豬miR-331-3p過表達載體的構建及其對細胞增殖的影響

陳濤，馬立霞，崔景香，耿進紅，曾勇慶，陳偉

1 山東農業(yè)大學 動物科技學院，山東 泰安 271018

2 山東農業(yè)大學 山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗室，山東 泰安 271018

3 濰坊科技學院，山東 濰坊 262700

miRNA是長度為18–24 nt的短序列的單鏈非編碼RNA，在進化上具有高度的保守性，主要通過調控基因表達的水平起作用。許多研究已表明，miRNA主要通過與靶基因的3? UTR互補配對，引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻譯[1]，實現(xiàn)對基因表達水平的調控，從而參與細胞的增殖、分化、凋亡和代謝等許多生物學過程[2-3]。

miR-331-3p是一種在各種物種中高度保守的miRNA，目前研究發(fā)現(xiàn)miR-331-3p在癌細胞的增殖分化以及癌癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[4]，在功能上具有多種作用。miR-331-3p可以靶向作用于細胞周期相關基因E2F1(E2F transcription factor 1)，具有抑制胃癌細胞生長和克隆的形成的能力[5]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-331-3p的受體lncRNA-HOTAIR參與調節(jié)人表皮生長因子受體 2 (Glutamyl-tRNA (Gln) amidotransferase subunit HER2，HER2)的去阻遏，并強化額外水平的轉錄后調控可降低HER2蛋白的表達，進而降低胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲[6]。ING5是一個腫瘤抑制基因，抑制細胞生長并且誘導細胞凋亡。miR-331-3p能夠通過抑制ING5表達促進肝癌(HCC) 細胞的增殖[7]。綜上所述，miR-331-3p一直被認為是一種腫瘤相關因子，本身的作用也具有多樣性，但這些研究都僅限于人類的癌癥細胞中，miR-331-3p對于其他物種或細胞的作用研究很少。

豬是人類重要的肉食來源，其自身生長受多種因素的影響。miRNA作為目前較熱門的研究領域，已經(jīng)有很多研究表明miRNA在豬生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，例如miR-1、miR-133和miR-206都是肌肉特異性的miRNA，在肌肉形成過程中起著關鍵作用[8]，但是miR-331-3p在豬細胞增殖方面的研究鮮有報道。豬腎上皮細胞系即PK15細胞，是一種常見的細胞系，對于豬圓環(huán)病毒 (PCV)、豬細小病毒 (PPV) 和豬瘟病毒(CSFV) 等多種病毒比較敏感，現(xiàn)已廣泛應用于豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒和豬細小病毒等的分離、體外培養(yǎng)以及相關疫苗的生產(chǎn)中，具有非常重要的作用[9]。因此，本研究選取PK15細胞作為研究對象，通過研究miR-331-3p對PK15細胞增殖的影響，為進一步探討miR-331-3p在豬生長發(fā)育中的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑

豬腎上皮細胞 (PK15)、pcDNA 3.1(+) 哺乳動物表達載體均由實驗室保存。萊蕪豬耳組織采于萊蕪豬原種場；DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM無血清培養(yǎng)基、PBS、0.25%胰酶、胎牛血清 (Fetal bovine serum，F(xiàn)BS) 均購于Gibco公司 (美國)；青鏈霉素混合液購于北京索萊寶科技有限公司(中國北京)；反轉錄和熒光定量試劑購于TaKaRa(中國大連)。CCK-8試劑盒購于碧云天生物技術有限公司 (中國上海)；微量RNA提取試劑盒購于Omega Bio-Tek (美國)；細胞周期與凋亡檢測試劑盒購于碧云天生物技術有限公司 (中國上海)；miR-331-3p inhibitor和miR-331-3p NC購于上海吉瑪制藥技術有限公司 (中國上海)；T4 DNA連接酶、KpnⅠ內切酶和XbaⅠ內切酶均購于Thermo Scientific (美國)；DNA提取試劑盒、質粒大提試劑盒和普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購于天根生化科技有限公司 (中國北京)；轉染試劑Lipofectamine?3000購于Invitrogen (美國)；實驗所用引物合成以及測序均由生工生物工程 (上海) 股份有限公司完成。實驗地點為山東農業(yè)大學動物育種學研究室。

1.2 培養(yǎng)基的配制

10%完全培養(yǎng)基：10%胎牛血清+100 IU/mL青鏈霉素+DMEM。5%完全培養(yǎng)基：5%胎牛血清+100 IU/mL青鏈霉素+DMEM。無雙抗培養(yǎng)基：10%胎牛血清+DMEM。

