循環(huán)腫瘤細胞檢測在乳腺癌患者中的應(yīng)用研究進展

黃永鴻 潘小明 羊濤

[摘要]臨床證實乳腺癌患者存在血液轉(zhuǎn)移的情況，循環(huán)腫瘤細胞（CTC）從原發(fā)腫瘤組織中脫落后進入血液循環(huán)，并在遠處組織種植和生長，促使遠處轉(zhuǎn)移病灶形成。早期進行循環(huán)腫瘤細胞檢測對于乳腺癌患者個體化診治方案的制定具有較好的指導(dǎo)意義。本文對循環(huán)腫瘤細胞檢測技術(shù)以及其在乳腺癌中的應(yīng)用現(xiàn)狀進行綜述。

[關(guān)鍵詞]乳腺癌；循環(huán)腫瘤細胞；應(yīng)用價值

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2019）5（b）-0032-03

Progress in the application of circulating tumor cell detection in patients with breast cancer

HUANG Yong-hong PAN Xiao-ming YANG Tao WANG Hui-ling LYU Mian XU Chang-qiang

Department of Breast Thyroid Surgery， the Second People′s Hospital of Nanning City， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530031， China

[Abstract] Clinical evidence of blood metastasis in patients with breast cancer， circulating tumor cell （CTC） enters the blood circulation from the primary tumor tissue and grows in the distant tissue， which promotes the formation of distant metastases. Early detection of circulating tumor cells has good guiding significance for individual diagnosis and treatment of breast cancer. In this paper， the technique of circulating tumor cell detection and its application in breast cancer are reviewed.

[Key words] Breast cancer； Circulating tumor cells； Application value

乳腺癌是一種發(fā)病率高的婦科惡性腫瘤[1]，該病的診斷及治療效果隨著臨床診治技術(shù)的提高以及設(shè)備的更新而不斷提升[2]。乳腺癌患者的死亡多與遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)聯(lián)，且超過90%的癌癥患者都是因循環(huán)腫瘤細胞經(jīng)血液傳播而出現(xiàn)的遠處轉(zhuǎn)移，傳統(tǒng)的檢測技術(shù)不能夠檢測到獨立腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移過程，當血液和骨髓被入侵時，會出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移的先兆，對血液和骨髓中的腫瘤細胞進行檢測是癌癥研究中的重要熱點，而循環(huán)腫瘤細胞作為一種“液體活檢”標志物，可對乳腺癌的療效進行評估。本文對循環(huán)腫瘤細胞進行概述，并對循環(huán)腫瘤細胞檢測技術(shù)、應(yīng)用價值進行綜述。

1循環(huán)腫瘤細胞的概述

循環(huán)腫瘤細胞的概念最先出現(xiàn)為1896年，由Ashworth提出；在1976年，Nowell修正了循環(huán)腫瘤細胞的定義，定義為脫落于原發(fā)腫瘤，獲得脫離基底膜的能力并入侵通過組織基質(zhì)進入血管的腫瘤細胞。循環(huán)腫瘤細胞是存在于外周血中各類腫瘤細胞的統(tǒng)稱[3]，不僅會導(dǎo)致癌癥患者在治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)、遠處轉(zhuǎn)移等情況，還會提高癌癥患者的死亡率。

循環(huán)腫瘤細胞的作用機制為：腫瘤轉(zhuǎn)移向原發(fā)腫瘤細胞附件相關(guān)組織、淋巴管系統(tǒng)、血液入侵，之后形成循環(huán)腫瘤細胞，經(jīng)血液或淋巴擴散后，達到遠端組織，進行播種、定植和生長，出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移灶[4]。

2循環(huán)腫瘤細胞檢測技術(shù)

2.1富集與分離技術(shù)

2.1.1抗原抗體反應(yīng)技術(shù) 上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecular，EpCAM）的表達在循環(huán)腫瘤細胞檢測技術(shù)中十分重要，其作為一種上皮特異性蛋白，用于陽性篩選、陰性篩選中均可以富集循環(huán)腫瘤細胞，其中臨床多采用淋巴細胞標記物CD45、粒細胞標記物CD15，再利用免疫磁性技術(shù)進行細胞篩選[5]，去除血液樣本中的淋巴細胞。

