芡實(shí)種仁支鏈淀粉特性與GeSBE1基因的表達(dá)

徐旭 吳仰風(fēng) 張宇 吳鵬 李良俊

摘? 要? 為探究芡實(shí)種仁支鏈淀粉特性及淀粉分支酶基因（SBE）在支鏈淀粉合成過程中的作用，以芡實(shí)品種‘紫花蘇芡、‘紫花刺芡為試材，分析種仁發(fā)育過程中支鏈淀粉含量、淀粉粒形成、淀粉糊化特性，并克隆‘紫花蘇芡淀粉分支酶基因（GeSBE1）cDNA全長(zhǎng)。結(jié)果表明：‘紫花蘇芡種仁的支鏈淀粉含量及支鏈淀粉與直鏈淀粉含量的比值均高于‘紫花刺芡;‘紫花蘇芡種仁的淀粉粒為不規(guī)則多面體、棱角明顯、大小較均勻，‘紫花刺芡種仁淀粉粒多數(shù)偏圓、棱角少、大小差異較大;‘紫花蘇芡種仁淀粉較‘紫花刺芡糊化溫度低。GeSBE1 cDNA全長(zhǎng)2782 bp，開放閱讀框?yàn)?466 bp，編碼821個(gè)氨基酸;該基因的cDNA序列與蓮藕SBEI基因的同源性高達(dá)78%;種仁發(fā)育過程中‘紫花蘇芡GeSBE1的表達(dá)量均高于‘紫花刺芡，表明芡實(shí)GeSBE1可能與兩品種支鏈淀粉含量的差異有關(guān)。

關(guān)鍵詞? 芡實(shí);支鏈淀粉;淀粉粒;糊化特性;GeSBE1

中圖分類號(hào)? S645.9? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

芡實(shí)（Euryale ferox Salisb.），俗稱雞頭，是睡蓮科芡屬多年生水生草本植物，原產(chǎn)東亞。在我國(guó)，芡實(shí)主要分布于黃河以南，常見于長(zhǎng)江流域和珠江流域的湖塘溝渠。我國(guó)芡實(shí)的栽培歷史悠久[1]，目前江蘇、江西、湖北等地都有很大的栽培面積，種植效益可觀。在植物分類學(xué)上，芡屬只有芡實(shí)一個(gè)種;栽培上，一般根據(jù)果實(shí)刺的有無(wú)分為有刺種和無(wú)刺種[2-3]。芡實(shí)主要以種仁供食用。有刺種種子和種仁較小，欠整齊，粳性，品質(zhì)中等。無(wú)刺種種子和種仁較大，糯性，品質(zhì)優(yōu)[4]。芡實(shí)種仁營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，民間認(rèn)為有延年益壽之功效，被奉為上品[5]。

淀粉是芡實(shí)種仁的主要貯藏物質(zhì)，占干物重的70%以上，其顆粒結(jié)構(gòu)及功能特性對(duì)芡實(shí)品質(zhì)及加工條件起著決定性作用[6]。芡實(shí)種仁的支鏈淀粉含量以及直鏈和支鏈淀粉的比例在各品種間有顯著差異，其淀粉的糊化溫度在72.37～86.35 ℃之間[7-9]。

淀粉分支酶（starch branching enzyme，SBE）能夠在葡聚糖鏈上引入α-1，6糖苷鍵，使之產(chǎn)生分支結(jié)構(gòu)，是合成淀粉分支的關(guān)鍵酶，其活性高低影響支鏈淀粉的含量及鏈長(zhǎng)，故該酶被認(rèn)為能影響植物淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)[10-11]。有關(guān)SBE的研究較多：皺縮豌豆中SBEI活性的喪失會(huì)限制淀粉的早期合成，從而對(duì)淀粉顆粒的形態(tài)造成影響[12];通過抑制淀粉分支酶SBEIIb基因的表達(dá)，玉米中支鏈淀粉的合成受到了影響，直鏈淀粉含量提高了50%[13];轉(zhuǎn)SBEI基因的稻米直鏈淀粉含量與對(duì)照相比平均降低了15%，秈稻中導(dǎo)入反義SBE基因后，T1代轉(zhuǎn)基因植物的成熟種子中直鏈淀粉含量較正常植株含量有所提高，淀粉品質(zhì)發(fā)生明顯改變[14]。

