寶藿苷I減輕鏈脲佐菌素誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷的作用機(jī)制研究

尹彩霞 陳 晶 張 玨

遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校，貴州 遵義 563003

阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)又名阿爾采末病，是老年性癡呆最常見的類型，主要臨床表現(xiàn)為持續(xù)性記憶丟失和漸進(jìn)性認(rèn)知功能障礙[1]。其神經(jīng)病理學(xué)特征主要包括海馬和皮質(zhì)部位神經(jīng)元的缺失、細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積形成的Aβ斑(老年斑)、細(xì)胞內(nèi)tau蛋白異常磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)[1-2]。其中，Aβ沉積是導(dǎo)致海馬神經(jīng)元病變、引發(fā)AD最主要的原因[3]，而且研究已經(jīng)證實過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome-Proliferator-Activated receptors，PPARs)可參與調(diào)節(jié)這一過程[4]。鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)化學(xué)名為2-脫氧-2-{(甲基-亞硝基氨基)羰基-氨基}-D-吡喃葡萄糖，是一種具有毒性的氨基葡萄糖-亞硝基脲化合物，可選擇性地摧毀胰島β細(xì)胞，使得胰島素信號途徑受阻[5-6]。除此之外，側(cè)腦室內(nèi)注射STZ可引發(fā)皮質(zhì)與海馬的葡萄糖代謝減慢，導(dǎo)致突觸丟失、神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷，促進(jìn)Aβ的異常增加，最終誘導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶功能障礙[7]。目前，應(yīng)用STZ誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷建立AD動物模型已被廣泛用于體內(nèi)實驗研究[8-10]。迄今為止，臨床用于抗AD的藥物(如膽堿酯酶抑制劑加蘭他敏、NMDA受體拮抗劑美金剛)只能延緩AD的病程及發(fā)生，又因其毒副作用大，使得療效受限。因此，基于AD的發(fā)病機(jī)制探索新型AD治療藥物迫在眉睫。

寶藿苷Ⅰ(Baohuoside I)又稱淫羊藿次苷II，是我國傳統(tǒng)中草藥淫羊藿(HerbaEpimedii)的基本藥用活性成分之一，屬于天然黃酮醇苷類化合物，具有抗炎、減輕缺血性腦損傷、抗腫瘤、改善性功能障礙等多種藥理學(xué)作用，其分子量為514.53，結(jié)構(gòu)式如圖1所示[11-14]。而且，新近研究發(fā)現(xiàn)Baohuoside I減輕缺血性腦損傷的機(jī)制與PPARα、PPARγ的上調(diào)有關(guān)[13]。值得注意的是，已有研究證實Baohuoside I 可通過增加PPARγ的蛋白表達(dá)，從而抑制BACE1的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)Aβ代謝，最終減輕APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶下降及海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷，起到抗AD的作用[15]。此外，本課題組研究發(fā)現(xiàn)Baohuoside I能改善側(cè)腦室內(nèi)注射STZ所致的AD大鼠認(rèn)知功能減退及海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷，其機(jī)制與阻遏Aβ的異常增加有關(guān)[8]，同時綜合上述的前期研究我們推測PPARα、PPARγ參與了這一過程。因此，本研究繼續(xù)采用STZ誘導(dǎo)的類AD樣大鼠模型，探索Baohuoside I減輕該模型大鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷的機(jī)制是否與PPARα、PPARγ有關(guān)，為Baohuoside I用于AD的防治提供新的藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 本研究所用的40只成年雄性SD大鼠購買于重慶第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，均為SPF級，體重260 g～270 g，許可證號為SCXK-(軍)2012-0011。大鼠以每籠5只適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實驗。

1.1.2 主要藥品、試劑、儀器設(shè)備 鏈脲佐菌素(貨號S0130)購自美國Sigma公司；寶藿苷I(純度≥98%，批號140701)購于南京澤朗醫(yī)藥有限公司；甲苯胺藍(lán)購于北京索萊寶科技有限公司；PPARα兔多克隆抗體及PPARγ兔多克隆抗體均購于英國Abcam有限公司；β-actin小鼠單克隆抗體購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；SR-6N大鼠腦立體定位儀購自日本東京Setagaya.ku 公司；全波長酶標(biāo)儀及Quantity One-全自動凝膠成像分析儀購自美國BIO-RAD公司；BX43正置顯微鏡購于日本Olympus 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組、造模及給藥方法 將40只成年雄性SD大鼠隨機(jī)均分為4組：假手術(shù)組、STZ組、Baohuoside I低劑量組、Baohuoside I高劑量組。用7%水合氯醛將大鼠麻醉(0.5 mL /100 g，i.p)，然后再將其頭部固定于大鼠腦立體定位裝置上，沿頭皮中間位置切一矢狀切口，根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》確定大鼠側(cè)腦室進(jìn)針坐標(biāo)(前囟后0.8 mm，中線旁開1.5 mm，顱骨下3.6 mm)進(jìn)行模型的制備。STZ組和Baohuoside I低、高劑量組大鼠經(jīng)微量注射器在第1天和第3天分別向雙側(cè)側(cè)腦室勻速推注STZ(濃度為1.5 mg/kg，用0.05 mmol/L 檸檬酸緩沖液配置，并調(diào)節(jié)pH 值為 4.2，需現(xiàn)配現(xiàn)用，冰上操作)5 μL，同法向假手術(shù)組大鼠雙側(cè)側(cè)腦室推注等體積溶媒(檸檬酸緩沖液)。第3天手術(shù)結(jié)束后次日開始給藥，Baohuoside I經(jīng)雙蒸水溶解，低劑量組每日灌胃Baohuoside I 3 mg/kg，高劑量組每日灌胃Baohuoside I 10 mg/kg，連續(xù)給藥21 d，假手術(shù)組和STZ組同法灌胃等體積雙蒸水，同時監(jiān)測大鼠體重的變化。實驗方法設(shè)計如圖2所示。