1.3 方法

1.3.1 miR-331-3p過表達載體的構建

首先利用Primer 5.0設計包含miR-331-3p前體序列的上下游引物，分別在其5?端添加KpnⅠ內切酶和XbaⅠ內切酶的酶切位點以及2 bp的保護堿基AA (表1)[10]。然后提取萊蕪豬耳組織的基因組，以DNA為模板通過普通PCR擴增的方式獲得目的片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)純化回收。最后將目的片段和載體同時酶切、瓊脂糖凝膠電泳分離、純化回收、T4 DNA酶連接構建到pcDNA 3.1(+) 載體上。

1.3.2 細胞培養(yǎng)

PK15細胞培養(yǎng)使用完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)在CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為5% CO2、37 ℃。當細胞密度大于80%，換用無雙抗培養(yǎng)基進行實驗。該實驗所用的所有細胞均處于對數(shù)生長期，細胞活性大于95%。

1.3.3 細胞轉染

將細胞接種到培養(yǎng)板上，生長到一定密度時，換用無雙抗培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。將實驗分為4組：1) 實驗組：轉染pcDNA3.1(+)-miR-331-3p載體；2) 實驗對照組：轉染pcDNA3.1(+)載體；3) 抑制劑組：轉染miR-331-3p inhibitor；4) 抑制劑對照組：轉染miR-331-3p NC。轉染步驟按照Lipofectamine?3000說明書操作，轉染4 h更換新的無雙抗的培養(yǎng)基，24 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集細胞。

1.3.4 繪制細胞生長曲線

將生長良好的PK15細胞1×104/mL的密度接種到96孔板，每孔加入100 μL 5%完全培養(yǎng)基。分別在第0 h、24 h、48 h、72 h和96 h，每孔加入10 μL CCK8試劑，37 ℃培養(yǎng)2 h，然后用酶標儀 (Promega，美國) 檢測細胞在450 nm下的OD值，計算平均值，并繪制實驗組、實驗對照組、抑制劑組和抑制劑對照組的生長曲線。

1.3.5 細胞RNA提取及熒光定量PCR

將PK15細胞接種到6孔板，待細胞匯合度達到80%時轉染細胞，48 h后提取細胞總RNA，然后反轉錄為cDNA。利用Primier 5.0設計CDK2、CDK3、CDK4、Cyclin B、ING5、CDKN1A和GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 基因的熒光定量引物 (表1)，其中GAPDH持家基因作為內參[11]。利用LightCycler?96實時熒光定量PCR系統(tǒng)，檢測過表達miR-331-3p后細胞周期相關基因的表達情況，其定量結果通過2-ΔΔCt的方法計算。反應體系 (20 μL) 為：2× TB Green Premix ExTaq10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 7.2 μL。

同樣，設計miR-331-3p的上游引物 (表1)，下游引物使用試劑盒內的通用下游引物，以U6作為內參基因[12]，引物使用miRNA反轉錄試劑盒內的U6上下游引物。同樣使用LightCycler?96實時熒光定量PCR系統(tǒng)，檢測miR-331-3p的表達變化。反應體系 (20 μL) 為：2× TB Green Premix ExTaq10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6.4 μL。

表1 實驗中用到的基因的引物序列Table 1 Primer sequences of genes used in this experiment

1.3.6 細胞周期檢測

將細胞接種到6孔板，待細胞匯合度達到30%左右時分別轉染實驗組、實驗對照組、抑制劑組和抑制劑對照組，當細胞密度達到80%–90%時，小心收集細胞培養(yǎng)液到1.5 mL離心管內備用。用胰酶消化細胞，至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時，加入前面收集的細胞培養(yǎng)液，終止胰酶消化過程，吹打下所有的貼壁細胞，并輕輕吹散細胞。再次收集到離心管內。300×g離心3 min去除培養(yǎng)基，再用1 mL預冷PBS洗1遍。然后進行細胞固定，加入1 mL冰浴預冷的70%乙醇中，4 ℃固定12 h，300×g離心去除70%乙醇，使用PBS再洗1遍。最后加入碘化丙啶染色液 (PI)，37 ℃避光水浴30 min，結束后錫箔紙包裹離心管放到冰盒上，經(jīng)0.75 μm濾膜過濾后使用BD FACSCalibur流式細胞儀上機檢測細胞所處周期的比例[13]。