本研究以‘紫花蘇芡和‘紫花刺芡為試材，研究芡實(shí)種仁發(fā)育過程中支鏈淀粉含量變化、淀粉粒形成及淀粉糊化特性;同時(shí)克隆GeSBE1、分析其功能結(jié)構(gòu)，以及該基因在芡實(shí)種仁的發(fā)育過程的表達(dá)特性，以期為探明GeSBE1在芡實(shí)種仁發(fā)育過程中支鏈淀粉合成和品質(zhì)形成的作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

試材為‘紫花蘇芡和‘紫花刺芡，種植于揚(yáng)州大學(xué)水生蔬菜試驗(yàn)基地，正常栽培管理。

1.2? 方法

1.2.1? 材料處理? 采取花后10、15、20、25 d的發(fā)育正常的芡實(shí)果實(shí)，在冰塊上迅速剝?nèi)》N仁。用于cDNA克隆及基因表達(dá)分析的種仁立即用液氮冷凍后置?80 ℃冰箱保存。用于淀粉體電鏡觀察的種仁則經(jīng)雙面刀片切取成大約1 mm×1 mm× 4 mm見方的長(zhǎng)方體小塊后，立即投入0.1 mol/L戊二醛固定液中，置于0～4 ℃下冷藏。用于淀粉含量測(cè)定的種仁則迅速放入烘箱105 ℃殺青1 h，之后在60 ℃恒溫下烘干。作糊化特性的測(cè)定的種仁取自花后20 d的種子，待自然晾干至恒重后粉碎備用。

1.2.2? 測(cè)定方法? （1）芡實(shí)淀粉含量的測(cè)定：總淀粉含量測(cè)定采用蒽酮比色法[15];直鏈淀粉含量測(cè)定采用雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)法[16];支鏈淀粉含量為總淀粉含量減去直鏈淀粉含量。

（2）芡實(shí)淀粉的糊化特性：用澳大利亞Newport Scientific儀器公司生產(chǎn)的RVA（Rapid Visco Analyzer， Model 3D）快速測(cè)定淀粉黏滯特性，并用TCW（Thermal Cycle for Windows）配套軟件分析。樣品操作參照Standard 2的規(guī)程。

（3）芡實(shí)種子發(fā)育過程中淀粉體形成的掃描電鏡觀察：從戊二醛固定液中取出芡實(shí)種仁長(zhǎng)方體小塊，用雙蒸水清洗3次，每次15 min，之后用鋨酸固定3 h，再用雙蒸水清洗（方法同上），后經(jīng)丙酮逐級(jí)脫水，置于乙醇與乙酸戊酯（1∶1）的混合液中浸泡20 min，然后置于乙酸戊酯中浸泡30 min，之后進(jìn)行CO2臨界點(diǎn)干燥。干燥后用雙面刀片在長(zhǎng)方體小塊中部輕輕劃一道痕，用鑷子沿劃痕將小塊掰成兩塊，將斷開的兩塊的斷裂面朝上用雙面膠黏貼，置載物臺(tái)上，在IB-3型離子濺射儀內(nèi)對(duì)樣品斷裂面噴金后，用Philips XL30-ESEM型環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察淀粉粒形態(tài)與結(jié)構(gòu)，并照相。電鏡加速電壓為20 kV。

