糖尿病加重主動脈縮窄小鼠模型心力衰竭的研究

郝文靜 李玉琳 喬博康 張聰聰 杜杰

心力衰竭（heart failure HF，）是由于心臟結(jié)構(gòu)和（或）功能異常，導(dǎo)致心室充盈或射血能力受損的一種復(fù)雜綜合征的臨床綜合征[1-2]。盡管藥物治療、外科手術(shù)以及介入技術(shù)的水平都大大提高，但心力衰竭仍是全球發(fā)病率、死亡率很高的疾病。究其原因一方面是由于目前對心力衰竭發(fā)病機(jī)制的研究還不是十分透徹，另一方面是導(dǎo)致心力衰竭發(fā)生的因素多種多樣[3]。心力衰竭也是很多疾病發(fā)生發(fā)展的終末死亡原因。大規(guī)模流行病學(xué)研究表明糖尿病會使心血管疾病的危險性顯著上升，不僅會增加心血管疾病的發(fā)病率與病死率，也增加了總死亡率[4-5]。然而糖尿病加重心力衰竭的研究尚不完善，本研究通過以自發(fā)性2型糖尿病模型dbdb小鼠復(fù)制主動脈縮窄模型，旨在觀察糖尿病對心功能衰竭的促進(jìn)作用研究。

材料與方法

1.材料和主要試劑 雄性7周齡C57BL/6 J小鼠15只，無特定病原體（SPF）級，體質(zhì)量23～25 g，由華阜康生物科技股份有限公司提供，在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心所屬的SPF級動物房飼養(yǎng)。雄性7周齡dbdb糖尿病小鼠15只，無特定病原體（SPF）級，體質(zhì)量在20～25 g之間，由南京動物研究所提供，在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心所屬的SPF級動物房飼養(yǎng)。蘇木素（中國Mayer公司）伊紅（中國Mayer公司）Vivid小動物超聲心動儀（英國GE Healthcare公司）。

2.方法 將實(shí)驗(yàn)動物分為四組。野生型（WT）假手術(shù)組（A組），糖尿病模型（dbdb）小鼠假手術(shù)組（B組），WT+主動脈縮窄術(shù)（TAC）組（C組）；及dbdb老鼠+主動脈縮窄術(shù)（TAC）組（D組）。構(gòu)建兩組小鼠主動脈縮窄術(shù)模型：手術(shù)器械高壓滅菌，手術(shù)臺面依次用乙醇消毒，小鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥后，小鼠頸部至劍突、倆側(cè)上肢間胸部皮膚經(jīng)脫毛備皮，小鼠仰臥位，四肢經(jīng)醫(yī)用膠帶固定于手術(shù)操作板上，從頸部開一個越3～4 cm的縱行切口，用粗的彎鑷剝開甲狀腺，然后用精細(xì)直鑷剝離暴露氣管，沿氣管正中剪開胸骨，在顯微鏡下找到胸腺用精細(xì)直鑷分離胸腺暴露主動脈弓后，用針帶線把線穿過主動脈弓并在放置墊針的情況下接扎主動脈弓，撤掉墊針，然后關(guān)閉胸腔封皮即可。[6]在主動脈縮窄術(shù)（TAC術(shù)）后1周，超聲檢測胸主動脈流速水平，流速值平穩(wěn)于3 000以上，表示小鼠心力衰竭模型建立成功。

3.組織病理切片制備 小鼠在0.1%戊巴比妥鈉麻醉的情況下，使用肝素化0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行心臟灌注，直至將所有血液去除干凈后，剪下小鼠心臟組織，一部分在4%多聚甲醛中固定過夜，然后進(jìn)行脫水包埋制作石蠟切片。采用Masson法觀察四組小鼠心臟間質(zhì)中膠原的沉積，采用蘇木精一伊紅（HE）染色法和麥胚凝集素（WGA）染色法檢測四組小鼠心肌細(xì)胞肥厚面積。

4.心臟超聲的測定 應(yīng)用1%的戊巴比妥鈉（50 mg/kg）進(jìn)行腹腔注射麻醉；用脫毛膏將小鼠胸部的毛發(fā)脫去；將小鼠平躺固定；用連接好的探頭對動物開始掃描成像，并保存圖像；將所保存的圖像導(dǎo)入分析軟件中進(jìn)行分析，將算出的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計。

5.蛋白質(zhì)印跡法檢測AKT2的表達(dá) AKT2磷酸化及AKT2蛋白表達(dá)，每組各取4只小鼠于主動脈縮窄術(shù)（TAC）處理8周后，收取整個心臟組織，加入組織裂解液并用粉碎儀粉碎組織提取組織總蛋白。BCA法測定蛋白質(zhì)含量。每組取50μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移到A硝酸纖維素膜上，用5%的BSA封閉液封閉1～2 h，加入一抗（兔抗小鼠p-AKT2、AKT2、為1:1 000，GAPDH單克隆抗體1:1 000），4℃孵育過夜，TBST緩沖液（0.05%Tween20的TBST緩沖液）洗膜10 min×3次，以1:5 000稀釋HRP標(biāo)記的熒光二抗，室溫避光孵育1 h，常規(guī)洗膜，用Odyssey掃描儀掃膜儀掃描并進(jìn)行光密度值分析。

