星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法優(yōu)選“扶正固本”方最佳提取工藝

謝紅軍 肖瑤 王鑫

【摘 要】 目的：優(yōu)選“扶正固本”方最佳提取工藝，為該制劑的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：以多糖含量及出膏率的綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化最佳的提取時(shí)間、提取次數(shù)及加水量。結(jié)果：最佳提取工藝為加10倍量水，提取3次，每次2h，此時(shí)的多糖含量為3.87%，出膏率為34.23%。結(jié)論：優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定，重復(fù)性好，可為扶正固本方的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 提取工藝;星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法;多糖;綜合評(píng)分

【中圖分類號(hào)】R284 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2019）1-0031-05

Abstract： Objective? To optimize extraction process of the Fuzheng Guben Decoction and provide experimental basis for the further research. Methods? With the composite scores of polysaccharide content and dry extract rate as the index， central composite design-response surface methodology was adopted to optimize the best extraction time， extraction times and the amount of water. Results The optimal extraction process was to add 10-fold water and extract 3 times， each time for 2 hours. The polysaccharide content was 3.87% and the dry extract rate was 34.23%. Conclusion The optimum extraction process was stable and repeatable， which could provide a basis for further research on the formulation.

Keywords：Extraction Process;Central Composite Design-response Surface Methodology; Polysaccharide; Comprehensive Evaluation Method

惡性腫瘤是威脅人類健康的重大疾病，也是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一[1]。目前，惡性腫瘤的治療主要包括手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療，其中化療作為一種全身治療方式能夠在局部或全身減輕腫瘤細(xì)胞負(fù)荷[2]。臨床中腫瘤發(fā)生、發(fā)展等同機(jī)體免疫功能密切相關(guān)，腫瘤化療過(guò)程中由于化療藥物體內(nèi)選擇性差，在殺傷腫瘤細(xì)胞時(shí)會(huì)損傷免疫細(xì)胞，嚴(yán)重影

響自身免疫系統(tǒng)抗腫瘤機(jī)制出現(xiàn)免疫抑制，對(duì)免疫功能進(jìn)行調(diào)節(jié)就可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散[3]。與傳統(tǒng)化療藥物相比，中藥在抗癌方面具有安全高效、毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛用于防治惡性腫瘤[4]?！胺稣瘫尽笔侵嗅t(yī)治病的主要治則之一，可以減輕化療藥物所導(dǎo)致的機(jī)體免疫功能損傷。經(jīng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究證實(shí)：“扶正固本”法是對(duì)機(jī)體的免疫功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，利于淋巴細(xì)胞的增殖和促進(jìn)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的活力進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力[5]。惡性腫瘤在中醫(yī)學(xué)中稱為“積證”、“癭病”等?！夺t(yī)宗必讀》中記載：“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之”，表明正氣虧虛是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的根本原因。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為扶助正氣，穩(wěn)固本源能夠達(dá)到“正氣存內(nèi)、邪不可侵”的目的[6]。為了充分發(fā)揮中醫(yī)藥在腫瘤治療過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)，研究中選取了由人參、黃芪、茯苓等七味中藥組成的“扶正固本”方。并對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，為其進(jìn)一步研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-3010型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本東芝公司），Sartorius CP225D型電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司），B-220恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠），DZF型真空干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），RE53CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），KQ3200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 D（+）無(wú)水葡萄糖（D0806AS，美侖生物），藥材購(gòu)自安國(guó)藥材市場(chǎng)經(jīng)鑒定符合《中國(guó)藥典》2015年版一部的規(guī)定，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

“扶正固本”方由人參、黃芪、茯苓、白術(shù)、五味子、澤瀉、炙甘草七味藥組成。經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)多糖為扶正固本方的主要活性成分，因此采用水煎煮法提取，實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)試驗(yàn)-效應(yīng)面法，以總多糖含量和出膏率的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察提取時(shí)間、提取次數(shù)及加水量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

2.1 多糖的含量測(cè)定[7]2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品50.00mg，置50mL的容量瓶中，加水定容，制成1.00mg/mL的葡萄糖對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.1.2 5%苯酚溶液的制備 精密量取80 ℃熔化的苯酚溶液5mL，至100mL棕色容量瓶中，加蒸餾水至100mL，搖勻。4℃冷藏，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 取處方量藥材，按照設(shè)計(jì)方案加水提取，絹布過(guò)濾，定容到600mL。取定容液5mL，3500 r離心5 min，取上清1mL，加95%乙醇5mL，混勻靜置4 h，3500 r離心15 min，沉淀加10mL水溶解，取1mL加水定容至5mL即得供試品溶液。精密量取供試品溶液2mL，加5%苯酚溶液1mL 搖勻，迅速加入5.0mL濃硫酸振搖5 min，90 ℃加熱15 min，室溫冷卻30 min，490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2、2.5mL分別置于50mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。制備濃度分別為0.0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液。精密量取上述各溶液2mL，加5%苯酚溶液1mL搖勻，迅速加入5.0mL濃硫酸振搖5 min，90 ℃加熱15 min，室溫冷卻30 min，490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)計(jì)算得線性回歸方程為，y=20.563x+0.2071（r=0.9992，n=6）無(wú)水葡萄糖在0.0～0.05mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為0.02mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液按照“2.1.4”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)方法，連續(xù)測(cè)定5次。結(jié)果顯示葡萄糖溶液吸光度值的RSD=0.075%（n=5）。表明儀器的精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，平行操作6份，按照“2.1.4”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定吸光度值，結(jié)果顯示吸光度值的RSD=0.105%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別放置0、2、4、8、12、24h后，“2.1.4”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定吸光度值。結(jié)果吸光度值的RSD=0.097%（n=6），表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率 精密稱取供試品溶液5mL，分別加入質(zhì)量濃度為0.02mg/mL的對(duì)照品溶液適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，“2.1.4”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定吸光度值。計(jì)算加樣回收率=97.26±0.45%。

