染料木黃酮對(duì)大鼠體內(nèi)N-羥乙酰神經(jīng)氨酸含量的影響及其與唾液酸轉(zhuǎn)移酶相互作用的探討

李洪英，常瑞，朱秋勁,2，朱旭玲，徐阿奇，周櫻子，晏印雪

1 貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025

2 貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025

紅肉的攝入與癌癥、心血管和炎癥等疾病密切相關(guān)，這是因?yàn)榧t肉中含Neu5Gc[1-7]。Neu5Gc主要存在于脊椎動(dòng)物體內(nèi)，極少部分存在于微生物中，通常與糖蛋白或者糖脂以結(jié)合態(tài)的形式存在于體內(nèi)，很少以游離的形式存在[8-10]。其中結(jié)合態(tài)Neu5Gc含量是游離態(tài)的Neu5Gc含量的30倍，游離態(tài)Neu5Gc僅占2%左右[11]，且結(jié)合態(tài)的Neu5Gc才具有引發(fā)炎癥反應(yīng)的生物學(xué)功能。

大多數(shù)哺乳動(dòng)物自身能合成Neu5Gc，但人類(lèi)由于在進(jìn)化的過(guò)程中丟失了編碼胞苷-磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶 (CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH) 基因，所以正常人體內(nèi)不能合成Neu5Gc[12-14]，人體內(nèi)的Neu5Gc主要通過(guò)紅肉的攝入而積累，當(dāng)紅肉中的Neu5Gc進(jìn)入人體后，游離態(tài)的Neu5Gc迅速隨代謝產(chǎn)物(如尿液) 排出體外，結(jié)合態(tài)的Neu5Gc則能在腸道、肝臟、血液中穩(wěn)定存在，被機(jī)體當(dāng)作外來(lái)物質(zhì)，產(chǎn)生異種抗體，誘發(fā)機(jī)體處于低度炎癥狀態(tài)[15]。大量的流行病學(xué)資料表明，約20%的惡性腫瘤由炎癥誘發(fā)或促進(jìn)[16-17]。此外，紅肉易被產(chǎn)志賀毒素型大腸桿菌 (Shiga toxin-typeEscherichia coli，STEC)污染；若人體上皮細(xì)胞中存在結(jié)合態(tài)的Neu5Gc，當(dāng)它與志賀毒素結(jié)合時(shí)會(huì)引起胃腸道不適，從而引發(fā)腹瀉等癥狀；而當(dāng)腎內(nèi)皮細(xì)胞中存在聚集結(jié)合態(tài)的Neu5Gc時(shí)，與STEC產(chǎn)生的志賀毒素結(jié)合會(huì)破壞內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而誘發(fā)溶血性尿毒癥綜合征 (Hemolytic uremic syndrome，HUS)，引起血性腹瀉并伴隨腎衰竭等癥狀[1,18-20]?？梢?jiàn)，大宗畜產(chǎn)品紅肉中的Neu5Gc嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康，因此，設(shè)法從動(dòng)物性食品的源頭上降低Neu5Gc的含量顯得尤為必要。

目前降低紅肉中Neu5Gc含量的研究才剛剛起步，蔣蕓等[21]分別使用物理和化學(xué)酶解法對(duì)豬肉和牛肉進(jìn)行烹飪前的處理，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)紅肉中結(jié)合態(tài)Neu5Gc含量的降低有著不同程度的效果。Bardor等[22]利用阿米洛利和Gen培養(yǎng)人類(lèi)的癌細(xì)胞及突變細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)它們能降低細(xì)胞中Neu5Gc的含量，且Gen對(duì)Neu5Gc的抑制效果更好。然而，目前通過(guò)添加某種安全試劑降低動(dòng)物體內(nèi)Neu5Gc生物合成的方法鮮有報(bào)道。

本文基于Neu5Gc的合成路徑，尋找在哺乳動(dòng)物體內(nèi)抑制Neu5Gc的生物合成的抑制劑。Neu5Gc在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的生物合成路徑[14]如圖1所示。由圖1可知，Neu5Gc的生物合成涉及CMAH和ST，故抑制ST的活性是降低對(duì)促炎起主要貢獻(xiàn)的結(jié)合態(tài)Neu5Gc含量的關(guān)鍵；關(guān)于抑制ST的研究，王棐等[23]通過(guò)分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法探討了大豆皂苷Ⅰ抑制ST的機(jī)理，但在活體內(nèi)還沒(méi)有相關(guān)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

Gen是從大豆中提取的異黃酮類(lèi)化合物，存在于富含豆肽的多種天然植物中，在大豆中占到1.5%，明顯高于大豆皂苷 (0.6%)[24]，無(wú)毒副作用，在動(dòng)物細(xì)胞中具有廣泛的藥理學(xué)功效。Gen還可誘導(dǎo)T淋巴瘤細(xì)胞、乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡，具有抗腫瘤作用[25]?？梢?jiàn)Gen對(duì)降低動(dòng)物體內(nèi)Neu5Gc的生物合成必然存在一定的影響，然而，目前這種影響及其作用機(jī)制尚不清楚。