1.2.2 HE染色、Nissl染色 大鼠經(jīng)Baohuoside I給藥結(jié)束后，各組隨機(jī)抽取3只，用4%多聚甲醛進(jìn)行透灌，透灌結(jié)束后立即斷頭取腦，取下的全腦用4%多聚甲醛溶液固定5 d，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，最后將蠟塊切片(厚度為5 μm)，置于60 ℃烘箱中粘片，分別進(jìn)行HE染色(主要用蘇木素、伊紅染色)和Nissl染色(主要用甲苯胺藍(lán)染色)，BX43正置顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷情況及海馬神經(jīng)元的存活情況。

1.2.3 Western blot檢測蛋白表達(dá) Baohuoside I給藥結(jié)束后，處死大鼠，冰上分離雙側(cè)海馬，置于-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。稱取海馬組織50 mg，用RIPA裂解液提取總蛋白，蛋白濃度用BCA試劑盒進(jìn)行檢測。制備含20μg蛋白的上樣樣本，用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白進(jìn)行分離。電泳結(jié)束后，用電轉(zhuǎn)的方式將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%的脫脂牛奶封閉120 min，加入一抗(PPARα，1∶1000；PPARγ，1∶1 000；β-actin，1∶5000)于 4℃孵育過夜，再加入二抗(1∶2000)于常溫孵育60 min。二抗反應(yīng)結(jié)束后，相應(yīng)的條帶用ECL發(fā)光劑顯影，并置于全自動凝膠成像分析儀中測定泳帶的吸光度積分值。

2 結(jié)果

2.1 Baohuoside I對STZ誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷的影響 HE染色觀察大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷情況。如圖3所示，假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰完整，無明顯損傷；STZ組大鼠海馬神經(jīng)元萎縮，核出現(xiàn)深染甚至消失，損傷嚴(yán)重；Baohuoside I高劑量治療后，大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較為清晰完整，損傷明顯減輕。

2.2 Baohuoside I對STZ誘導(dǎo)的大鼠海馬存活神經(jīng)元數(shù)目減少的影響 尼氏染色觀察大鼠海馬存活神經(jīng)元情況。如表1及圖4所示，假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰完整；STZ組大鼠海馬神經(jīng)元萎縮，存活神經(jīng)元數(shù)量顯著減少；Baohuoside I高劑量治療后，大鼠海馬神經(jīng)元少有萎縮，存活神經(jīng)元數(shù)量明顯增加。

表1 Baohuoside I對STZ誘導(dǎo)的大鼠海馬存活神經(jīng)元數(shù)目減少的影響

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與STZ組比較，##P<0.01。

2.3 Baohuoside I對大鼠海馬PPARα蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測大鼠海馬PPARα蛋白表達(dá)。如表2及圖5所示，與假手術(shù)組比較，STZ組PPARα 蛋白表達(dá)增加；Baohuoside I高劑量連續(xù)給藥21 d后，顯著增加了STZ 大鼠海馬PPARα的蛋白表達(dá)。

表2 Baohuoside I對大鼠海馬PPARα蛋白表達(dá)的影響

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與STZ組比較，#P<0.05。

2.4 Baohuoside I對大鼠海馬PPARγ蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測大鼠海馬PPARγ蛋白表達(dá)。如表3及圖6所示，與假手術(shù)組比較，STZ組PPARγ 蛋白表達(dá)增加；Baohuoside I高劑量連續(xù)給藥21 d后，顯著增加了STZ 大鼠海馬PPARγ的蛋白表達(dá)。

