天然橡膠生物合成相關(guān)基因表達與橡膠產(chǎn)量的相關(guān)性

楊署光 陳月異 李言 張世鑫 張曉飛 曾霞

摘? 要? 膠乳被認為是橡膠樹的一種與傷害應(yīng)答相關(guān)聯(lián)的保護物質(zhì)。割膠可以顯著促進橡膠生物合成，且此促進作用與激活乳管細胞中橡膠生物合成相關(guān)基因的表達相關(guān)，但相關(guān)性大小尚不清楚。本文通過qPCR分析了正常割膠條件下，6個橡膠生物合成相關(guān)基因HbHRT2、HbSRPP、HbREF、HbHMGR1、HbHRT1、HbGAPDH在5個橡膠樹魏克漢種質(zhì)和5個1981IRRDB種質(zhì)膠乳中的表達情況。結(jié)果顯示：這6個基因在魏克漢種質(zhì)中的表達水平顯著高于1981IRRDB種質(zhì)，分別是后者的1.05～14.62、0.97～4.26、1.46～12.56、0.83～2.99、0.43～7.54、1.92～11.31倍，平均值是后者的7.54、2.55、5.69、1.71、2.71、4.91倍。相關(guān)性分析表明，這些基因的表達與橡膠樹干膠產(chǎn)量呈正相關(guān)，其中，HbREF和HbGAPDH的表達水平與干膠產(chǎn)量之間的相關(guān)性最高，有望作為橡膠樹產(chǎn)量育種的分子指標。

關(guān)鍵詞? 巴西橡膠樹;割膠;橡膠生物合成;基因表達

中圖分類號? S31? ? ? 文獻標識碼? A

在亞馬遜森林，橡膠樹與其他10多種橡膠屬植物共存，而所有橡膠樹種均為雌雄同株，并有優(yōu)先異交的習(xí)性[1-2]，因此，橡膠樹是一個高度雜合的物種復(fù)合體[3]，其種群/種屬間存在高頻的基因流動[4-9]。1876年，魏克漢（Wickham）從巴西收集了7萬多粒橡膠樹種子，獲得了少量的種子苗。20世紀初，有20多株種子苗被成功引種到東南亞，成為該地區(qū)幾乎所有橡膠樹種植園的先祖。1920s以前，橡膠樹主要通過種子和芽接的方式繁殖。1920s以后，人們開始了雜交育種工作[10-11]。經(jīng)驗表明，從雜交授粉開始到完成系列選育種過程耗時30多年[12]。由于引種馴化時間短，目前栽培的幾乎所有無性系品種以及仍在選擇中的基因型與亞馬遜森林野生祖先相隔不到10代，這對于一個大面積種植的樹種來說世代數(shù)太少[4]。人工雜交育種到目前也才進入到第四代。可見，橡膠樹大規(guī)模種植和遺傳改良的歷史并不長。雖然絕大部分無性系起源于19世紀引種到亞洲的所謂‘魏克漢樹，但由于大多數(shù)的栽培品種仍包含足夠的等位基因多樣性，這使得遺傳改良成為可能[4， 13]。研究表明，橡膠樹種群間的基因結(jié)構(gòu)還沒有明顯的分離，不同來源種質(zhì)間共享80%左右的等位基因[4]。以魏克漢種質(zhì)為親本雜交獲得的F1代的產(chǎn)量變異系數(shù)高達50.7%～ 100.1%[14-16]。