本研究首先考察Gen對(duì)大鼠體內(nèi)Neu5Gc的生物合成的影響；其次，通過(guò)分子對(duì)接探討Gen降低大鼠體內(nèi)Neu5Gc合成作用機(jī)制。本文以期為從飼喂環(huán)節(jié)降低紅肉中Neu5Gc的含量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)；主要對(duì)原料肉 (豬、牛、羊) 的養(yǎng)殖具有一定指導(dǎo)意義；為后續(xù)探索降低宰前紅肉中Neu5Gc含量的方法奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

采用試劑包括：Gen (純度>97%)(上海阿拉丁試劑有限公司)；色譜純?cè)噭┯校阂译?、甲?德國(guó)Applichem公司)、1,2-二氨基4,5-亞甲基二氧苯鹽酸鹽 (DMB)、β-巰基乙醇 (Sigma公司)；分析純?cè)噭┯校簹溲趸c、硫代硫酸鈉、無(wú)水亞硫酸鈉 (天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)、冰乙酸、硫酸銨 (成都金山化學(xué)試劑有限公司)；Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品。

主要儀器設(shè)備：Agilent-1260 Infinity高效液相色譜 (配有熒光檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器)；TGL20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) (長(zhǎng)沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司)；DY89-II型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)、SCIENTZ-10N真空冷凍干燥機(jī)、SB25-12DT超聲清洗器 (寧波新芝有限公司)；Heal Force超純水系統(tǒng)（力新儀器（上海）有限公司）；ADVENTURER電子分析天平 (奧豪斯儀器有限公司）。開(kāi)源免費(fèi)軟件AutoDock vina、貴州大學(xué)云計(jì)算平臺(tái)共享軟件SYBYL2.0。

圖1 Neu5Gc在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的生物合成Fig.1 Biosynthesis of Neu5Gc in mammals.

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠 (實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0011)，4周齡，體重 (70±2) g，由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，大鼠飼料由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及樣品采集

80只SD雄性大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分成2組，40只/組，即對(duì)照組、Gen組。分組后連續(xù)灌胃60 d，對(duì)照組灌胃5%的乙醇 (1 mL/只)，Gen組灌胃300 mg/(kg·d) (根據(jù)Gen的安全劑量范圍及在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮生理作用的特點(diǎn)選定300 mg/(kg·d) 為實(shí)驗(yàn)劑量[26-30]) Gen的溶液(1 mL/只) (溶液配制方法：Gen的質(zhì)量根據(jù)300×大鼠體重 (kg)×數(shù)量 (只) 計(jì)算，1–4周Gen的質(zhì)量分別為8.40、10.08、9.82和10.08 g，由于Gen不溶于水而溶于乙醇，故先用5 mL的酒精溶解Gen，再用蒸餾水稀釋定容)；動(dòng)物房溫度控制在(23±2) ℃，濕度60%；自由進(jìn)食、自由進(jìn)水。

灌胃15 d、30 d、45 d、60 d后，在對(duì)照組和Gen組中分別選10只大鼠，用乙醚迷暈后，斷頸處死，取大腿肌肉、肝臟組織、腎臟組織于-80 ℃保存待用。

1.3.2 肌肉組織及內(nèi)臟組織前處理

分別稱(chēng)取1 g后腿肌肉及左腎組織、肝臟組織于勻漿瓶中，加入10 mL的30%的硫酸銨磨成勻漿液，-80 ℃冷凍12 h沉淀蛋白質(zhì)后冷凍干燥成粉末；將干燥后的粉末加入10 mL濃度為2 mol/L的醋酸在80 ℃水浴3 h進(jìn)行酸解，使樣品中結(jié)合態(tài)的Neu5Gc解離為游離態(tài)的Neu5Gc[1,8]；之后13 363 ×g離心15 min，并用0.45 μm的有機(jī)濾頭過(guò)濾后于-80 ℃冷凍12 h，之后進(jìn)行真空冷凍干燥成粉末；將凍干粉溶于1.0 mL的蒸餾水和0.2 mL NaOH (濃度0.1 mol/L) 中，在37 ℃的條件下水浴30 min去乙酰化處理；取去乙?；臉悠?00 μL，加入100 μL的衍生劑，在避光的條件下衍生150 min后進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)樣品中游離態(tài)和結(jié)合態(tài)Neu5Gc總的含量。

1.3.3 衍生劑的配置及HPLC檢測(cè)條件

衍生劑的配制參考了文獻(xiàn)[1,21]的配置方法：0.008 mol/L的DMB、0.25 mol/L的Na2S2O3·5H2O、1.5 mol/LCH3COOH（冰醋酸）分析純、0.25 mol/L亞硫酸鈉（分析純）、0.8 mmol/L的2-巰基乙醇（色譜純）。