2.1.2基于細胞大小的富集 按照血液樣本流過微通道流速的不同，可劃分成不同的亞群。循環(huán)腫瘤細胞的體積大于正常的血液細胞，結(jié)構(gòu)不會出現(xiàn)太大的變化，流速穩(wěn)定[6]，經(jīng)過微通道后，可在收集區(qū)分離循環(huán)腫瘤細胞。螺旋生物芯片的微流體設(shè)備可高度控制血流，因此在全血樣本中可檢測到比率較高的乳腺癌細胞，但是血凝塊和氣泡會對精密的微流體設(shè)備造成影響。臨床目前正在驗證一種雙向電泳分離循環(huán)腫瘤細胞的新技術(shù)的有效性。細胞作為一種電絕緣體，在不同的電場中，對液體進行作用時出現(xiàn)極化情況，變成一種電介質(zhì)粒子。雙向電泳設(shè)備可極化血液樣本中的細胞，將其向收集區(qū)移動，該技術(shù)的敏感性高，甚至可分離單一的循環(huán)腫瘤細胞[7]。

2.1.3密度梯度離心 通過OncoQuick儀器或者是黏性液體淋巴細胞分離液中不同的離心遷移度，能夠從其他血細胞中將單核細胞（包括循環(huán)腫瘤細胞）進行分離。循環(huán)腫瘤細胞的浮力小于外周血單核細胞[8]，因此可富集循環(huán)腫瘤細胞。密度梯度離心技術(shù)可快速富集循環(huán)腫瘤細胞，并將其從血細胞中分離出來，但是分離出的循環(huán)腫瘤細胞中會出現(xiàn)較多混雜的淋巴細胞[9]，經(jīng)過離心后，很難精確分離單核細胞層。該技術(shù)的優(yōu)點在于細胞回收率高，且操作簡單、經(jīng)濟性和實用性高，對設(shè)備的要求不高，適合推廣應(yīng)用在臨床中。

2.2細胞鑒定技術(shù)

2.2.1免疫細胞化學方法（ICC） ICC的原理為根據(jù)免疫學原理，利用抗體和特定抗原專一結(jié)合的反應(yīng)，對抗原進行定位測定的技術(shù)，可對是否存在腫瘤細胞進行判斷。ICC的敏感度區(qū)間為105～106[10]，操作簡單且具有較好的直觀性。循環(huán)腫瘤細胞的分離可通過上皮特異抗原而實現(xiàn)。

2.2.2流式細胞技術(shù)（FCM） FCM的原理在于腫瘤細胞特異性標志物結(jié)合標記熒光物質(zhì)的單克隆抗體，使用流式細胞儀對染色后的腫瘤細胞進行檢測和分析，進行多參數(shù)、快速的定量分析[11]，可有效檢測乳腺癌患者外周血中的腫瘤細胞。流式細胞儀可定量循環(huán)腫瘤細胞亞群，并將其特征化。

2.2.3反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR） RT-PCR是通過檢測mRNA的特異性來判斷是否存在腫瘤細胞。RT-PCR可將血液樣本中溶解的細胞是否含有循環(huán)腫瘤細胞分子進行確定，循環(huán)腫瘤細胞的mRNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，利用PCR可進行擴增，可根據(jù)PCR反應(yīng)結(jié)果對循環(huán)腫瘤細胞于樣本中的數(shù)目、表達方式進行預(yù)估[12]。RT-PCR技術(shù)具有敏感性高、特異性高以及自動化的特點，采用多重mRNA標記物可對循環(huán)腫瘤細胞、正常血細胞進行較好地鑒別診斷。但是RT-PCR技術(shù)仍存在不足之處，例如其會破壞循環(huán)腫瘤細胞，無法觀察循環(huán)腫瘤細胞的形態(tài)學和計數(shù)。