（4）GeSBE1 cDNA 3′和5′端序列的獲得：使用TAKARA MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒進(jìn)行芡實(shí)RNA的提取。使用3′-Full RACE Core Set Ver2.0試劑盒、5′-Full RACE Kit試劑盒（TaKaRa公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA（具體合成過程及條件完全參照試劑盒說明）。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室芡實(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的GeSBE1序列片段，設(shè)計(jì)3′端RACE引物，上游引物（5′-AGTTGGTTGCGACTTGCC-3′），下游引物為Oligo（dT）18;5′端RACE引物（5′-CAGCAGG AG

C CCATTCACGATAAACTA-3′）反應(yīng)體系參考TaK aRa公司的3′和5′試劑盒步驟進(jìn)行操作。將回收的PCR產(chǎn)物連接至pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，挑取單克隆菌落，送至擎科生物科技（南京）有限公司測(cè)序。

（5）GeSBE1熒光定量qPCR的表達(dá)分析：根據(jù)GeSBE1 cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物（5′-TGGATGTCGTTCACAGCCATGC-3′）、下游引物（5′-CCTCAAGCCAC CACCTC AAGT T

AG-3′），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為198 bp。根據(jù)芡實(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的β-actin基因序列，設(shè)計(jì)內(nèi)參引物，上游引物（5′-ATGAAGATACTCACGG AAA GGG

GT-3′）、下游引物（5′-GGACATCG GAA A C GCT

CA-3′）。qPCR參照熒光定量試劑盒 SYB R premix EXTagTM reagent（TaKaRa）說明書進(jìn)行。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;并采用Excel 2010軟件制圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 芡實(shí)種仁發(fā)育過程中支鏈淀粉含量變化

在芡實(shí)種仁的成熟過程中，支鏈淀粉的含量均呈上升趨勢(shì)（圖1A）?！匣ㄌK芡種仁的支鏈淀粉含量在花后15～20 d時(shí)增加速度最快，增加幅度為36.2%;‘紫花刺芡種仁支鏈淀粉在花后10～15 d時(shí)增加最快，之后增加的幅度趨于平緩。在花后25 d種仁達(dá)鮮食成熟時(shí)，‘紫花蘇芡支鏈淀粉的含量達(dá)48.30%;顯著高于‘紫花刺芡的38.82%。

芡實(shí)種仁的發(fā)育過程中，支鏈淀粉含量與直鏈淀粉含量的比值呈下降趨勢(shì)（圖1B）。‘紫花蘇芡的支鏈淀粉含量與直鏈淀粉含量的比值始終顯著高于‘紫花刺芡，這與‘紫花蘇芡的種仁糯性，‘紫花刺芡的種仁粳性表現(xiàn)一致。在花后15～20 d，‘紫花蘇芡種仁中支鏈淀粉與直鏈淀粉比值的快速下降，降幅達(dá)16.5%，相比之下，‘紫花刺芡中的下降幅度較小。至花后25 d種仁鮮食成熟時(shí)，‘紫花蘇芡和‘紫花刺芡支鏈淀粉和直鏈淀粉含量的比值分別為2.55和1.79，差異顯著。

2.2? 芡實(shí)發(fā)育過程中淀粉粒的形態(tài)

由表1和圖2可知，在花后10 d，‘紫花蘇芡的種仁細(xì)胞進(jìn)入初始增殖階段，細(xì)胞體積較小，淀粉粒的平均大小為1.97 μm;隨后，淀粉粒的體積不斷擴(kuò)大，至花后25 d時(shí)平均直徑達(dá)2.17 μm，此時(shí)的淀粉粒大小較均勻，變異系數(shù)為0.06～0.45，淀粉粒呈不規(guī)則多面體，棱角明顯?！匣ù誊偷矸哿ｓw積總體偏小，花后25 d平均直徑為2.05 μm，淀粉粒大小不均勻，變異系數(shù)較大，達(dá)1.06～1.19;淀粉粒多數(shù)偏圓、棱角少，淀粉粒之間排列較疏松。