衍生條件：將100 μL的衍生劑加入到盛有900 μL樣品瓶中，50 ℃避光衍生2.5 h，冷卻至室溫后進(jìn)樣進(jìn)行HPLC-FLD分析。

HPLC檢測(cè)條件：德國(guó)默克Li Chrosorb RP-18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-甲醇-超純水(8 ∶ 7 ∶ 8 5，V/V)，流速為0.9 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積10 μL，熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)373 nm、發(fā)射波長(zhǎng)448 nm。

為探討Gen降低大鼠體內(nèi)Neu5Gc合成的作用機(jī)制，參考本團(tuán)隊(duì)前期探索和總結(jié)的方法[31]，采用分子對(duì)接探討Gen與ST可能的作用過(guò)程，具體步驟如下。

1.3.4 AutoDock vina對(duì)接

采用分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)分析探討Gen與ST相互作用的可能過(guò)程。利用AutoDock vina和SYBYL2.0中的Surflex-Geom對(duì)接模塊對(duì)對(duì)接過(guò)程中涉及的蛋白活性殘基進(jìn)行分析。對(duì)接受體準(zhǔn)備：采用北京創(chuàng)騰科技有限公司的Discovery Studio(DS) 客戶(hù)端 (2.5版) 顯示ST (2wnb) 的三維結(jié)構(gòu)信息，去水加氫后發(fā)現(xiàn)其中有兩個(gè)底物配體，配體1為胞苷單磷酸，配體2由CG31345、A2G1346、Gal1347三個(gè)殘基組成。保留配體1，刪除配體2，記下配體1的空間位置參數(shù) (x=23.926 9，y=31.865 3，z=34.235 1)，保存蛋白文件。對(duì)配體2操作如上，得到配體2位置空腔參數(shù)：x=34.034 286，y=23.860 486，z=40.470 714。在A(yíng)utodockTool-1.5.6中打開(kāi)保存的蛋白文件，定義原子類(lèi)型為AD4并加casteiger電荷，然后將兩文件保存為pdbqt格式，作為對(duì)接受體。對(duì)接配體準(zhǔn)備：Gen分子結(jié)構(gòu)用Chemoffice構(gòu)建，用Openbable轉(zhuǎn)換為mol2文件。對(duì)Gen分子進(jìn)行加氫和電荷處理時(shí)采用的是Autodock Tools工具，并將其原子格式設(shè)置為pdbqt文件。盒子大小設(shè)為size_x=30，size_y=30，size_z=30，選用“拉馬克遺傳算法”開(kāi)展對(duì)接構(gòu)象的搜索，最大對(duì)接構(gòu)象數(shù)目控制為9，對(duì)接完成后，根據(jù)打分函數(shù)值的綜合得分及其均方根偏差(Root mean square deviation，RMSD)值來(lái)評(píng)價(jià)和確定最佳的對(duì)接構(gòu)象。對(duì)接結(jié)果采用Ligplot+軟件來(lái)統(tǒng)計(jì)Gen與配體之間發(fā)生相互作用的氫鍵和氨基酸殘基數(shù)目[23,31]。

1.3.5 SYBYL-Surflex對(duì)接

采用Surflex-Dock(SFXC)-Geom模式進(jìn)行對(duì)接，采用加氫后刪除配體、水分子以及雜原子的方式對(duì)受體唾液酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行處理。在Tripos力場(chǎng)下，優(yōu)化唾液酸轉(zhuǎn)移酶的兩個(gè)配體，優(yōu)化的方法每步都采用最陡下降法，并加Casteiger- Huckel電荷處理，其余參數(shù)默認(rèn)。對(duì)接空腔以配體形式產(chǎn)生，分別提取配體1和配體2產(chǎn)生對(duì)接位點(diǎn)，在其周?chē)?.5 nm范圍半徑內(nèi)產(chǎn)生活性空腔。唾液酸轉(zhuǎn)移酶的兩配體的均方根偏差RMSD值最小值控制在0.5，對(duì)接構(gòu)象的數(shù)目控制在20種。采用SYBYL對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3.6 Gromacs動(dòng)力學(xué)模擬