6.統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用GraphPad Prism7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，四組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.糖尿病模型及心力衰竭模型構(gòu)建成功 與野生WT組相比糖尿病模型dbdb小鼠組的血糖明顯升高（P＜0.01），表示糖尿病的模型成功，兩組小鼠在主動脈縮窄術(shù)后1周主動脈弓部血流的流速值均＞3 000，表示兩組小鼠心力衰竭模型建立成功（圖1）。

2.糖尿病對主動脈縮窄術(shù)誘導(dǎo)心力衰竭小鼠的心率和血壓無影響 心率和血壓也是影響心力衰竭的重要因素，A組和B組比較 主動脈縮窄術(shù)后0、8周小鼠的收縮壓、舒張壓及平均動脈壓均無顯著升高（均P＞0.05），兩組間心率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05，圖2）。

圖1 兩組小鼠的血糖及主動脈縮窄術(shù)后主動脈流速變化情況 A：兩組 兩組小鼠的血糖值；B：兩組小鼠術(shù)1周后的流速變化

3.糖尿病促進(jìn)主動脈縮窄術(shù)誘導(dǎo)心力衰竭小鼠心功能的惡化 糖尿病dbdb小鼠和對照WT小鼠行主動脈縮窄手術(shù)，術(shù)后0周、2w、4周、6w、8周超聲監(jiān)測小鼠的心功能變化顯示，術(shù)后4周反映心功能指標(biāo)的EF明顯降低，D組與C組比較，D組較C組降低更顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。光鏡下四組小鼠比較，假手術(shù)及主動脈縮窄術(shù)8周后的小鼠心臟組織切片及HE染色結(jié)果表明，HE染色紅色為心肌細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核深藍(lán)色，主動脈縮窄術(shù)8周后糖尿?。╠bdb）小鼠組心臟炎癥浸潤明顯加重。鏡下心臟組織的Masson染色結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，Masson染色后膠原纖維為藍(lán)色，C組和D組小鼠心臟均有表達(dá)，但D組心臟組織中膠原增加更明顯，心臟纖維化面積明顯大于C組小鼠[C組vs.D組：（4.07±0.37）%vs.（5.85±0.48）%，（P＜0.05）]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；A組與B組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義[A組vs.B組：[（0.95±0.13）%vs.（1.03±0.06）%，P＞0.05]，見圖3。

圖2 兩組小鼠主動脈縮窄術(shù)0周、8w后心率及血壓的變化 A：兩組小鼠術(shù)后心率的變化；B～D：兩組小鼠術(shù)后小鼠血壓的變化，注：與對照組相比，均P＞0.05

圖3 兩組小鼠在主動脈縮窄術(shù)后小鼠心功能變化情況 A～B：兩組小鼠不同時間點(diǎn)后心臟射血分?jǐn)?shù)及心功能超聲大體圖變化，C：兩組小鼠術(shù)后8周進(jìn)行石蠟切片和HE染色（×200），D～E：兩組小鼠小鼠心臟Masson染色圖以及Masson染色陽性面積 注：與對照組相比，*P＜0.05

圖4 兩組小鼠主動脈縮窄術(shù)后心臟肥厚的變化情況 A：兩組小鼠縮窄術(shù)不同時間點(diǎn)后心臟舒張末期直徑（LVID，s）的變化，B：兩組小鼠術(shù)后心臟體質(zhì)量比，C：兩組小鼠術(shù)后心臟大體圖，D～E：兩組小鼠術(shù)后心臟組織切片麥胚凝集素染色結(jié)果（×200）以及心肌細(xì)胞橫截面積，注：與對照組相比，*P＜0.05

圖5 Western blot檢測P-Akt2及Akt2表達(dá)水平 A：野生（wt）組；B：糖尿?。╠bdb）小鼠組；C：Western blot條帶灰度分析圖

4.糖尿病促進(jìn)主動脈縮窄術(shù)小鼠的心臟肥厚主動脈縮窄術(shù)4周后，心臟肥厚指標(biāo)左心室收縮末期直徑（LVID，s）明顯升高，D組與C組比較，D組較C組顯著升高，[C組vs.D組：（2.89±0.37）vs.（3.17±0.82），P＜0.05]，有統(tǒng)計學(xué)意義。主動脈縮窄術(shù)8周后，心臟體質(zhì)量比D較C組顯著升高[C組vs.D組：（4.37±0.67）vs.（6.12±0.32），P＜0.05]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，心臟大體圖比較發(fā)現(xiàn)D組較C組明顯增大。WGA染色細(xì)胞膜為亮綠色。主動脈縮窄術(shù)8周后，D組小鼠心肌細(xì)胞面積明顯增大，均大于野生C組小鼠[C組vs.D組：（151±21）vs.（223±17），P＜0.05]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；A組與B組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義[A組vs.B組：（103±6）vs.（135±3），P＞0.05]。