2.2 出膏率測(cè)定 精密量取提取液75mL置蒸發(fā)皿中，80℃水浴蒸干，干燥箱105℃干燥至恒重，室溫下置干燥器中冷卻30 min，精密稱定重量，計(jì)算干浸膏得率。

2.3 星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.3.1 因素水平表選擇 提取時(shí)間（A）、提取次數(shù)（B）以及加水量（C）3個(gè)因素作為本研究的考察對(duì)象，并確定其用量范圍為：A：1～2，B：1～3，C：8～12。采用效應(yīng)面法可連續(xù)的對(duì)實(shí)驗(yàn)的各個(gè)水平進(jìn)行分析。以出膏率（Y1）、含糖量（Y2）、綜合評(píng)分（Y3）作為測(cè)定指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)考察。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

2.3.2星點(diǎn)方案及結(jié)果 實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.3 擬合模型的建立 采用Design-Expert 8.0.6.1統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理，以綜合評(píng)分Y3為因變量，得二次多項(xiàng)式擬合方程。Y3=-1.98097+0.095825A+0.31370B+0.39804C+0.075850AB-0.00175AC-0.0082625BC-0.057200A2-0.034525B2-0.018237C2（r=0.9728，P<0.01）對(duì)上述擬合模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀泻芨叩娘@著性（P<0.01）。其中一次項(xiàng)B對(duì)Y3影響顯著（P<0.01），二次項(xiàng)中C2對(duì)Y3有顯著影響（P<0.05）;一次項(xiàng)A、C，二次項(xiàng)A2、B2及交互項(xiàng)對(duì)Y3的影響不顯著（P>0.05）。r=0.9728，說(shuō)明模型能夠很好地反映響應(yīng)值的變化，可以用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)扶正固本方的最佳提取工藝。

2.3.4 響應(yīng)面結(jié)果分析及最佳處方的確定 利用Design-Expert V8.0.6.1軟件，當(dāng)將1個(gè)因素的編碼值設(shè)定為0時(shí)，另外2個(gè)因素與響應(yīng)值包封率的三維響應(yīng)面圖自動(dòng)生成，結(jié)果如圖2所示。在等高線圖中，圓心的位置為極值條件出現(xiàn)的位置，等高線圖越趨近于圓形，越說(shuō)明此時(shí)的兩個(gè)因素之間的相互作用對(duì)包封率的影響越大。越接近圓心位置，其綜合評(píng)分的值越大。圖2清晰的表明了B對(duì)包封率的影響最大。等高線圖越扁平，表示因素之間的相互影響越小，A、C兩因素之間的影響最小。在規(guī)定的提取時(shí)間、次數(shù)、加水量的范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的最優(yōu)最佳處方為提取時(shí)間2 h，加10倍量水，提取3次。

2.3.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)效應(yīng)面法優(yōu)選出的結(jié)果制備3批供試品，并對(duì)3批樣品的多糖含量及出膏率進(jìn)行測(cè)定。表4結(jié)果顯示，根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選出的提取方法提取，綜合評(píng)分Y3=0.8751%，將最優(yōu)處方代入擬合方程得出Y3=0.9415，真實(shí)值與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明此方法可行。

3 討論

扶正固本方由人參、黃芪、茯苓、白術(shù)、五味子、澤瀉、炙甘草七味藥組成。以人參為君，大補(bǔ)元?dú)?。臣以黃芪入脾經(jīng)而補(bǔ)中氣，固表氣，炙甘草補(bǔ)脾和中，三藥相配可大補(bǔ)一身之氣;五味子酸溫收斂，入腎而滋腎水，固下焦，收耗散之氣，配人參一補(bǔ)一斂，益氣養(yǎng)陰，補(bǔ)斂合法;佐以澤瀉利濕泄?jié)?，濁得以泄，清得以?脾胃氣虛，運(yùn)化失常，故佐以白術(shù)健脾燥濕，既助參芪補(bǔ)脾胃之氣，又增強(qiáng)脾之運(yùn)化，以助后天生化之源，更以其苦燥之性，燥濕以利健脾;脾主運(yùn)化水濕，脾胃既虛，則濕濁易于停滯，故佐以茯苓，其味甘以健脾，淡以滲濕，使邪去而正氣得復(fù)。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法一種新型的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法于一體，具有試驗(yàn)次數(shù)少、試驗(yàn)精度高、可連續(xù)對(duì)實(shí)驗(yàn)各水平進(jìn)行分析等特點(diǎn)[8]。研究采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法，通過(guò)二項(xiàng)式擬合描繪了三維響應(yīng)面，所得二項(xiàng)式復(fù)相關(guān)系數(shù)r=0.9728，表明采用此法優(yōu)化扶正固本方提取工藝確實(shí)可行。通過(guò)響應(yīng)面效果圖可清晰了解影響提取效果的3個(gè)因素的效應(yīng)趨勢(shì)。從效果圖可見(jiàn)，影響提取效果的各因素關(guān)系是：提取次數(shù)>提取時(shí)間>加水量。考慮到實(shí)驗(yàn)的可行性，結(jié)合效應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果將提取工藝確定為提取時(shí)間2h，加10倍量水，提取3次。

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（收稿日期：2018-11-15 編輯：陶希睿）