在上述優(yōu)化對(duì)接結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取其中對(duì)接較好的復(fù)合物進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬。具體方法參考本團(tuán)隊(duì)探索的方法[31]，首先獲得目標(biāo)配體的限制勢(shì)文件及拓?fù)湮募?，即在A(yíng)MBER99-ILDN力場(chǎng)存在的條件下，以TIP3P三點(diǎn)水為模型，利用AmberTools 17中的GAFF力場(chǎng)進(jìn)行處理產(chǎn)生拓?fù)湮募欢拗苿?shì)文件是通過(guò)genrestr工具產(chǎn)生的，然后再以DPOSRES對(duì)位置進(jìn)行限制。盒子大小設(shè)為：邊界距離復(fù)合物文件大小為0.8 nm。向體系中加入抗衡離子以平衡電荷，能量最小優(yōu)化采用是最陡下降法，優(yōu)化500步，模擬步長(zhǎng)為0.01 ps。鄰居列表的生成選擇“cutoff-scheme=Verlet”，靜電作用選擇coulomb type，非鍵相互作用采用PME截?cái)喾绞?。使用LINCS算法對(duì)鍵進(jìn)行約束，每50步輸出一次能量信息，控溫和控壓的時(shí)間為100 ps，進(jìn)行限制性動(dòng)力學(xué)模擬，使體系達(dá)到平衡，熱浴設(shè)定為 velocity-rescale，平衡溫度控制為147.86 ℃ ，時(shí)長(zhǎng)為0.2 ps。壓浴設(shè)定為Berendsen，采用各項(xiàng)同性控壓，控壓時(shí)間設(shè)為0.5 ps，動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中僅約束氫鍵，且每采用最陡下降法優(yōu)化一次并輸入一次能量信息，而每?jī)?yōu)化兩次的時(shí)候輸出一次坐標(biāo)信息。限制性動(dòng)力學(xué)完成后，對(duì)ST和Gen進(jìn)行索引的設(shè)置并對(duì)其進(jìn)行分組，進(jìn)行200 ns的常規(guī)動(dòng)力學(xué)模擬；即每步為0.002 ps，每1 000步輸出一次能量信息。

模擬達(dá)到平衡后，在180–200 ns范圍內(nèi)，基于分子力學(xué)泊松-波爾茲曼表面積 (MM-PBSA)法對(duì)配體和蛋白結(jié)合自由能△Gbind進(jìn)行計(jì)算。受體和配體間的親和力與△Gbind值成反比，即△Gbind值越低，受體與配體間的親和力越好。

MM-PBSA法計(jì)算自由能主要包括以下4個(gè)過(guò)程：

式中，Gcomplex是總的自由能、Gligand為配體獨(dú)立的自由能、Gprotein為溶劑中蛋白獨(dú)立自由能。其中，Gligand和Gprotein由公式 (2) 計(jì)算：

式中，Gx代表復(fù)合物；EMM是分子力學(xué)能；TS是熵變對(duì)自由能的貢獻(xiàn)值；由于構(gòu)象熵對(duì)本文變化影響不大，故TS一般設(shè)置為0；Gsolvation為溶劑化能。EMM由公式 (3)計(jì)算，而Gsolvation則由公式 (4) 計(jì)算：

其中，Ebond代表成鍵作用，Enobonded為非鍵作用力。Gpolar由波茲曼方程計(jì)算；Gnonpolar通過(guò)SASA模型、SAV和WCA模型計(jì)算。

1.3.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

稱(chēng)取Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品0.032 5 g，并加入100 mL超純水溶解標(biāo)準(zhǔn)品，將其配置成1 mol/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取50、100、200、300、400 μL的標(biāo)準(zhǔn)溶液和850、800、700、600、500 μL的超純水及加入100 μL的DMB衍生液中 (表1)，充分振蕩混勻后，進(jìn)行避光衍生2.5 h，用HPLC檢測(cè)。每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品均進(jìn)樣3次，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，以峰面積的平均值為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程[1,21]。

1.3.8 Neu5Gc含量降低百分比計(jì)算

樣品中Neu5Gc含量降低百分比按式 (5)進(jìn)行計(jì)算：

式中，C0表示對(duì)照組中Neu5Gc含量，C1表示Gen組樣品中Neu5Gc的含量。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理分析方法

數(shù)據(jù)以±s表示，用IBM SPSS Statistics進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩樣本均采用t檢驗(yàn)，根據(jù)清華大學(xué)出版社出版的張永愛(ài)主編的醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析教材，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，涉及的圖形用OriginPro 2016平臺(tái)完成。

表1 不同濃度Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)溶液配制[1]Table 1 Preparation of Neu5Gc standard solutions of different concentrations[11]

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)照組中Neu5Gc及Neu5Gc標(biāo)品的HPLC檢測(cè)圖譜

將對(duì)照組樣品按照“1.3.2和1.3.3”方法處理，按照“1.3.4”色譜條件進(jìn)行3次分析，測(cè)得50 μmol/L Neu5Gc標(biāo)品的保留時(shí)間為10.080 min (圖2A)，對(duì)照組中后腿肌肉組織中Neu5Gc保留時(shí)間為10.077 min (圖2B)，肝臟組織中Neu5Gc保留時(shí)間為10.187 min (圖2C)，腎臟組織中Neu5Gc保留時(shí)間為10.158 min (圖2D)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程

所得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=0.299 51x+33.812 2，R2=0.993 7，表明標(biāo)準(zhǔn)品在50–400 μmol/L濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度具有較好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.3 Gen對(duì)大鼠后腿肌肉中Neu5Gc的影響

圖2 50 μmol/L的Neu5Gc標(biāo)品 (A)、對(duì)照組后腿肌肉組織中Neu5Gc (B)、肝臟組織中Neu5Gc (C)和腎臟組織中Neu5Gc (D)的HPLC圖Fig.2 The HPLC chromatograms of the 50 μmol/L Neu5Gc standard (A),the hind leg muscle tissue (B),the liver tissue (C) and the kidney tissue (D) of the control group.