1.3.7 實驗設計與數(shù)據(jù)處理

所有實驗均設置不少于3次重復，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差 (±s) 表示，采用SPSS 20統(tǒng)計分析軟件中的One-way ANOVA進行方差分析，通過Duncan氏方法進行多重比較，顯著性水平定為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 miR-331-3p過表達載體的構建

實驗所克隆的miR-331-3p前體大小為558 bp，并且以其為模板進行菌液PCR后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)擴增的目的片段與預期大小一致，且條帶單一、無雜帶 (圖1A)。提取質粒經(jīng)測序比對，結果與預期相符，無雜峰干擾 (圖1B)，所提取的質粒經(jīng)核酸蛋白濃度測定儀檢測質粒濃度高、質量好，可用于細胞轉染實驗。

2.2 miR-331-3p對細胞生長曲線的影響

經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，4組細胞的生長曲線均呈S型 (圖2)，符合體外細胞培養(yǎng)的生長特點。在轉染24 h后，實驗組細胞數(shù)顯著高于實驗對照組、抑制劑組和抑制劑對照組 (P<0.05)；但是實驗對照組、抑制劑組與抑制劑對照組之間差異均不顯著 (P>0.05)，可能是由于miR-331-3p抑制劑在24 h時作用效果不顯著，導致此時miR-331-3p的表達下調不顯著。在48 h和72 h時均呈現(xiàn)出實驗組>實驗對照組和抑制劑對照組>抑制劑組的趨勢 (P<0.05)，在96 h時實驗組、實驗對照組、抑制劑組和抑制劑對照組差異已不顯著。

圖1 菌液PCR擴增結果和pre-miR-331-3p測序分析Fig.1 Bacterial liquid PCR and pcDNA 3.1(+)-miR-331-3p sequencing map.(A) Agarose gel electrophoresis of bacterial PCR.(B) Sequencing map of pcDNA 3.1(+)-miR-331-3p.

2.3 miR-331-3p的表達差異分析

利用qPCR方法分別檢測實驗組、實驗對照組、抑制劑組和抑制劑對照組細胞在轉染48 h后miR-331-3p的表達差異。實驗組miR-331-3p的表達量顯著高于實驗對照組 (P<0.05)，這表明所構建的pcDNA3.1(+)-miR-331-3p載體在PK15細胞中能夠發(fā)揮作用，提高了細胞自身miR-331-3p的表達水平，效果良好。相反，抑制劑組miR-331-3p的表達水平相對于抑制劑對照組顯著下降 (P<0.05)，這表明miR-331-3p inhibitor確實可以達到抑制細胞本身的miR-331-3p表達的水平，符合實驗要求 (圖3)。

2.4 過表達miR-331-3p對細胞增殖相關基因的影響

為了探討miR-331-3p對細胞增殖的影響，利用RT-qPCR法檢測了miR-331-3p的靶基因ING5，以及周期相關基因CDK2、CDK3、CDK4、Cyclin B和CDKN1A的表達變化。結果表明，促進細胞增殖的CDK2、CDK3、CDK4和Cyclin B基因的mRNA表達趨勢均為實驗組>實驗對照組和抑制劑對照組>抑制劑組 (P<0.05) (圖4)；而具有抑制細胞增殖作用的CDKN1A和ING5基因的mRNA表達量具有相反的變化趨勢，即實驗組<實驗對照組和抑制劑對照組<抑制劑組 (P<0.05) (圖4)。

圖3 miR-331-3p表達變化分析Fig.3 Analysis of expression changes of miR-331-3p.Different lower-case letters denoted significant difference (P<0.05).

圖4 細胞增殖相關基因的表達變化分析Fig.4 Analysis of expression changes of cell proliferation related genes.Different lower-case letters of the same group denoted significant difference (P<0.05).

2.5 miR-331-3p對細胞周期的影響

PI染色后利用流式細胞儀檢測各組PK15細胞的周期分布，得到的實驗數(shù)據(jù)經(jīng)ModFit軟件分析后得到流式細胞圖 (圖5)。由圖可知各組中DNA合成前期(G0/G1期)的細胞所占比例，實驗組<實驗對照組和抑制劑對照組<抑制劑組(P<0.05)。各組中處于DNA合成期 (S期)的細胞所占比例，實驗組>實驗對照組和抑制劑對照組>抑制劑組 (P<0.05)。并且各組中處于DNA合成后期和分裂期 (G2/M期) 的細胞所占的比例也是實驗組>實驗對照組和抑制劑對照組>抑制劑組(P<0.05)，與細胞處于S期的比例具有相同趨勢。

圖5 流式細胞術分析細胞所處周期Fig.5 Flow cytometric analysis of the indicated cells.Different lower-case letters of the same group denoted significant difference (P<0.05).

