频免费播放| 一二三四在线观看免费中文在| 久久久久亚洲av毛片大全| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 欧美乱妇无乱码| 国产高清videossex| 激情在线观看视频在线高清| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 男女那种视频在线观看| 老司机靠b影院| 在线免费观看的www视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲精品在线观看二区| xxx96com| 正在播放国产对白刺激| 亚洲av成人精品一区久久| 久久久久久久久中文| 欧美激情久久久久久爽电影| 白带黄色成豆腐渣| 悠悠久久av| 在线视频色国产色| av欧美777| 国产一区二区激情短视频| 听说在线观看完整版免费高清| 国产成人精品久久二区二区91| 成年人黄色毛片网站| 在线看三级毛片| 久久伊人香网站| 窝窝影院91人妻| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 99国产精品一区二区三区| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 狂野欧美激情性xxxx| 欧美大码av| 亚洲成av人片在线播放无| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 99精品在免费线老司机午夜| 色综合婷婷激情| 在线观看免费视频日本深夜| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲人成伊人成综合网2020| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产三级在线视频| 免费搜索国产男女视频| 99热这里只有精品一区 | 一边摸一边做爽爽视频免费| 一二三四社区在线视频社区8| 欧美成狂野欧美在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产视频一区二区在线看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲av熟女| 又爽又黄无遮挡网站| www.熟女人妻精品国产| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 五月玫瑰六月丁香| 一本一本综合久久| 中文字幕av在线有码专区| 日韩欧美国产一区二区入口| 男女之事视频高清在线观看| 正在播放国产对白刺激| 国产精品综合久久久久久久免费| 久久中文字幕人妻熟女| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国产黄a三级三级三级人| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 韩国av一区二区三区四区| 精品久久久久久,| 黄频高清免费视频| 午夜成年电影在线免费观看| 身体一侧抽搐| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲免费av在线视频| 搞女人的毛片| 宅男免费午夜| 无人区码免费观看不卡| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产高清视频在线观看网站| aaaaa片日本免费| 香蕉久久夜色| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 男人的好看免费观看在线视频 | 制服丝袜大香蕉在线| 精品欧美一区二区三区在线| 精品福利观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 老司机午夜十八禁免费视频| 白带黄色成豆腐渣| 国产成年人精品一区二区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久 成人 亚洲| 亚洲真实伦在线观看| 日本a在线网址| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲成人久久性| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产精品亚洲一级av第二区| 91成年电影在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 国产黄片美女视频| 亚洲国产欧美人成| 欧美丝袜亚洲另类 | 婷婷精品国产亚洲av在线| 91av网站免费观看| 欧美久久黑人一区二区| 神马国产精品三级电影在线观看 | 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产午夜精品久久久久久| 欧美色欧美亚洲另类二区| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 色综合亚洲欧美另类图片| 99在线视频只有这里精品首页| 脱女人内裤的视频| 国产一区在线观看成人免费| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲成人国产一区在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 久久精品影院6| 夜夜夜夜夜久久久久| 日韩精品中文字幕看吧| 免费高清视频大片| 国产97色在线日韩免费| 婷婷精品国产亚洲av| 国产精品一区二区三区四区久久| 欧美色欧美亚洲另类二区| 手机成人av网站| 黄片小视频在线播放| 18美女黄网站色大片免费观看| 久久性视频一级片| 国产又色又爽无遮挡免费看| 香蕉av资源在线| 91av网站免费观看| 99久久国产精品久久久| 日本一本二区三区精品| 亚洲欧美日韩东京热| 欧美+亚洲+日韩+国产| 免费av毛片视频| 我要搜黄色片| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 久久久久久久久免费视频了| 久热爱精品视频在线9| 精华霜和精华液先用哪个| av在线天堂中文字幕| 一级作爱视频免费观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产又色又爽无遮挡免费看| 成年人黄色毛片网站| 欧美日本视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产精品久久久久久精品电影| 嫁个100分男人电影在线观看| 在线国产一区二区在线| 日韩欧美三级三区| 很黄的视频免费| 亚洲色图av天堂| 国产午夜精品久久久久久| 色av中文字幕| 又粗又爽又猛毛片免费看| а√天堂www在线а√下载| 九色国产91popny在线| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 无人区码免费观看不卡| 精品国产亚洲在线| 夜夜爽天天搞| 中文资源天堂在线| 99热只有精品国产| 校园春色视频在线观看| 午夜福利在线在线| 岛国在线免费视频观看| 欧美日本视频| 麻豆国产97在线/欧美 | 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 精品国产亚洲在线| 老鸭窝网址在线观看| 成人欧美大片| 18禁国产床啪视频网站| 精品一区二区三区四区五区乱码| 欧美三级亚洲精品| 母亲3免费完整高清在线观看| 真人做人爱边吃奶动态| 免费电影在线观看免费观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 1024视频免费在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 