2.2.4激光掃描細胞計量技術(shù)（LSC） LSC是一種具有圖像細胞儀功能、流式細胞儀功能的高通量細胞分析儀，通過進行連續(xù)掃描熒光顯微鏡下的圖像，可對所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進行自動分析。LSC技術(shù)通過顯微鏡可在30 min～1 h內(nèi)自動篩查5×104個細胞。當LSC技術(shù)結(jié)合濃聚細胞技術(shù)時，經(jīng)熒光染色可提高敏感度。

2.3 CTC芯片技術(shù)

CTC芯片技術(shù)于2007年提出，是在微流平臺上采用的微芯片技術(shù)，在精確操控的層流條件下利用包裹EP-CAM抗體的微柱將循環(huán)腫瘤細胞從循環(huán)血中進行分離，該技術(shù)應(yīng)用在結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤患者的循環(huán)血中均成功檢測出了循環(huán)腫瘤細胞。隨著臨床的進一步研究，Herringbone-chip的出現(xiàn)促使循環(huán)腫瘤細胞與抗體接觸的機會大大增加，從而使循環(huán)腫瘤細胞檢出率大幅提高。分析其原理在于：基于癌細胞尺寸的捕獲與分離法、片上介電電泳法以及細胞親和微層析法等。

3循環(huán)腫瘤細胞檢測技術(shù)在乳腺癌中的應(yīng)用

3.1循環(huán)腫瘤細胞作為乳腺癌預(yù)后標志物

3.1.1早期乳腺癌循環(huán)腫瘤細胞檢測 循環(huán)腫瘤細胞數(shù)目為獨立的預(yù)后指標之一，且循環(huán)腫瘤細胞檢出絕對值的高低可對乳腺癌患者的預(yù)后進行判斷，成負相關(guān)關(guān)系。循環(huán)腫瘤細胞可作為早期無癥狀乳腺癌患者的常規(guī)檢查項目，根據(jù)結(jié)果對乳腺癌患者進行相應(yīng)的治療。另外乳腺癌患者新輔助化療前檢出循環(huán)腫瘤細胞可促進其預(yù)后的改善，循環(huán)腫瘤細胞同PCR結(jié)合有助于對患者進行分層治療干預(yù)。

3.1.2晚期乳腺癌循環(huán)腫瘤細胞檢測 臨床普遍認為循環(huán)腫瘤細胞計數(shù)是轉(zhuǎn)移性乳腺癌的重要預(yù)后標志物，其數(shù)目可預(yù)測患者的無進展生存情況、生存期。邊莉等[13]學者提出，若是轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者每7.5 ml外周血中的循環(huán)腫瘤細胞計數(shù)超過5個，則可判斷該類患者的預(yù)后較差。隨著臨床對于循環(huán)腫瘤細胞的進一步研究，對乳腺癌循環(huán)腫瘤細胞簇的認知逐漸加深，認為其可對單個循環(huán)腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移風險進行判斷，且風險性高出23～50倍，乳腺癌患者的預(yù)后越差，循環(huán)腫瘤細胞簇數(shù)目越多。分析轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者富集的循環(huán)腫瘤細胞，發(fā)現(xiàn)TP53基因突變最為常見，且會導(dǎo)致乳腺癌患者的預(yù)后變差。

3.2循環(huán)腫瘤細胞檢測與治療方案的選擇

3.2.1循環(huán)腫瘤細胞檢測同化療方案的選擇 循環(huán)腫瘤細胞檢測具有無創(chuàng)性，可對藥物治療的效果進行持續(xù)動態(tài)監(jiān)測，便于進行隨訪和進一步的研究。在接受1個周期的化療后，乳腺癌患者的循環(huán)腫瘤細胞數(shù)目會出現(xiàn)改變，可對化療的短期療效進行判斷。通過對化療后循環(huán)腫瘤細胞檢測數(shù)目變化進行分析，可對化療方案進行調(diào)整，選擇更加合理的化療方案進行個體化治療，從而促進患者臨床療效的提高。