天然橡膠是巴西橡膠樹的重要次生代謝產(chǎn)物，來源于類異戊二烯代謝途徑，涉及一系列橡膠生物合成關(guān)鍵酶[17]，如橡膠延伸因子（rubber elongation factor， REF）[18]、小橡膠粒子膜蛋白（small rubber particle protein， SRPP）[19]、3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydro xy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase， HM G R）[20]、橡膠轉(zhuǎn)移酶（Hevea brasiliensis rubber transferase， HRT）[21]等。橡膠樹的產(chǎn)量性狀是一種典型的次生產(chǎn)量性狀，由反復(fù)合理的收獲脅迫（割膠）形成[22]。割膠后流出的膠乳是乳管細胞的細胞質(zhì)，是橡膠樹應(yīng)答傷害的相關(guān)保護物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，細胞質(zhì)中的3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， G A PDH;主要是參與糖酵解反應(yīng)）基因可以響應(yīng)多種脅迫反應(yīng)，在植物抗逆過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[23]。割膠后，與膠乳再生和防衛(wèi)相關(guān)的基因表達增強，同時伴隨著蛋白合成效率的提高，從而使膠乳的代謝活性增加。機械傷害和割膠可以顯著促進乳管的分化[24]，顯著提高REF[17， 25]、SRPP[19， 25]、FPS[26]等和乳膠生物合成相關(guān)基因的表達[27]。但是，橡膠生物合成相關(guān)基因的表達與橡膠產(chǎn)量的相關(guān)性尚不清楚。本研究通過分析橡膠生物合成相關(guān)基因的表達與橡膠產(chǎn)量的相關(guān)性，旨在找到與產(chǎn)量相關(guān)的分子標記，這對于育種周期長的橡膠樹產(chǎn)量育種而言具有重要的實際應(yīng)用價值?？蔀檠芯肯鹉z樹產(chǎn)量形成的調(diào)控機理、開發(fā)新型的產(chǎn)量刺激劑提供理論基礎(chǔ)，為研發(fā)橡膠樹產(chǎn)量早期預(yù)測技術(shù)、通過轉(zhuǎn)基因育種等途徑提高橡膠樹產(chǎn)量提供備選基因。

1? 材料與方法

1.1? 材料

實驗材料是割齡為10 a的巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）的5份魏克漢種質(zhì)和5份1981IRRDB種質(zhì)。其中5份魏克漢種質(zhì)是經(jīng)過人工選育的橡膠樹品種PR107、RRIM600、熱墾628、熱墾525和熱墾523;5份1981IRRDB種質(zhì)未經(jīng)人工選育，編號為RO/CM/10 44/160、MT/IT/13 29/8、RO/C/8 24/104、RO/I/103 107、RO/CM/10 44/454。這些實驗樹種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗場。

DNaseⅠ購自天根公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit購自Ferments公司。qPCR試劑SYBR? Ppermix Ex TaqTM Ⅱ（2×）（Tli RNaseH Plus）購自大連寶生物公司（TaKaRa Japan）。其他生化試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。引物合成由Invitrogen公司完成。

1.2? 方法

1.2.1? 材料處理? 每個種質(zhì)隨機挑選3株，在生產(chǎn)中正常割膠（S/2D d3：二分之一樹圍，陽刀，三天一刀）的第十刀，收集前10 min流出的膠乳，每個種質(zhì)均取3株的等體積混合樣，用于提取膠乳總RNA。

1.2.2? 總RNA的提取與cDNA的合成? 膠乳總RNA提取參照曾日中等[28]的方法。cDNA第一鏈的合成根據(jù)試劑盒的操作步驟進行：取1 μg膠乳總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，稀釋10倍后作為qPCR分析的模板。

1.2.3? 基因表達分析? （1）qPCR反應(yīng)。qPCR反應(yīng)體系為20 μL，其中SYBR? Ppermix Ex TaqTM Ⅱ（2×）10 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL（引物濃度為10 μmol/L，反應(yīng)體系中每條引物終濃度均為0.2 μmol/L）、cDNA模板1 μL、ddH2O 8.2 μL。qPCR反應(yīng)在LightCycler? Capillaries（20 ?l，Roche）毛細管中完成，在Roche Diagnostics公司的Light Cycler Real Time PCR擴增儀中運行，實驗操作按儀器使用說明書進行，qPCR反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40個循環(huán)，然后進行溶解曲線分析（60～95 ℃，0.2 ℃/S），運行結(jié)束后冷卻至40 ℃。每個樣品做2次技術(shù)性重復(fù)，Cq標準差控制在0.2以內(nèi)。利用LightCycler Software 4.05軟件采集qPCR反應(yīng)的Cq值。（2）qPCR引物篩選。根據(jù)