圖3 Gen對(duì)大鼠后腿肌肉組織中Neu5Gc含量的影響Fig.3 Effect of genistein on the content of Neu5Gc in rats hind legs muscle tissues.* P<0.05;** P<0.01.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示灌胃15、45、60 d Gen組Neu5Gc含量均低于對(duì)照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05) (圖3)，各組不同灌胃時(shí)間Neu5Gc的含量如表2所示。灌胃15 d時(shí)，Gen組Neu5Gc的含量比對(duì)照組顯著降低，對(duì)照組中Neu5Gc的含量與Gen組中Neu5Gc的含量之間的差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)，但Neu5Gc的含量?jī)H降低了2.50 μg/g，而這一降低值在生物學(xué)上實(shí)際意義不明顯。灌胃30 d時(shí)，用HPLC-FLD法檢測(cè)時(shí)系統(tǒng)未對(duì)其進(jìn)行積分，說(shuō)明在此灌胃時(shí)間段內(nèi)，大鼠后腿肌肉中Neu5Gc的含量很低，以至于未檢出，由此可以推測(cè)Gen在灌胃30 d抑制Neu5Gc的合成效果最好。灌胃45 d時(shí)，Gen組中Neu5Gc的含量降低了32.65%，對(duì)照組中Neu5Gc的含量與Gen組中Neu5Gc的含量之間差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)，Neu5Gc的含量降低了8.18 μg/g，在生物學(xué)上實(shí)際意義明顯。灌胃60 d時(shí)，Gen組中Neu5Gc的含量降低了12.72%，對(duì)照組中Neu5Gc的含量與Gen組中Neu5Gc的含量之間差異具有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)，Neu5Gc的含量降低1.8 μg/g，而這一降低值在生物學(xué)上實(shí)際意義不明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在對(duì)照組中，在灌胃15–45 d時(shí)間段內(nèi)，Neu5Gc的含量在逐漸增大，而在45–60 d時(shí)間段內(nèi)，Neu5Gc含量在降低。造成這種結(jié)果的原因可能是：1) 大鼠本身的差異，在飼養(yǎng)過(guò)程中，這一組大鼠個(gè)體大小差異較大；2) 隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠個(gè)體增大，而排泄物的量也隨著增加，另有文獻(xiàn)報(bào)道[15]游離態(tài)的Neu5Gc在體內(nèi)快速隨著體液排出，所以隨著排泄物的增加而游離態(tài)的Neu5Gc排出量增加，導(dǎo)致結(jié)合態(tài)的Neu5Gc合成減少，所以導(dǎo)致大鼠肌肉組織中Neu5Gc的含量減少。Gen組，Neu5Gc的含量與對(duì)照組有相似的變化趨勢(shì)，除了上述對(duì)照組存在的原因外，還有一種可能是Gen在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)生生理活性時(shí)具有劑量依賴(lài)性[27,32]，隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠體內(nèi)蓄積Gen的量增多，增強(qiáng)了對(duì)Neu5Gc合成的影響。

2.4 Gen對(duì)大鼠肝臟中Neu5Gc的影響

由圖4可知，各時(shí)間段實(shí)驗(yàn)組肝臟組織中Neu5Gc的含量均低于對(duì)照組，各組在不同灌胃時(shí)間內(nèi)Neu5Gc的含量如表3所示。

灌胃15 d時(shí)，Gen組中Neu5Gc的含量與對(duì)照組相比顯著降低，Gen組中Neu5Gc含量降低了15.45%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Gen組中Neu5Gc的含量降低了4.57 μg/g，而這一降低值在生物學(xué)上實(shí)際意義不明顯。灌胃30 d時(shí)，Gen組中Neu5Gc的含量與對(duì)照組相比顯著降低，Gen組中Neu5Gc含量降低了13.35%，Gen組中Neu5Gc含量降低了4.07 μg/g，而這一降低值在生物學(xué)上的實(shí)際意義不明顯。灌胃45 d時(shí)，Gen組Neu5Gc的含量與對(duì)照組相比顯著降低，Gen組中Neu5Gc的含量降低了16.80%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異具有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，Neu5Gc的含量降低了4.41 μg/g，而這一降低值在生物學(xué)上差異性實(shí)際意義不明顯。灌胃60 d時(shí)，Gen組中Neu5Gc含量降低了12.30%，對(duì)照組中Neu5Gc的含量與Gen組中Neu5Gc的含量之間差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)，Neu5Gc的含量降低了4.06 μg/g，而這一降低值在生物學(xué)上的實(shí)際意義不明顯。整個(gè)飼養(yǎng)階段，在45 d時(shí)，對(duì)照組和Gen組中Neu5Gc的含量最低，Neu5Gc的含量降低值最高。然而，隨著灌胃時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，Neu5Gc的含量開(kāi)始升高，60 d時(shí)，對(duì)照組和Gen組中Neu5Gc的含量達(dá)到最高。