3.2.2循環(huán)腫瘤細胞檢測同HER-2靶向治療 在HER-2擴增型乳腺癌患者的標準治療中，曲妥珠單克隆抗體為其中的一部分，輔助曲妥珠單克隆抗體治療可獲得較多的獲益，可將微小殘余病灶消除，促使腫瘤耐藥性降低。循環(huán)腫瘤細胞作為代表性的微小殘余病灶，其數(shù)目的減少說明微小殘余病灶的減少；HER-2過度表達的循環(huán)腫瘤細胞在增殖過程中會出現(xiàn)HER-2表達改變（獲得或丟失）的情況，而HER-2陰性細胞更多是出現(xiàn)獲得HER-2表達，因此采用循環(huán)腫瘤細胞檢測技術(shù)可為HER-2靶向治療提供新的治療思路。

3.2.3循環(huán)腫瘤細胞檢測同內(nèi)分泌治療 目前臨床尚未統(tǒng)一采用化療或內(nèi)分泌治療激素受體為陽性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的量化指標，在循環(huán)腫瘤細胞數(shù)目指導(dǎo)下的一線治療選擇，如他莫昔芬、氟維司群聯(lián)合HSP90抑制劑具有較好的耐藥性和有效性，采用循環(huán)腫瘤細胞檢測技術(shù)可對內(nèi)分泌治療耐藥機制進行分析，并為臨床治療策略的選擇提供參考。

3.3循環(huán)腫瘤細胞檢測在乳腺癌療效和預(yù)后評估中的作用

較多的乳腺癌患者由于在術(shù)后無可測量的病灶，因此不能有效評估輔助治療的效果。循環(huán)腫瘤細胞檢測可評估乳腺癌患者治療過程中的效果，同時可評估病情進展，對疾病進展加強控制。陳海濤等[14]在某一項研究中提到，治療后，每7.5 ml外周血中循環(huán)腫瘤細胞數(shù)目>5個的乳腺癌患者，同循環(huán)腫瘤細胞數(shù)目<5個的患者進行比較，病情進展率更高，且倍數(shù)>5倍，充分地說明了循環(huán)腫瘤細胞的存在可判斷臨床療效，兩者之間存在聯(lián)系。謝寧等[15]在《循環(huán)腫瘤細胞在40例晚期轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中的檢測意義》一文中寫道，CTC≥5個/7.5 ml的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者與CTC<5個/7.5 ml的患者進行比較，肝臟轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移灶>3處的陽性率更高，但前者的預(yù)后效果更差，較好地證明了上述觀點的真實性。

單海琳等[16]于《血循環(huán)腫瘤細胞檢測在中晚期乳腺癌療效評價及轉(zhuǎn)移監(jiān)測中的應(yīng)用》一文中提及，中晚期乳腺癌患者的CTC數(shù)目隨著化療周期的增加而不斷減少，CTC陰性乳腺癌患者在化療結(jié)束后3、6、9個月的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率均高于CTC陽性乳腺癌患者，較好地提示了循環(huán)腫瘤細胞檢測應(yīng)用于轉(zhuǎn)移監(jiān)測中具有較好的效果，可對乳腺癌患者的預(yù)后進行預(yù)測。

4小結(jié)

循環(huán)腫瘤細胞檢測技術(shù)對于乳腺癌個體化治療方案的實施具有良好的促進作用，但該檢測技術(shù)在臨床中的普及還存在以下解決的問題：①應(yīng)用上皮細胞特異性抗原進行循環(huán)腫瘤細胞檢測，可能會導(dǎo)致出現(xiàn)上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的腫瘤細胞遺漏；②RT-PCR技術(shù)對循環(huán)腫瘤細胞的破壞會影響其計數(shù)，無法進行表型分析；③循環(huán)腫瘤細胞數(shù)目過少促使臨床對標本量具有較高的需求，對臨床的可重復(fù)性操作造成限制。但是循環(huán)腫瘤細胞檢測技術(shù)的臨床應(yīng)用價值仍較高，以后臨床研究中應(yīng)注意解決上述問題，為乳腺癌患者提供理想的個體化治療方案，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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（收稿日期：2018-11-15 本文編輯：閆 佩）