GenBank登錄的基因的cDNA全長序列設(shè)計qPCR引物。以10倍梯度稀釋的cDNA為摸板制備標準曲線，獲得目的基因qPCR引物的擴增效率，選擇擴增效率在85%以上的引物對開展實驗;通過溶解曲線峰的數(shù)目判斷引物的特異性，選擇具有單一的溶解曲線峰的引物對開展實驗;獲得的qPCR產(chǎn)物通過測序印證。該研究所用引物見表1。（3）基因表達分析。根據(jù)“Q=2△Cq= 2min Cq-Sample Cq”計算基因的表達值（Q），以Hb18S作為內(nèi)參基因，根據(jù)“E=Q目的基因/Q內(nèi)參基因”分析目的基因的相對表達值（E）。樣本間相對基因表達倍數(shù)[29]可直觀的反映出彼此間表達差異的大小，根據(jù)“F=EA/EB”分析樣本A對樣本B的基因相對表達倍數(shù)（folds，F(xiàn)）。根據(jù)“變異系數(shù)（C·V）=標準差（s）/平均數(shù)（）×100%”分析基因表達倍數(shù)的變異系數(shù)。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2003軟件作圖，用SPSS軟件的Duncan檢驗進行多重比較分析。用Excel TTEST（Array 1，Array 2，Tails 1，Type 1）進行成對比較分析。用SPSS軟件分析基因表達和參照曾霞等[30]的方法獲得的干膠產(chǎn)量的Pearson相關(guān)性。

2? 結(jié)果與分析

2.1? qPCR引物篩選

以10倍梯度稀釋的cDNA為摸板制備標準曲線，獲得目的基因qPCR引物的擴增效率在89%～98%之間（圖1A）;溶解曲線分析表明，各個基因的引物均獲得單一的溶解曲線峰、無模板對照（NTC）無擴增產(chǎn)物，表明qPCR沒有任何非特異性的擴增（圖1B）。

2.2? 橡膠樹種質(zhì)間橡膠生物合成相關(guān)基因的表達分析

qPCR分析表明，HbHRT2（圖2A）和HbSRPP（2B）僅在1個（20%）1981IRRDB種質(zhì)中達到魏克漢種質(zhì)的表達水平;HbHMGR1（圖2D）僅在1（20%）個魏克漢種質(zhì)中低至1981IRRDB種質(zhì)的表達水平;HbHRT1（圖2E）僅有2個（40%）魏克漢種質(zhì)顯著高于1981IRRDB種質(zhì)的表達水平，3個（60%）魏克漢種質(zhì)和1981IRRDB種質(zhì)中表達水平相當;值得注意的是，HbREF（圖2C）和HbGAPDH（圖2F）在所有魏克漢種質(zhì)中的表達量均極顯著高于1981IRRDB種質(zhì)。統(tǒng)計分析表明，這6個基因在魏克漢種質(zhì)組的表達水平均顯著高于1981IRRDB種質(zhì)組，其中HbHRT2、HbSRPP、HbREF和HbGAPDH差異極顯著（圖2H）;80%的魏克漢種質(zhì)中，6個基因表達的平均值均顯著高于1981IRRDB種質(zhì)（圖2G）。

魏克漢種質(zhì)分別對1981IRRDB種質(zhì)的基因表達倍數(shù)的結(jié)果表明（表2），優(yōu)勢表達基因是HbHRT2、HbREF和HbGAPDH，平均表達倍數(shù)分別為7.54、5.69和4.91倍，最大倍數(shù)均超過10倍。但是，同一基因在不同種質(zhì)間的表達倍數(shù)有明顯差異，變異系數(shù)分別為58.26%（HbHRT2）、74.00%（HbHRT1）、40.40%（HbSRPP）、69.43%（HbREF）、36.09%（HbHMGR1）、62.33%（HbGAPDH）。值得注意的是，HbGAPDH在5個魏克漢種質(zhì)對1981IRRDB種質(zhì)的表達倍數(shù)均

A.通過標準曲線計算出qPCR的擴增效率為89%～98%;縱坐標：Cp值，橫坐標：模板濃度的對數(shù)。B.通過溶解曲線分析qPCR擴增的特異性，均獲得單一的溶解曲線峰，并且無模板對照（NTC）無擴增，說明qPCR沒有任何非特異性的擴增;在18S的擴增中，雖然NTC有很少的一點擴增（Cp =31.1±2.2），但Cp值遠遠小于樣品的Cp值（9.5±0.3），因此對定量無影響;縱坐標：熒光（530 nm）強度，橫坐標：溫度（65～95 ℃）。

2.3? 橡膠樹種質(zhì)間橡膠生物合成相關(guān)基因與干膠產(chǎn)量的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明，HbSRPP、