5.糖尿病對主動脈縮窄術(shù)后心力衰竭小鼠akt2表達(dá)的影響以往的研究發(fā)現(xiàn)akt2可以調(diào)節(jié)體內(nèi)葡萄糖的平衡及其缺失可以誘導(dǎo)心臟肥厚為了考察akt2是否參與了糖尿病對主動脈縮窄術(shù)后心力衰竭小鼠的影響作用 我們通過蛋白印記檢測研究表明，主動脈縮窄術(shù)0周及8周后，A組與B組比較發(fā)現(xiàn)，B組AKT2磷酸化及AKT2總蛋白表達(dá)水平較A組顯著降低。

討論

本研究用糖尿病小鼠構(gòu)建心力衰竭模型，闡明了糖尿病在主動脈縮窄術(shù)誘導(dǎo)小鼠心力衰竭中的作用，糖尿病小鼠可以加重心力衰竭小鼠的心功能（降低心臟射血分?jǐn)?shù)等心功能指數(shù)），但不影響心力衰竭小鼠的心率及血壓。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)糖尿病可以加重心力衰竭小鼠的心臟肥厚、炎癥細(xì)胞的浸潤，初步探討其機(jī)制可能是由于磷酸化AKT2的下調(diào)引起的。

既往有文獻(xiàn)報道糖尿病是心力衰竭的重要危險因素[7]，其所伴發(fā)的高血脂、代謝紊亂會對心血管系統(tǒng)造成不同程度的損害，最終導(dǎo)致患者心臟收縮與舒張功能障礙[8]。葡萄糖是心臟的主要能量來源，血糖異常升高對心臟產(chǎn)生重大影響，HbAlc水平每增加1%，心力衰竭的風(fēng)險增加8%[9-10]心力衰竭的發(fā)展也會促進(jìn)糖尿病的發(fā)生發(fā)展，故心力衰竭與糖尿病二者相互促進(jìn)、互為因果，從而加速病情進(jìn)展。既往研究表明，HF在糖尿病心血管并發(fā)癥中發(fā)生率及死亡率遠(yuǎn)高于心肌梗死、卒中、終末期腎病等嚴(yán)重并發(fā)癥，且糖尿病患者心力衰竭事件的發(fā)生率高于普通患者[11]。合并糖尿病的心力衰竭患者每年住院率比未合并者明顯增加（從24%～31%），同時糖尿病也增加了患者的死亡風(fēng)險。對于急性心力衰竭入院的患者，合并糖尿病者死亡率高于未合并者，且血糖水平增高增加患者早期死亡率[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，主動脈縮窄術(shù)8周后，dbdb小鼠的心臟射血分?jǐn)?shù)、縮短分?jǐn)?shù)明顯降低，心臟纖維化及炎癥浸潤面積明顯增加，心臟肥厚明顯加重。進(jìn)一步證明糖尿病對心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展起著不可忽視的作用。其次在糖尿病患者中，糖尿病神經(jīng)病變是最常見的慢性并發(fā)癥之一，其中心臟自主神經(jīng)病變發(fā)生心血管事件的幾率明顯增加，心率主要受自主神經(jīng)的調(diào)節(jié)[13]，但在本研究中2型糖尿病（dbdb）小鼠在主動脈縮窄術(shù)8周后心率沒有發(fā)生明顯變化，此結(jié)果可能是由于目前對dbdb小鼠在主動脈縮窄術(shù)后心臟自主神經(jīng)變化的研究尚不完善，因此關(guān)于自發(fā)性2型糖尿病模型dbdb小鼠復(fù)制主動脈縮窄模型對心率的具體影響作用還需進(jìn)一步研究。

糖尿病發(fā)心力衰竭的相關(guān)機(jī)制包括高血糖與葡萄糖毒性、高血脂與脂毒性、高胰島素血癥和胰島素對心肌的直接作用、線粒體功能異常、細(xì)胞間Ca2+穩(wěn)態(tài)異常、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的作用等。其中研究最廣泛的是是高血糖和葡萄糖毒性[14]。高血糖情況下可以促進(jìn)蛋白激酶B（AKT）的活性增強(qiáng)[15]。AKT2是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族之一，高表達(dá)在胰島素相關(guān)組織如脂肪組織、肝、骨骼肌組織，在胰島素反應(yīng)性組織中高度活化，且在胰島素刺激葡萄糖攝取中起關(guān)鍵作用[16]。AKT2可以調(diào)節(jié)葡萄糖體內(nèi)平衡并且AKT2缺陷可以導(dǎo)致胰島素抵抗及表現(xiàn)為糖尿病表型。本研究發(fā)現(xiàn)在主動脈縮窄術(shù)后的dbdb小鼠較WT小鼠的AKT2表達(dá)水平下調(diào)，這為糖尿病促進(jìn)小鼠心力衰竭的發(fā)生發(fā)展提供了新的研究方向。

綜上所述，本研究進(jìn)一步揭示了糖尿病對心力衰竭過程中心臟結(jié)構(gòu)和功能的作用，為糖尿病和心力衰竭的關(guān)系提供了進(jìn)一步的認(rèn)識，為臨床治療上提供更多的理論基礎(chǔ)，但是心力衰竭與糖尿病二者相互促進(jìn)的相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。