3 討論

miRNA作為內源非編碼短鏈RNA，在細胞增殖、凋亡、分化等細胞過程中發(fā)揮著重要的作用。不同的miRNA可能發(fā)揮著相同或相反的作用，甚至同種miRNA在不同的細胞中也具有不同的作用。研究表明miR-331-3p作用機制復雜，在不同的癌細胞中可能發(fā)揮著完全相反的作用機制[14-16]。

過表達miR-331-3p后相對于實驗對照組和抑制劑對照組，流式細胞術結果表明G0/G1期細胞比例顯著降低，抑制劑組顯著升高，G0/G1期細胞所占比例降低說明細胞增殖速度加快，反之增殖速度減慢[17]。同時DNA合成期 (S期)，處于S期的細胞所占比例也顯著性升高，表明過表達miR-331-3p后促使大量細胞由G1期過渡到S期，S期細胞所占比例升高，DNA、組蛋白合成速度加快，組裝成染色體使細胞內染色體數(shù)目加倍為進入細胞分裂期做準備，抑制劑組結果相反。過表達miR-331-3p后在G0/G1期細胞所占比例降低S期細胞所占比例升高的基礎上，DNA合成后期 (G2期) 和細胞分裂期 (M期) 細胞所占比例也顯著地高于實驗對照組、抑制劑組和抑制劑對照組。其中G2期是DNA復制結束與開始有絲分裂之間的間隙，在這期間細胞合成某些蛋白質和RNA分子，做好細胞進入M期的物質準備。M期為細胞分裂期，M期細胞所占比例升高直接說明了分裂期細胞增多，表明細胞生長分裂加速。所以處于G2/M期的細胞所占比例顯著升高(P<0.05)，表明了細胞此時增殖能力較強能夠快速大量分裂，使細胞數(shù)目增加。與其相反的是抑制劑組相對于其他分組均表現(xiàn)出細胞G2/M期所占比例下降，也從反面證明了這一點。因此流式細胞分析的結果表明miR-331-3p具有促進細胞增殖的效果，這與細胞增殖曲線實驗組增殖速度增快，抑制劑組增殖速度減慢相符合。

細胞周期蛋白依賴性激酶 (CDKs)，如CDK2、CDK3和CDK4已被公認為真核生物細胞生長和增殖的關鍵調控因子，這是哺乳動物細胞G1-S相變所必需的[18-19]。Cyclin B是細胞進入和退出細胞周期M期所必需的[20]。相反地，細胞CDKN1A的過度表達可能通過誘導細胞抑制細胞增殖周期阻滯，它是CDKs的抑制劑[21]。熒光定量表明實驗組隨著miR-331-3p表達升高顯著上調CDK2、CDK3和CDK4促進細胞周期由G1期到S期的轉變，促使處于S期的細胞所占比例顯著上調 (P<0.05)，同時上調Cyclin B基因的表達促進細胞周期由G2期進入M期，使實驗組處于G2/M期細胞的比例上調。隨著miR-331-3p的高表達，細胞內的CDKN1A基因表達下調，CDKN1A具有阻滯細胞增殖的作用。其表達下調從另一個方面表明，miR-331-3p具有促進細胞增殖的作用。綜合各個周期相關基因的熒光定量的表達結果說明，miR-331-3p具有促進細胞增殖的功能。有研究表明ING5為miR-331-3p的靶基因[7]，miR-331-3p的過表達和抑制表達導致ING5基因發(fā)生相應的下調和上調也證明了這一觀點，因此在豬腎上皮細胞中miR-331-3p有可能是通過作用于ING5基因達到促使細胞增殖的效果。

4 結論

本研究成功構建了miR-331-3p的過表達載體，并且發(fā)現(xiàn)miR-331-3p可以通過促進周期相關基因CDK2、CDK3、CDK4、Cyclin B基因的表達，以及抑制ING5和CDKN1A的表達，從而促進豬腎上皮細胞增殖，這為深入研究miR-331-3p在豬生長發(fā)育中的作用機制奠定了基礎。