2.3? 芡實(shí)種仁淀粉的糊化特性

表2列出了‘紫花蘇芡和‘紫花刺芡淀粉糊化特性?！匣ㄌK芡淀粉黏度開始變化的時(shí)

不同小寫字母表示差異顯著（p<0.05）。

間比‘紫花刺芡早0.3 min，糊化溫度為85.65 ℃，比‘紫花刺芡低0.7 ℃，表明其糊化所需能量較低，易于糊化。‘紫花蘇芡的峰值黏度達(dá)2611 cp，高于‘紫花刺芡257 cp，這與‘紫花蘇芡支鏈淀粉含量高于‘紫花刺芡相符?！匣ㄌK芡的崩解值大于‘紫花刺芡，表明其淀粉在高溫下耐剪切的能力較弱，熱黏度穩(wěn)定性較差，口感較軟黏。‘紫花刺芡的冷膠黏度為2941 cp高于‘紫花蘇芡，淀粉糊的硬度較大，口感差。

2.4? GeSBE1 cDNA的克隆

根據(jù)GeSBE1 cDNA中間序列片段設(shè)計(jì)引物，5′RACE技術(shù)擴(kuò)增得到1條長(zhǎng)度為573 bp的核苷酸序列（圖3A）;采用3′RACE技術(shù)擴(kuò)增得到一條長(zhǎng)度為620 bp的核苷酸序列（圖3B）。將序列與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的GeSBE1 cDNA中間序列進(jìn)行拼接，得到全長(zhǎng)為2782 bp的GeSBE1 cDNA序列，包括3′端非編碼區(qū)203 bp、5′端非編碼區(qū)113 bp和2466 bp的開放閱讀框（ORF），可編碼821個(gè)氨基酸（圖4）。

2.5? GeSBE1序列分析

將GeSBE1基因的cDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blastn后發(fā)現(xiàn)，該序列與蓮藕SBEI（NW0013 02849.1）相似度達(dá)78%，與高粱、水稻、小麥等的相似度均達(dá)到70%～77%，由此可見SBE基因在不同植物中具有較高的保守性。

利用ProtParam軟件（http：//au.expasy.org/ tools/protparam.html/）對(duì)芡實(shí)淀粉分支酶氨基酸序列進(jìn)行分析，GeSBE1編碼的蛋白分子量為94.3 ku，理論等電點(diǎn)為5.44，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基數(shù)（Asp+Glu）為117個(gè)，帶正電荷的氨基酸殘基數(shù)（Arg+Lys）為86個(gè)，總平均親水性為?0.475，為親水性蛋白，不穩(wěn)定系數(shù)為31.38，為穩(wěn)定蛋白。其第242～650個(gè)氨基酸組成了GeSBE1的淀粉酶催化域，包括420～540個(gè)左右的氨基酸構(gòu)成的活性位點(diǎn)和催化位點(diǎn)（圖5）。

2.6? GeSBEI表達(dá)分析

芡實(shí)種仁的發(fā)育過程中，GeSBE1表達(dá)呈先上升后下降的趨勢(shì)。其中，‘紫花刺芡在花后15 d表達(dá)量達(dá)到峰值，而‘紫花蘇芡直至花后20 d才達(dá)到表達(dá)峰值;在花后15 d后，‘紫花刺芡的表達(dá)量顯著下降，降幅達(dá)到43.44%。種仁發(fā)育過程中，‘紫花蘇芡GeSBE1的表達(dá)量總體高于‘紫花刺芡，與種仁發(fā)育過程中‘紫花蘇芡支鏈淀粉含量始終高于‘紫花刺芡的結(jié)果相符;花后第10、15天，二者GeSBE1的表達(dá)量差異不顯著，但花后第20、25天，‘紫花蘇芡GeSBE1的表達(dá)量仍然保持高水平，而‘紫花刺芡的表達(dá)量快速下降，‘紫花刺芡的表達(dá)量分別僅為‘紫花蘇芡的43.94%和50.84%。

