不同采收期鐵皮石斛主要成分含量測(cè)定及比較

浙江省中藥研究所有限公司，浙江 杭州 310013

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)為石斛之極品，因其表皮呈鐵綠色而得名。鐵皮石斛具有獨(dú)特的藥用價(jià)值，被譽(yù)為“九大仙草”之首，《神農(nóng)本草經(jīng)》曰“主傷中、除痹、下氣、補(bǔ)五臟虛勞羸瘦、強(qiáng)陰、久服厚腸胃”，現(xiàn)代研究表明鐵皮石斛的莖能夠益胃生津，滋陰清熱，對(duì)治療口干煩躁、食少干嘔、陰虛火旺有很好的療效。文獻(xiàn)報(bào)道[1]對(duì)鐵皮石斛藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及最佳采收期進(jìn)行研究，但其以總水溶性糖及總水溶性多糖含量為分析指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)11～3月期間含量較高，開花期4～5月明顯下降，隨后又開始回升，并且未參照最新版《中國藥典》進(jìn)一步對(duì)頭年11月份到次年3月份的差異開展研究，故本實(shí)驗(yàn)在2015版《中華人民共和國藥典》指導(dǎo)下，測(cè)定了浙江某種植基地頭年11月份到次年3月份不同采收時(shí)間兩年生鐵皮石斛中的多糖含量、甘露糖含量、甘露糖與葡萄糖峰面積比及乙醇浸出物含量，從而為鐵皮石斛最佳采收期和藥材質(zhì)量控制提供了一定的參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 藥品與試劑 鐵皮石斛樣品采自浙江某種植基地，取自生長(zhǎng)期為兩年的鐵皮石斛的干燥莖，經(jīng)過浙江省中藥研究所教授級(jí)高工王志安鑒定為鐵皮石斛藥材，樣品干燥粉碎過三號(hào)篩。采收期分別為：浙1號(hào)到浙6號(hào)(2014年10月)，浙7號(hào)到浙12號(hào)(2014年12月)，浙13號(hào)到浙18號(hào)(2015年3月)，浙19號(hào)到浙24號(hào)(2015年5月)，浙25號(hào)到浙30號(hào)(2015年7月)。D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：110833-201205，中國食品藥品檢研究院，含量99.5%)。5%苯酚溶液：稱取苯酚(分析純，批號(hào)：20141108，蘭溪市六洞山化工試劑廠)2.5 g，加純水50 mL，搖勻即得(臨用配制)。硫酸(分析純，批號(hào)：20141108，杭州雙林化工試劑廠)，95%乙醇(批號(hào)：20150104，杭州化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 儀器 Lambda 20紫外/可見分光光度計(jì)(美國PERKIN ELMER公司)，METTLER TOLEDOAB204-S電子天平(瑞士METTLER公司)，TC-15套式恒溫鍋(浙江海寧新華醫(yī)療器械廠)，Agilent 1260高效液相色譜儀，Agilent 20RBAX SB-C18色譜柱。

2 方法

2.1 多糖含量測(cè)定

2.1.1 供試品溶液的制備 取本品粉末約0.3 g，加水200 mL，加熱回流2 h，放冷，轉(zhuǎn)移至250 mL量瓶中，用少量水分次洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2 mL，置15 mL離心管中，精密加入無水乙醇10 mL，搖勻，冷藏1 h，取出，離心(轉(zhuǎn)速為每分鐘4000轉(zhuǎn))30 min，棄去上清液(必要時(shí)濾過)，沉淀加80%乙醇洗滌2次，每次8 mL，離心，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密量取對(duì)照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，分別置10 mL具塞試管中，各加水補(bǔ)至1.0 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL(臨用配制)，搖勻，再精密加硫酸5 mL，搖勻，置沸水浴中加熱20 min，取出，置冰浴中冷卻5 min，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法(通則0401)，在488 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.3 測(cè)定法 精密量取供試品溶液1 mL，置10 mL具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“精密加入5%苯酚溶液1 mL起，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖的量，計(jì)算，即得[1]。

2.2 甘露糖含量測(cè)定

2.2.1 甘露糖色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液(20∶80)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm。理論板數(shù)按甘露糖峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。

2.2.2 校正因子測(cè)定 取鹽酸氨基葡萄糖適量，精密稱定，加水制成每1 mL含12 mg的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。另取甘露糖對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，吸取400 μL，加0.5 mol/L的PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)甲醇溶液與0.3 mol/L氫氧化鈉溶液各400 μL，混勻，70 ℃水浴反應(yīng)100 min。再加0.3 mol/L的鹽酸溶液500 μL，混勻，用三氯甲烷洗滌3次，每次2 mL，棄去三氯甲烷液，水層離心后，取上清液10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算校正因子。