2.5 Gen對(duì)大鼠腎臟中Neu5Gc的影響

由圖5可知，各時(shí)間段Gen組腎臟組織中Neu5Gc的含量均略低于對(duì)照組，但是15 d和30 d時(shí)經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，差異不顯著(P>0.05)，而灌胃45 d時(shí)，Gen組Neu5Gc的含量與對(duì)照組相比顯著降低，Gen組中Neu5Gc的含量降低了32.78%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異具有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，Gen組Neu5Gc的含量降低了49.00 μg/g，在生物學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。灌胃60 d時(shí)，Gen組Neu5Gc的含量與對(duì)照組相比顯著降低，Gen組中Neu5Gc的含量降低了11.42%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異具有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)，Gen組Neu5Gc的含量降低了17.53 μg/g，在生物學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)都具有實(shí)際意義。這一結(jié)果與肌肉和肝臟組織存在一定的差異。在本實(shí)驗(yàn)中Gen對(duì)肌肉和肝臟組織中Neu5Gc的含量影響較肝臟明顯，這可能與Gen在腎臟組織中存在的代謝機(jī)制與其在肌肉和肝臟組織中不同有關(guān)[29]。

表2 不同灌胃時(shí)間內(nèi)肌肉組織中Neu5Gc含量Table 2 Neu5Gc content in muscle tissue during gastric perfusion time

表3 不同飼養(yǎng)時(shí)間肝臟組織中Neu5Gc含量Table 3 Neu5Gc content in livers tissuese during gastric perfusion time

圖4 Gen對(duì)大鼠肝臟組織中Neu5Gc含量的影響Fig.4 Effect of genistein on the content of Neu5Gc in rat livers tissues.* P<0.05;** P<0.01.

圖5 Gen對(duì)大鼠腎臟組織中Neu5Gc含量的影響Fig.5 Effect of genistein on the content of Neu5Gc in rat kidneys tissues.* P<0.05;** P<0.01.

表4 不同飼養(yǎng)時(shí)間腎臟組織中Neu5Gc含量Table 4 Neu5Gc content in kidneys tissues tissuese during gastric perfusion time

2.6 ST與Gen分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)結(jié)果分析

已知對(duì)接受體ST晶體結(jié)構(gòu)解析得到的活性位點(diǎn)殘基為：Gln108、Asn150、Met172、Asn173、Tyr194、Clu196、Phe212、Tyr233、Arg269、Thr272、Gly273、Gly293、Trp300、His302、Val318、His319[33-34]。

ST和Gen在配體1和配體2位置進(jìn)行AutoDock vina對(duì)接后，打分最高的對(duì)接構(gòu)象其結(jié)合能均為-35.564 kJ/mol，僅從結(jié)合能無(wú)法判定最佳結(jié)合位置，故繼續(xù)進(jìn)行相互作用殘基分析和SYBYL-Surflex對(duì)接分析。

圖6A為Gen與ST在配體1位置完成Auto Dock vina對(duì)接后的二維相互作用模式圖。由圖可知，ST和Gen產(chǎn)生氫鍵的殘基是Asn150、Ser151、Gly291、Glu324，共產(chǎn)生了4個(gè)氫鍵。產(chǎn)生疏水相互作用的殘基為：His302、His301、Trp300、Ile274、Phe292、Ser271、Thr328、Ser325。圖6B為Gen與ST在配體1位置SYBYL-Surflex對(duì)接后相互作用示意圖，可發(fā)現(xiàn)Gen和ST殘基Asn173、Asn150、Gly293、Glu324、Ser271產(chǎn)生氫鍵，數(shù)目為5個(gè)。對(duì)比ST在配體1處的活性殘基，Gen與其中的殘基Asn150、Asn173、Gly273、Gly293產(chǎn)生了氫鍵作用，并且和殘基Trp300、His302產(chǎn)生了疏水相互作用。綜合以上分析，Gen在ST配體1處占據(jù)了ST中7個(gè)活性殘基的6個(gè)，且和配體2處的活性殘基沒(méi)有相互作用，表明Gen在配體1處結(jié)合作用較強(qiáng)。

圖6 ST配體1與Gen對(duì)接模式圖Fig.6 Binding mode of sialyltransferase ligand 1 with genistein by docking.(A) A two-dimensional analysis of genistein and ST after docking Auto Dock vina at the position of ligand 1.(B) A schematic diagram of the interaction between genistein and SYBYL-Surflex at the position of ligand 1.

圖7 ST配體2與Gen對(duì)接模式圖Fig.7 Binding mode of sialyltransferase ligand 2 with genistein by docking.(A) A two-dimensional interaction analysis diagram of genistein and ST after docking with Auto Dock vina at the position of ligand 2.(B) A schematic diagram of the interaction between genistein and SYBYL-Surflex at the position of ligand 2.