3? 討論

3.1? 芡實(shí)種仁發(fā)育過程中支鏈淀粉特性

在植物中，淀粉主要以淀粉粒的形態(tài)貯藏，淀粉粒由支鏈淀粉和直鏈淀粉組成，其中支鏈淀粉構(gòu)成了淀粉粒的骨架，支鏈淀粉含量越高，淀粉粒形態(tài)更加立體[17-18]。支鏈淀粉和直鏈淀粉含量的比值一直被作為衡量稻米食用品質(zhì)的重要指標(biāo)，支鏈淀粉含量高的米飯軟而黏，品質(zhì)較好[19]。本研究中‘紫花蘇芡種仁的支鏈淀粉的含量及支鏈淀粉與直鏈淀粉含量的比值均高于‘紫花刺芡，與‘紫花蘇芡黏性強(qiáng)、性糯、食用品質(zhì)好一致。

淀粉的懸浮液在加熱過程中，淀粉粒吸水膨脹破裂，淀粉分子在溶液中形成具有黏度的糊狀物，這種現(xiàn)象叫做淀粉的糊化。淀粉的糊化與淀粉粒的結(jié)構(gòu)有關(guān)，由于淀粉粒中存在由直鏈淀粉構(gòu)成的結(jié)晶區(qū)和支鏈淀粉構(gòu)成的無(wú)定形區(qū)，結(jié)晶區(qū)是熱力學(xué)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，因此淀粉中直鏈淀粉含量越高，糊化所需的能量越高，反之越低[20]。糊化過程中黏度的變化可分為4個(gè)階段。①在加熱過程中，水分從淀粉粒的孔隙中進(jìn)入，與部分極性基團(tuán)相結(jié)合，黏度曲線變化平緩[21]。②當(dāng)溫度達(dá)到糊化溫度時(shí)，淀粉粒開始大量吸水出現(xiàn)不可逆的膨脹，淀粉粒外圍的支鏈淀粉層出現(xiàn)脹裂，淀粉懸浮液變成高黏度糊漿，破碎的支鏈淀粉層形成凝膠，顆粒內(nèi)部的直鏈淀粉游離出來形成溶膠，淀粉懸浮液呈現(xiàn)黏稠狀，黏度曲線迅速上升，支鏈淀粉含量越高，淀粉的峰值黏度越高[22]。③在淀粉糊化后繼續(xù)加溫或者保持溫度，溶液從凝膠態(tài)變?yōu)槿苣z態(tài)，黏度下降，出現(xiàn)稀懈現(xiàn)象，這個(gè)黏度降低過程的終點(diǎn)稱為熱漿黏度，崩解值表示淀粉糊黏度熱穩(wěn)定性的變化[23]。④當(dāng)溫度下降，分子運(yùn)動(dòng)減慢，分散的淀粉分子開始重新結(jié)合，溶液出現(xiàn)膠凝現(xiàn)象，淀粉糊的黏度上升，支鏈淀粉的含量與冷膠黏度呈反比[24]。淀粉黏滯性（RVA）特征值中的峰值黏度的高低主要是由淀粉粒的結(jié)構(gòu)決定的，淀粉粒的骨架由支鏈淀粉構(gòu)成，研究表明淀粉粒中支鏈淀粉含量越高在糊漿中形成的凝膠越多，淀粉的黏度則越高[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，‘紫花蘇芡種仁淀粉峰值黏度更高，崩解值更大，淀粉易于糊化，種仁食用品質(zhì)較好。在小麥?zhǔn)秤闷焚|(zhì)與淀粉糊化特性的研究中，同樣發(fā)現(xiàn)RVA的峰值黏度與面條的彈性、韌性和食用品質(zhì)呈極顯著正相關(guān)，崩解值與面條的品質(zhì)呈顯著負(fù)相關(guān)[26]。淀粉粒的大小不均是導(dǎo)致稻米品質(zhì)性狀下降的一個(gè)重要原因，淀粉粒直徑的變異系數(shù)可作為衡量米質(zhì)優(yōu)劣的間接指標(biāo)，優(yōu)質(zhì)稻米中，單淀粉粒為棱角分明的多面體，粒間排列緊密，劣質(zhì)稻米中多數(shù)淀粉粒形狀近圓形，棱角較少，排列疏松[27]?！匣ㄌK芡種仁中淀粉粒大小相對(duì)均勻，變異系數(shù)低，且棱角分明，排列緊密，糯性，而‘紫花刺芡淀粉粒多數(shù)呈圓形，粳性，這與前人[28]在糯小麥和非糯小麥的淀粉粒形態(tài)研究中發(fā)現(xiàn)，糯小麥的B型淀粉粒主要呈現(xiàn)不規(guī)則多邊形狀，非糯小麥主要呈圓球狀的結(jié)果相似。