2.2.3 測(cè)定法 取本品粉末(過三號(hào)篩)約0.12 g，精密稱定，置索氏提取器中，加80%乙醇適量，加熱回流提取4 h，棄去乙醇液，藥渣揮干乙醇，濾紙筒拆開置于燒杯中，加水100 mL，再精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2 mL，煎煮1 h并時(shí)時(shí)攪拌，放冷，加水補(bǔ)至約100 mL，混勻，離心，吸取上清液1 mL，置頂空瓶中，加3.0 mol/L的鹽酸溶液0.5 mL，封口，混勻，110 ℃水解1 h，放冷，用3.0 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，吸取400 μL，照校正因子測(cè)定法，自“加0.5 mol/L的PMP甲醇溶液”起，依法操作，取上清液10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得[1]。

2.3 甘露糖與葡萄糖峰面積比 取葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含50 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。精密吸取0.4 mL，按照2015版《中國藥典》一部鐵皮石斛項(xiàng)下含量測(cè)定甘露糖項(xiàng)下方法依法測(cè)定。

2.4 浸出物 按照2015版《中國藥典》通則2201的熱浸法測(cè)定，用乙醇作溶劑。2.1～2.4結(jié)果見表1和表2。

3 結(jié)果

3.1 不同采收期鐵皮石斛莖的主要成分含量 見表1。

表1 不同采收期鐵皮石斛莖的主要成分含量

注：多糖、甘露糖、乙醇浸出物含量按照干燥品計(jì)算。

2.2 不同采收期鐵皮石斛莖主要成分含量的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果見表2。

組別多糖含量/%甘露糖含量/%甘露糖/葡萄糖的峰面積比乙醇浸出物/%第一組(2014.10)31.6±2.832.3±3.63.2±0.712.6±1.8第二組(2014.12)29.9±1.931.4±1.73.5±0.3 12.1±1.2第三組(2015.3)38.3±2.7?35.0±3.52.0±0.6?6.4±1.7?第四組(2015.5)27.5±1.930.1±1.83.7±0.411.8±1.0第五組(2015.7)29.5±1.731.7±2.13.4±0.3 10.5±0.8

注：與第一組比較，*P<0.05。

4 討論

根據(jù)2015版《中國藥典》一部[2]：供試品溶液的制備流程其中一部分為“(轉(zhuǎn)速為每分鐘4000轉(zhuǎn))離心20 min，棄去上清液(必要時(shí)濾過)”，此處值得商榷。因?yàn)殡x心后容易出現(xiàn)白色沉淀，有一部分粘附離心管壁上，還有少量很淡的白色沉淀在上清液里，傾倒上清液時(shí)容易損失，造成多糖含量偏低，如果改為“(轉(zhuǎn)速為每分鐘4000轉(zhuǎn))離心30 min，上清液濾過，用少量熱水洗滌濾紙數(shù)次，合并濾液”，這樣較為妥當(dāng)。原因是離心時(shí)間延長(zhǎng)，可以把白色沉淀最大限度附著在離心管壁上，過濾可以保證很淡的白色沉淀得以留在濾紙上，最大限度減少不同采收時(shí)間多糖含量的差異。

比較表1和表2中采收期(2014.10與2015.3)的鐵皮石斛，多糖含量增加，乙醇浸出物含量呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。一般情況乙醇浸出物是指用95%的乙醇采用熱浸法提取制得。高濃度的乙醇提取出的成分主要是脂溶性成分為主，而多糖易溶于熱水屬于水溶性成分。藥材多糖含量增加，意味著脂溶性成分占比下降，所以乙醇浸出物含量呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。藥材多糖含量增加，甘露糖與葡萄糖峰面積比呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)可能原因是多糖含量增加，葡萄糖峰面積呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，甘露糖與葡萄糖峰面積比中的分母增加，所以兩者的面積比呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，鐵皮石斛頭年10月到翌年3月多糖含量最高，這段時(shí)間為最佳采收期。此外鐵皮石斛(2015.3采收)比鐵皮石斛(2014.10采收)多糖含量高，從另一方面證實(shí)了本文結(jié)論如果中藥生產(chǎn)過程中，以鐵皮石斛多糖為主要有效成分，次年3月采收鐵皮石斛比頭年10月采收要更科學(xué)合理，符合石斛生長(zhǎng)過程中多糖含量變化的規(guī)律[3-15]。鐵皮石斛每年4～5月份為開花期，多糖含量明顯下降后又開始回升，最佳生長(zhǎng)期和最佳采收期基本符合。本研究可以為企業(yè)的石斛種植和采收提供了可靠的科學(xué)依據(jù)。