圖7A為Gen與ST在配體2位置與Auto Dock vina對(duì)接后的二維相互作用模式圖。在配體2處，ST和Gen產(chǎn)生氫鍵的殘基是Asn150、Ser151、Glu324、Gly291，共產(chǎn)生了4個(gè)氫鍵。產(chǎn)生疏水相互作用的殘基是His302、Trp300、Ser325、Phe292、Ile274、Thr328、Ser271共7個(gè)殘基。圖7B為Gen與ST在配體2位置SYBYL-Surflex對(duì)接后相互作用示意圖，由圖可知僅和殘基Tyr233、Thr272、Gly273產(chǎn)生氫鍵。綜合以上分析，可知Gen在ST配體2處和ST活性殘基Thr272、Tyr233產(chǎn)生氫鍵，而在配體1處不僅與ST活性殘基Asn150、Gly273產(chǎn)生氫鍵，還和活性殘基Trp300、His302產(chǎn)生疏水相互作用，因此Gen更易與ST配體1位點(diǎn)產(chǎn)生相互作用。

對(duì)Gen與ST在配體1處AutoDock vina對(duì)接后最佳復(fù)合物進(jìn)行水環(huán)境下200 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬，分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程一般以均方根偏差RMSD來(lái)衡量體系的穩(wěn)定性[34]；從模擬結(jié)果可知，ST和ST-Genistein復(fù)合物的RMSD值在70 000–130 000 ns時(shí)趨于平衡并收斂于0.25 nm附近，表明體系模擬過(guò)程中較為穩(wěn)定。

圖8 ST-Genistein動(dòng)力學(xué)平衡后結(jié)合模式圖Fig.8 ST-Genistein binding mode diagram at MD equilibrium position.

圖8為動(dòng)力學(xué)模擬平衡時(shí)ST和Gen結(jié)合模式圖。氫鍵是維持底物和配體穩(wěn)定結(jié)合的重要分子間作用力[34]。從圖8可以看出，動(dòng)力學(xué)平衡后Gen主要和ST殘基His319、Thr328、Gly293、Ser151產(chǎn)生4個(gè)氫鍵。對(duì)比Gen在配體1處與STAutoDock vina和SYBYL-Surflex對(duì)接揭示的可能相互作用殘基結(jié)果，發(fā)現(xiàn)殘基Ser151和Gly293與對(duì)接分析結(jié)果一致。這表明Ser151和Gly293在復(fù)合物體系穩(wěn)定性中可能有重要貢獻(xiàn)。

通過(guò)g_mmpbsa工具對(duì)動(dòng)力學(xué)平衡后Gen與ST的結(jié)合能進(jìn)行計(jì)算分解，結(jié)果顯示：總結(jié)合能為-82.691 kJ/mol；對(duì)結(jié)合過(guò)程起促進(jìn)作用的是范德華力 (-155.167 kJ/mol)、靜電作用力(-62.223 kJ/mol) 和溶劑可積表面作用力(-14.502 kJ/mol)；對(duì)結(jié)合過(guò)程起抑制作用的是極性溶劑化能 (149.201 kJ/mol)。

圖9 ST-Genistein結(jié)合位點(diǎn)殘基能量分解圖Fig.9 ST-Genistein binding residue energy decomposition map.

圖9為ST-Genistein在動(dòng)力學(xué)模擬相互結(jié)合過(guò)程中重要氨基酸殘基的能量貢獻(xiàn)。從圖9可知，ST中與Gen產(chǎn)生氫鍵作用的殘基Asn150、Ser151和Glu324主要貢獻(xiàn)了靜電相互能，與Gen產(chǎn)生疏水作用的殘基Phe292、His302、Thr328、His319、Trp300和Ile274主要貢獻(xiàn)了極性作用力，這和對(duì)接分析的結(jié)果是一致的，表明分子間弱相互作用主導(dǎo)了Gen對(duì)ST活性抑制的機(jī)制。