HbREF和HbGAPDH基因表達與干膠產(chǎn)量均呈顯著相關(guān)（p<0.05）;值得注意的是，HbREF和HbGAPDH基因表達與干膠產(chǎn)量呈極顯著相關(guān)（p<0.01）（表3）。

橫坐標（A～G）：從左到右（1～10）依次代表魏克漢種質(zhì)PR107、RRIM600、熱墾628、熱墾525、熱墾523以及1981IRRDB種質(zhì)RO/CM/10 44/160、MT/IT/13 29/8、RO/C/8 24/104、RO/I/103 107、RO/CM/10 44/454;G. 每個種質(zhì)的基因相對表達量為HbHRT2， HbSRPP， HbREF， HbHMGR1， HbHRT1和 HbGAPDH這6個基因表達值的平均數(shù)±標準差;H. 每個基因的相對表達量為5個魏克漢種質(zhì)或5個1981IRRDB種質(zhì)中的平均數(shù)±標準差;不同大寫字母或**表示組間差異極顯著（p<0.01），不同小寫字母或

3? 討論

割膠促進橡膠樹合成天然橡膠，2次割膠之間的橡膠再生涉及到橡膠合成酶基因的誘導(dǎo)表達調(diào)控[27]。割膠可以顯著提高REF[18， 25]、SRPP[19， 25]等橡膠合成酶基因的表達。因此，應(yīng)可通過研究橡膠合成酶基因在不同干膠產(chǎn)量種質(zhì)中的表達差異來篩選產(chǎn)量相關(guān)的分子標記。

一般認為變異幅度大于2倍的基因為差異表達基因[29]。魏克漢種質(zhì)組膠乳中HbHRT2、HbSRPP、HbREF、HbHRT1和HbGAPDH基因的表達水平平均是1981IRRDB種質(zhì)組的2倍以上，表明這5個基因是兩組種質(zhì)的差異表達基因;其中HbHRT2、HbREF和HbGAPDH的表達差異最大。HbREF和HbGAPDH基因表達與橡膠樹種質(zhì)干膠產(chǎn)量的Pearson相關(guān)性高，有望作為橡膠樹產(chǎn)量育種的侯選分子標記。

一個假設(shè)在訓(xùn)練數(shù)據(jù)上能夠獲得比其他假設(shè)更好的擬合，但是在訓(xùn)練數(shù)據(jù)外的數(shù)據(jù)集上卻不能很好地擬合數(shù)據(jù)，此時認為這個假設(shè)出現(xiàn)了過擬合的現(xiàn)象。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的主要原因是訓(xùn)練數(shù)據(jù)中存在噪音或者訓(xùn)練數(shù)據(jù)太少[31]。需要注意的是，該研究的樣本數(shù)量有限，存在過度擬合的可能性，因此，該研究結(jié)果需要擴大群體進一步印證。

盡管個別基因在個別1981IRRDB種質(zhì)中已達到魏克漢種質(zhì)的表達水平，但4個（80%）魏克漢種質(zhì)中這6個基因的整體平均表達水平極顯著高于1981IRRDB種質(zhì)，1個（20%）魏克漢種質(zhì)中這6個基因的整體平均表達水平顯著高于4個（80%）1981IRRDB種質(zhì)，表明它們在調(diào)控橡膠生物合成過程中具有協(xié)同作用。

該研究的5個魏克漢種質(zhì)中，RRIM600的親本組合為Tjirl×PB86[14-15]，熱墾628的親本組合為IAN873×PB235[14]，熱墾525的親本組合為INA873×RRIM803[15]，熱墾523的親本組合為IAN873×PB260[14];PR107為初生代無性系[16， 32]，RRIM600為次生代無性系[13， 33]，熱墾628、熱墾525、熱墾523為四生代無性系。5個1981IRRDB種質(zhì)RO/CM/10 44/160、MT/IT/13 29/8、RO/C/8 24/104、RO/I/103 107、RO/CM/10 44/454分別來自巴西的不同地區(qū)，種植名稱中的字母表示來源地的代號。10份種質(zhì)間具有一定的多樣性，并且他們的產(chǎn)量都是經(jīng)過長期測定的結(jié)果，因此該研究的結(jié)果具有一定的可靠性。

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