午夜激情av网站| 免费电影在线观看免费观看| 操出白浆在线播放| 黑人操中国人逼视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产黄色小视频在线观看| 久久这里只有精品19| 男男h啪啪无遮挡| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲av电影在线进入| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久 成人 亚洲| 91字幕亚洲| 国产亚洲精品久久久久5区| www国产在线视频色| 超碰成人久久| 99久久精品热视频| 黄片大片在线免费观看| 看片在线看免费视频| 精品不卡国产一区二区三区| 黄色女人牲交| 精品久久久久久久末码| 日韩欧美在线二视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| av在线播放免费不卡| 欧美在线一区亚洲| 成熟少妇高潮喷水视频| 欧美精品亚洲一区二区| 欧美黄色片欧美黄色片| 欧美日韩福利视频一区二区| 免费一级毛片在线播放高清视频| 午夜免费成人在线视频| 日本免费a在线| 久久久国产成人精品二区| 一本大道久久a久久精品| www日本黄色视频网| а√天堂www在线а√下载| 欧美中文综合在线视频| 国产精品免费视频内射| 午夜a级毛片| www.www免费av| 国内精品久久久久精免费| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| АⅤ资源中文在线天堂| 中国美女看黄片| 午夜精品一区二区三区免费看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲人成77777在线视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 一级毛片高清免费大全| 亚洲精品粉嫩美女一区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产主播在线观看一区二区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久精品人妻少妇| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美三级亚洲精品| 麻豆av在线久日| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 视频区欧美日本亚洲| 精品久久久久久久久久免费视频| 1024香蕉在线观看| 日本在线视频免费播放| 国产一区二区在线观看日韩 | 黄色视频不卡| 欧美一级a爱片免费观看看 | 亚洲av片天天在线观看| 国产午夜精品久久久久久| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 久久99热这里只有精品18| 欧美色欧美亚洲另类二区| 午夜视频精品福利| 一本一本综合久久| 久久久久久免费高清国产稀缺| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产精品国产高清国产av| 嫩草影院精品99| 制服人妻中文乱码| 国产午夜福利久久久久久| 日本精品一区二区三区蜜桃| 禁无遮挡网站| 中文字幕久久专区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲色图av天堂| 五月玫瑰六月丁香| 国产成人aa在线观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产在线观看jvid| av超薄肉色丝袜交足视频| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 免费看a级黄色片| av视频在线观看入口| 亚洲在线自拍视频| 久久久国产欧美日韩av| 日本 欧美在线| 中文字幕久久专区| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 免费看美女性在线毛片视频| √禁漫天堂资源中文www| 精品电影一区二区在线| 午夜亚洲福利在线播放| 制服人妻中文乱码| 亚洲,欧美精品.| 中文在线观看免费www的网站 | 欧美丝袜亚洲另类 | 美女午夜性视频免费| x7x7x7水蜜桃| 人妻夜夜爽99麻豆av| 十八禁人妻一区二区| 午夜激情av网站| 国产成人精品久久二区二区91| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| а√天堂www在线а√下载| 亚洲专区字幕在线| 我要搜黄色片| 天天一区二区日本电影三级| 69av精品久久久久久| 超碰成人久久| 欧美zozozo另类| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产成人精品无人区| 亚洲欧美日韩东京热| 黄频高清免费视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲av熟女| 亚洲欧美日韩东京热| 男女之事视频高清在线观看| 色老头精品视频在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频| 日韩精品中文字幕看吧| 国产精品 国内视频| 岛国在线观看网站| 日本a在线网址| 99国产精品一区二区三区| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲一区中文字幕在线| 99久久无色码亚洲精品果冻| 小说图片视频综合网站| 两性夫妻黄色片| 国产99白浆流出| 一本一本综合久久| 999精品在线视频| 后天国语完整版免费观看| 国产精品国产高清国产av| 变态另类丝袜制服| 高潮久久久久久久久久久不卡| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 午夜视频精品福利| 国内精品久久久久久久电影| 国产三级在线视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 在线观看一区二区三区| 亚洲国产精品久久男人天堂| 丰满人妻一区二区三区视频av | 日韩大码丰满熟妇| 精品不卡国产一区二区三区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 99久久99久久久精品蜜桃| 女同久久另类99精品国产91| 国产三级中文精品| 美女大奶头视频| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲片人在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 人人妻人人看人人澡| 亚洲av美国av| 久久草成人影院| 一区二区三区高清视频在线| 制服诱惑二区| 全区人妻精品视频| 男女之事视频高清在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 免费av毛片视频| 成人三级做爰电影| 男女午夜视频在线观看| 1024手机看黄色片| 免费无遮挡裸体视频| 黄色视频,在线免费观看| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲片人在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲电影在线观看av| 欧美午夜高清在线| www.