3 討論

3.1 Gen對(duì)大鼠不同部位Neu5Gc的合成具有不同抑制效果

Neu5Gc在哺乳動(dòng)物體內(nèi)主要是以α2→8與寡糖連接和以α2→5與寡糖連接，形成結(jié)合態(tài)的Neu5Gc，極小部分以游離的形式存在[14]。而HPLC-FLD法能直接檢測(cè)游離態(tài)的Neu5Gc，但是不能直接檢測(cè)與糖蛋白和糖脂連接的結(jié)合態(tài)的Neu5Gc，因此，檢測(cè)組織中總的Neu5Gc含量時(shí)，需將Neu5Gc從糖復(fù)合物上釋放出來(lái)。結(jié)合先前的研究[1,8]，本研究選擇2 mol/L的醋酸在80 ℃水浴3 h進(jìn)行酸解，使各組織中結(jié)合態(tài)的Neu5Gc解離為游離態(tài)的Neu5Gc，然后用HPLC-FLD檢測(cè)組織中游離態(tài)和結(jié)合態(tài)Neu5Gc總的含量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Gen對(duì)大鼠不同組織中Neu5Gc的含量具有不同的影響效果，并且不同灌胃時(shí)長(zhǎng)的影響效果不一樣；在肌肉組織中，灌胃時(shí)間段內(nèi)，Gen組Neu5Gc含量與對(duì)照組相比降低極顯著 (P<0.05)，且灌胃30 d時(shí)，后腿肌肉組織中未檢測(cè)到Neu5Gc，可能的原因是后腿肌肉中Neu5Gc量很少，達(dá)不到HPLC最低檢測(cè)限，或是根本不存在Neu5Gc，但是進(jìn)一步的依據(jù)還需后續(xù)大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)；而在肝臟組織中，整個(gè)灌胃時(shí)間內(nèi)，Gen組Neu5Gc的含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，且在灌胃45 d時(shí)，Gen對(duì)肝臟組織的中Neu5Gc的含量影響最明顯，Neu5Gc的含量降低了16.80%，體內(nèi)Neu5Gc的含量也最低，若灌胃時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，Neu5Gc的含量開(kāi)始升高，60 d時(shí)，對(duì)照組和Gen組中Neu5Gc的含量達(dá)到最高；在腎臟組織中，直到灌胃45 d時(shí)，Gen組中Neu5Gc的含量才顯著低于對(duì)照組 (P<0.01)，Gen組中Neu5Gc的含量降低了32.78%。Gen對(duì)不同部位Neu5Gc的含量影響效果不一樣，這主要是因?yàn)椋?) 由于Gen具有雌激素活性和抗雌激素活性，當(dāng)它與雌二醇受體結(jié)合時(shí)，動(dòng)物的生理狀態(tài)、給藥途徑、局部濃度以及內(nèi)源性雌激素水平等均影響生物學(xué)功能[29,35]；2) Gen在哺乳動(dòng)物中存在著不同的代謝機(jī)制；3) 哺乳動(dòng)物不同身體部位對(duì)Gen的吸收和代謝速率也不同[32,35]。

3.2 Gen對(duì)Neu5Gc含量降低的機(jī)制探討

Neu5Gc的生物合成涉及CMAH和ST，其中ST是結(jié)合態(tài)Neu5Gc合成的關(guān)鍵酶[34]，故抑制ST的活性是降低對(duì)促炎起主要貢獻(xiàn)的結(jié)合態(tài)Neu5Gc含量的關(guān)鍵。

分子對(duì)接研究結(jié)果表明：Gen在大鼠體內(nèi)占據(jù)ST活性位點(diǎn)His319、Ser151、Gly293、Thr328，并與其形成穩(wěn)定的氫鍵，與殘基His302、His301、Trp300、Ser271、Phe292、Thr328、Ser325、Ile274形成疏水相互作用，從而競(jìng)爭(zhēng)性地降低了ST的活性，表明Gen在動(dòng)物體內(nèi)降低Neu5Gc的生物合成可以通過(guò)抑制ST的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)。有研究報(bào)道[36-37]Gen可作為酪氨酸蛋白激酶抑制劑，通過(guò)去極化內(nèi)皮超氧化物產(chǎn)生刺激物，抑制磷酸化的G蛋白R(shí)ac膜移位，達(dá)到抑制胞內(nèi)還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶的活性的目的，而Neu5Gc的合成需要還原型輔酶Ⅱ(NADPH)或NADH及Fe2+，所以使Neu5Gc的生物合成受到限制，從而達(dá)到降低大鼠體內(nèi)肌肉和內(nèi)臟組織中Neu5Gc含量的目的。

4 結(jié)論

本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了Gen具有降低大鼠后腿肌肉、腎臟組織、肝臟組織中Neu5Gc的含量的效果。在不同的灌胃時(shí)間和不同的組織器官中，Gen對(duì)Neu5Gc含量的影響存在差異。在肌肉組織中，灌胃30 d時(shí)抑制效果最好，未能檢出Neu5Gc；在腎臟和肝臟組織中灌胃至45 d時(shí)抑制效果最好，其N(xiāo)eu5Gc的含量分別降低了31.04%和21.66%；且內(nèi)臟組織中Neu5Gc的含量都高于肌肉組織中的含量。

分子對(duì)接結(jié)果反映Gen在生物體內(nèi)抑制Neu5Gc生物合成的機(jī)制如下：4個(gè)氨基酸殘基(His319、Ser151、Gly293、Thr328) 與Gen形成穩(wěn)定的氫鍵作用，8個(gè)氨基酸殘基 (His302、His301、Trp300、Ser271、Phe292、Thr328、Ser325、Ile274) 與Gen形成疏水相互作用，占據(jù)了結(jié)合態(tài)Neu5Gc生成關(guān)鍵酶ST與底物結(jié)合的活性位點(diǎn)，所以Gen是ST的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，通過(guò)與ST底物作用間接地抑制了ST的活性，從而限制了游離態(tài)Neu5Gc向結(jié)合態(tài)Neu5Gc的轉(zhuǎn)化，最終達(dá)到降低Neu5Gc生物合成的目的。本實(shí)驗(yàn)方法和所獲數(shù)據(jù)對(duì)采用飼養(yǎng)方式降低紅肉類(lèi)動(dòng)物中Neu5Gc的含量具有指導(dǎo)意義。