3.2? GeSBEI在芡實(shí)種仁淀粉合成過程中的作用

淀粉分支酶（SBE）又稱Q酶，是形成支鏈淀粉的關(guān)鍵酶，有SBEI和SBEII兩種同工型，SBEI傾向于以直鏈淀粉作為底物，而SBEII對(duì)支鏈淀粉的親和力高[29]。SBE既可以與淀粉粒結(jié)合而存在，也可以以游離態(tài)存在于基質(zhì)中[30]。本研究克隆獲得的GeSBE1的cDNA序列全長(zhǎng)為2796 bp，編碼821個(gè)氨基酸，蛋白分子量為94.3 ku，cDNA序列與蓮藕SBEI相似度最高達(dá)78%，推測(cè)克隆得到的GeSBE1可能屬于SBEI型，可能對(duì)直鏈淀粉親和力更高，可將較長(zhǎng)的糖鏈轉(zhuǎn)移到直鏈淀粉上產(chǎn)生分支，形成支鏈淀粉[30]。在‘紫花蘇芡種仁的發(fā)育過程中，GeSBE1的表達(dá)量始終保持高水平，這可能直接導(dǎo)致其支鏈淀粉的含量以及支鏈淀粉與直鏈淀粉比值均明顯高于‘紫花刺芡。由于花后20 d‘紫花蘇芡和‘紫花刺芡中GeSBE1的表達(dá)量表現(xiàn)出顯著差異，表明該發(fā)育時(shí)期可能是影響芡實(shí)淀粉品質(zhì)的重要時(shí)期;以上結(jié)果表明，芡實(shí)GeSBE1可能在調(diào)控支鏈淀粉的合成并最終對(duì)芡實(shí)種仁品質(zhì)起重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)支鏈淀粉含量、支鏈淀粉與直鏈淀粉的比例、淀粉糊化特性和淀粉粒的形態(tài)結(jié)構(gòu)是影響芡實(shí)種仁品質(zhì)性狀的重要指標(biāo)，尤其是支鏈淀粉與直鏈淀粉的比例在較大程度上決定了淀粉的物理化學(xué)特性，從而決定芡實(shí)種仁的淀粉品質(zhì);SBE作為支鏈淀粉合成中的關(guān)鍵酶，能夠切開寡糖片段，同時(shí)又能將切開的短鏈連接到受體鏈上，形成分支結(jié)構(gòu)，對(duì)支鏈淀粉含量及鏈長(zhǎng)起著重要作用，是影響芡實(shí)淀粉品質(zhì)的重要基因。這為今后深入挖掘GeSBE1基因功能，探明GeSBE1基因與芡實(shí)支鏈淀粉合成和結(jié)構(gòu)的關(guān)系，解析GeSBE1調(diào)控芡實(shí)淀粉品質(zhì)的分子機(jī)制提供了一定的理論依據(jù)。

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