表3 Baohuoside I對大鼠海馬PPARγ蛋白表達(dá)的影響

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與STZ組比較，##P<0.01。

3 討論

AD是一種由多因素導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其初始階段主要表現(xiàn)為腦內(nèi)胰島素抵抗引起的胰島素信號障礙和葡萄糖攝入不足引起的葡萄糖代謝減慢[1, 16]。STZ作為一個有毒的烷基化氨基葡萄糖-亞硝基脲化合物，可激活聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶[poly (ADP-ribose) polymerase，PARP]，使DNA發(fā)生烷基化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞壞死[6]。近年來，大量研究表明雙側(cè)側(cè)腦室內(nèi)注射STZ可引起胰島素受體功能障礙、葡萄糖代謝率降低，最終表現(xiàn)出Aβ異常增加、tau蛋白異常磷酸化、海馬神經(jīng)元受損缺失、突觸丟失等類似于AD的病理學(xué)特征[7, 17]。因此，本研究采用STZ雙側(cè)側(cè)腦室注射誘導(dǎo)類AD樣大鼠模型，探索Baohuoside I能否減輕該模型大鼠的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷及初探其可能的機(jī)制。眾所周知，海馬和皮質(zhì)部位的膽堿能神經(jīng)元缺失變性是AD的特征性病理學(xué)變化之一[18]。本研究采用HE染色觀察大鼠海馬CA2區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)，結(jié)果顯示STZ組大鼠海馬神經(jīng)元變性且核固縮，結(jié)構(gòu)明顯受損，與Rostami等的研究一致[17]，提示大鼠經(jīng)雙側(cè)側(cè)腦室注射STZ后可引起海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷。與此同時，大鼠經(jīng)Baohuoside I 10 mg/kg治療后神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷得到明顯緩解。由此可見，Baohuoside I 10 mg/kg可阻遏STZ組大鼠的海馬神經(jīng)元受損缺失。值得注意的是，Baohuoside I 3 mg/kg連續(xù)給藥不能減輕STZ誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元損傷，提示Baohuoside I在本實驗條件下的閾劑量大于3 mg/kg。神經(jīng)元的功能狀態(tài)主要由尼氏小體反映，尼氏小體數(shù)量多且體積大，說明神經(jīng)元合成蛋白質(zhì)的功能較強(qiáng)。然而，一旦神經(jīng)元受到損傷，尼氏小體就會溶解甚至消失。因此，本研究采用尼氏染色法對海馬神經(jīng)元存活情況進(jìn)行檢測，結(jié)果表明STZ組大鼠尼氏小體的數(shù)目明顯減少，與前期研究一致[8]。長期給予Baohuoside I 10 mg/kg治療后大鼠尼氏小體的數(shù)量顯著增多。由此可見，Baohuoside I 10 mg/kg可阻遏STZ誘導(dǎo)的大鼠海馬存活神經(jīng)元數(shù)目的減少，進(jìn)而維持海馬存活神經(jīng)元的數(shù)量。

實際上，本課題組前期研究已經(jīng)證實，Baohuoside I可通過減少淀粉樣前體蛋白APP(amyloid precursor protein，APP)、β-分泌酶(β-site APP cleavage enzyme，BACE1)的蛋白表達(dá)抑制Aβ的生成，同時還能增加腦啡肽酶(neprilysin，NEP)的蛋白表達(dá)促進(jìn)Aβ的代謝，最終減少Aβ的異常增加，改善STZ誘導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙，起到抗AD的作用。而且，越來越多的研究表明在AD動物模型腦內(nèi)Aβ的減少與PPARα、PPARγ密切相關(guān)[4]。PPARα、PPARγ均屬于核轉(zhuǎn)錄因子，在激活狀態(tài)下，能與視黃素x受體形成異質(zhì)二聚體，形成的異質(zhì)二聚體可與過氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)控基因的表達(dá)[4-19]。其中，PPARα激活后可上調(diào)α-分泌酶(a disintegrin and metalloproteinase domain 10， ADAM10)的基因表達(dá)，使APP降解，從而減少Aβ的生成。而PPARγ激活后能抑制BACE1的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控APP的進(jìn)程，從而影響Aβ的生成。此外，PPARγ對Aβ的清除具有促進(jìn)作用[4]。由此可見，PPARα和PPARγ在Aβ的生成、代謝過程中均起著至關(guān)重要的作用。綜上所述，筆者推測本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)的Baohuoside I減少STZ大鼠腦內(nèi)Aβ異常增加的機(jī)制與PPARα和PPARγ的激活有關(guān)。因此，本研究采用Western blot法檢測大鼠海馬PPARα和PPARγ的蛋白表達(dá)。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)STZ組大鼠海馬PPARα和PPARγ的蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組，同時Baohuoside I 10 mg/kg給藥組PPARα和PPARγ的蛋白表達(dá)明顯高于STZ組，與Li等的研究結(jié)果類似[20]。此結(jié)果提示，Baohuoside I 10 mg/kg可通過激活PPARα和PPARγ，減少STZ誘導(dǎo)的Aβ異常增加。然而，為什么STZ組PPARα和PPARγ的蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組，可能與STZ制模時的時間點(diǎn)有關(guān)，這是本課題組后續(xù)研究的重點(diǎn)。

總之，本研究證實了PPARα和PPARγ參與了側(cè)腦室內(nèi)注射STZ誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷的調(diào)控過程，加深了課題組對AD腦內(nèi)Aβ異常增加機(jī)制的認(rèn)識。Baohuoside I可減輕STZ誘導(dǎo)的大鼠海馬CA2區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的損傷，其機(jī)制與PPARα和PPARγ的激活有關(guān)。