精华液| 色噜噜av男人的天堂激情| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲真实伦在线观看| 成年人黄色毛片网站| 岛国在线观看网站| 性色av乱码一区二区三区2| 真人做人爱边吃奶动态| 1024香蕉在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产免费男女视频| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲av片天天在线观看| 波多野结衣高清作品| 久久久久久久久免费视频了| 他把我摸到了高潮在线观看| 中出人妻视频一区二区| 18禁观看日本| 久久精品成人免费网站| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产免费男女视频| 日韩欧美免费精品| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲18禁久久av| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 欧美+亚洲+日韩+国产| 欧美乱妇无乱码| 久久香蕉精品热| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 两性夫妻黄色片| 动漫黄色视频在线观看| 国模一区二区三区四区视频 | 国产精品亚洲av一区麻豆| 精品人妻1区二区| 很黄的视频免费| 日本黄大片高清| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 午夜福利视频1000在线观看| 午夜两性在线视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲成人久久性| 日韩有码中文字幕| 嫩草影视91久久| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 久99久视频精品免费| 成人国产综合亚洲| 精品国产乱码久久久久久男人| 欧美性长视频在线观看| 午夜福利免费观看在线| 精品国内亚洲2022精品成人| 天堂动漫精品| xxx96com| 啦啦啦韩国在线观看视频| 在线免费观看的www视频| 久久久久久久久免费视频了| 天堂动漫精品| 日日爽夜夜爽网站| 变态另类丝袜制服| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲av美国av| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 宅男免费午夜| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 黄色视频不卡| 成人欧美大片| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产精品一区二区免费欧美| 免费电影在线观看免费观看| 黄色a级毛片大全视频| 国产一区二区在线av高清观看| 男男h啪啪无遮挡| 久久中文字幕人妻熟女| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲国产精品成人综合色| 麻豆成人av在线观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 丝袜美腿诱惑在线| 国产精品亚洲美女久久久| 国产成人精品无人区| 麻豆成人av在线观看| 午夜精品在线福利| 黄色 视频免费看| 国产成人av教育| 波多野结衣高清无吗| 国产真实乱freesex| 国产精品久久久久久久电影 | 小说图片视频综合网站| 精品久久久久久久末码| 国产精品98久久久久久宅男小说| 大型av网站在线播放| 岛国在线观看网站| cao死你这个sao货| 午夜激情av网站| 最近最新免费中文字幕在线| 国产黄片美女视频| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 悠悠久久av| 久99久视频精品免费| 大型黄色视频在线免费观看| 国产成人av教育| 精品人妻1区二区| 亚洲免费av在线视频| 亚洲乱码一区二区免费版| 免费看日本二区| 美女免费视频网站| 特大巨黑吊av在线直播| av国产免费在线观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 一进一出好大好爽视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产高清有码在线观看视频 | 一边摸一边抽搐一进一小说| 此物有八面人人有两片| 精品久久久久久久久久久久久| 国产精品日韩av在线免费观看| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲成人久久爱视频| 久久亚洲精品不卡| 亚洲中文日韩欧美视频| 男女视频在线观看网站免费 | 亚洲男人的天堂狠狠| 国产精品九九99| 国产黄片美女视频| 久久这里只有精品19| 一进一出好大好爽视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲国产精品sss在线观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 老汉色∧v一级毛片| 成人三级做爰电影| 国产精品日韩av在线免费观看| 婷婷精品国产亚洲av| 热99re8久久精品国产| 精品国产美女av久久久久小说| 国产亚洲精品av在线| 男插女下体视频免费在线播放| 久久国产乱子伦精品免费另类| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 岛国在线免费视频观看| 亚洲专区中文字幕在线| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲人成77777在线视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 欧美丝袜亚洲另类 | 舔av片在线| 精品不卡国产一区二区三区| 最新在线观看一区二区三区| 波多野结衣高清作品| 成人国产综合亚洲| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产精品av视频在线免费观看| 一级毛片高清免费大全| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 日韩欧美精品v在线| 国产成人av激情在线播放| 亚洲一码二码三码区别大吗| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 日韩欧美国产在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 精品久久久久久久末码| 最好的美女福利视频网| 国内精品久久久久精免费| 免费搜索国产男女视频| 精品人妻1区二区| 91老司机精品| 亚洲黑人精品在线| 国产av在哪里看| 99热这里只有是精品50| cao死你这个sao货| 婷婷精品国产亚洲av在线| 精品第一国产精品| 一夜夜www| 好男人电影高清在线观看| 高清在线国产一区| 国产伦人伦偷精品视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 午夜成年电影在线免费观看| 中文字幕熟女人妻在线| 日本黄大片高清| 日本三级黄在线观看| 嫩草影院精品99| 身体一侧抽搐| 日本在线视频免费播放| 免费观看人在逋| 亚洲专区中文字幕在线| 最新美女视频免费是黄的| 成人午夜高清在线视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 夜夜躁狠狠躁天天躁| av超薄肉色丝袜交足视频| 色在线成人网| 黄色毛片三级朝国网站| 十八禁人妻一区二区| 男人舔女人下体高潮全视频|