MIP-3α-SA雙功能融合蛋白的制備及其生物學功能鑒定

宋志純，戴數(shù)，王朋，高基民

（1.麗水市人民醫(yī)院 檢驗科，浙江 麗水 323000；2.溫州醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院 生命科學學院，浙江 溫州 325035）

惡性腫瘤嚴重威脅人類健康，我國每年新發(fā)腫瘤病例達430余萬例，死亡280多萬例[1]，腫瘤疫苗可誘發(fā)自身特異性免疫應答，抑制并清除腫瘤[2]，因特異性高、針對性強、不良反應小、安全穩(wěn)定，已經(jīng)成為惡性腫瘤治療的重要方法。通過基因修飾、細胞表面錨定修飾將細胞因子修飾到腫瘤細胞是腫瘤疫苗新的發(fā)展方向[3]。

巨噬細胞炎性蛋白3α（macrophage inflammatory protein-3α，MIP-3α）又稱CCL20，可參與樹突狀細胞、T細胞的定向遷移，在腫瘤免疫方面發(fā)揮作用[4]。它的轉基因細胞能誘導腫瘤特異性細胞免疫，抑制腫瘤生長、延長荷瘤小鼠的生存期[5]。另外，瘤內(nèi)直接注射MIP-3α可使DC和CD8+T細胞浸潤到腫瘤實質(zhì)內(nèi)，抑制腫瘤生長的作用顯著[6]。鏈親和素（streptavidin，SA）是由鏈霉菌分泌的四聚體蛋白，能與生物素快速緊密不可逆結合，其結合力比抗原抗體間的親和力高1萬倍，可應用于生物醫(yī)學的諸多領域[7]。

利用腫瘤細胞表面極易生物素化及SA能與生物素高效而超強結合的特性[8]，我們制備了SA標記的MIP-3α融合蛋白，使其錨定在已生物素化的腫瘤細胞表面，并產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫作用。基于人與鼠的氨基酸同源性為73%，而該腫瘤細胞疫苗的抗腫瘤效應需要在小鼠體內(nèi)進行檢測，為此我們構建了MIP-3α-SA-PET21重組表達載體，并在大腸桿菌內(nèi)高效誘導表達獲得融合蛋白，經(jīng)純化、復性后對其生物學活性進行了研究。該研究為MIP-3α表面錨定修飾的腫瘤細胞疫苗提供了實驗基礎，為后續(xù)的臨床實驗提供了依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細胞：E.coliRosetta（DE3）、DH5α購自北京Novagen公司，MIP-3α-SA-PET21質(zhì)粒及RM-1細胞由本實驗室保存。

1.1.2 試劑：IPTG及氨芐霉素、青鏈霉素、氯霉素購自美國Sigma公司，Sulfo-NHS-L C-Biotn購自美國Pierce公司，Ni-NTA螯合層析填料購自德國Qiagen公司，Transwell趨化小室購自美國Corning公司，抗-HIS單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG、FITC標記羊抗鼠IgG、DAB顯色試劑盒、硝酸纖維素膜均購自上海碧云天公司，胎牛血清及RPMI1640培養(yǎng)基購自杭州四季青生物工程材料有限公司，MIP-3α購自德國Bender公司，BSA購自瑞典Maverick公司，蛋白質(zhì)預染marker購自加拿大Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 MIP-3α-SA融合蛋白的誘導表達：感受態(tài)細胞制備及質(zhì)粒轉化按常規(guī)CaC12法，將MIP-3α-SAPET21質(zhì)粒轉化Rosetta（DE3）感受態(tài)細胞，用氨芐青霉素（終濃度50 mg/L）的平皿篩選轉化后的細菌。隨機挑選單克隆菌落，37 ℃于含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待OD600值=0.4～0.6時加入IPTG誘導，摸索最佳誘導濃度及時間，用12% SDS-PAGE篩選表達情況。

1.2.2 包涵體的提?。悍謩e用以下2種方法破碎包涵體并比較其效果：①菌體按1:20（w/v）重懸于超聲緩沖液（50 mmol/L Tris-HC1、1 mmol/L EDTA、10 mmol/L NaCl）中，冰浴并超聲破菌，收集包涵體；②菌體按1:20（w/v）重懸于PBS緩沖液（200 mg/mL溶菌酶）中，冰浴并高壓破菌，收集包涵體。用專用洗滌液（專利號CN1169998A）洗滌，離心棄去上清，收集包涵體。

1.2.3 MIP-3α-SA融合蛋白的純化：鎳柱親和層析純化：包涵體用溶解液（20 mmol/L Tris-HC1，8 mol/L尿素，5 mmol/L β-ME）溶解，離心棄去沉淀，過濾除菌后將上清液上樣于Ni-NTA柱，鎳柱用平衡液（20 mmol/L Tris-HC1，6 mol/L尿素，5 mmol/L β-ME，500 mmol/L NaC1）先平衡，上清用平衡液稀釋2倍上柱，然后依次用含50、75及150 mmol/L咪唑的平衡液洗脫，收集不同咪唑濃度洗脫峰，用12% SDS-PAG分析蛋白純化情況。

1.2.4 MIP-3α-SA融合蛋白的復性：將純化后的蛋白調(diào)整濃度至0.1～0.2 g/L，在透析液（20 mmol/L Tris-HC1，4 mol/L尿素，50 mmol/L NaC1，1 mmol/L GSH，0.2 mmol/L GSSG，50 mL/L甘油，0.5 mmol/L EDTA）中4 ℃透析復性12 h，依次降低透析液濃度，最后在PBS中繼續(xù)透析復性12 h。離心除去不溶物，上清經(jīng)過濾除菌，分裝于-70 ℃保存。10% SDSPAGE分析蛋白復性情況。

1.2.5 Western blot分析：用12% SDS-PAGE電泳分離復性后蛋白，半干電轉儀將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，用50 mL/L的脫脂奶粉于室溫下封閉1.5 h，加入抗-HIS單克隆抗體（mAb 1:1 000稀釋）4 ℃過夜，TBST洗滌，加入辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG二抗（1:1 000稀釋），37 ℃孵育1 h，DAB顯色液觀察結果。

1.2.6 銀氨染色：用12% SDS-PAGE電泳分離復性后蛋白，將整塊PAGE凝膠轉移至50%甲醛及10%醋酸混合液中浸泡1 h，脫色漂洗，用銀氨染色液（0.8 g 硝酸銀溶于4 mL蒸餾水中逐滴加入0.36% NaOH 21 mL于14.8 mmol/L氨水中）染色并洗滌液（0.5 mL 1%檸檬酸和50 μL 38%甲醛混合，加水至100 mL）中洗滌，待顯色后用1%醋酸終止反應并觀察結果。

1.2.7 MIP-3α-SA融合蛋白的趨化活性測定：①人淋巴細胞的準備：淋巴細胞分離液分離人血淋巴細胞，細胞濃度調(diào)整為2×106/mL重懸于無血清的1640培養(yǎng)基中備用；②MIP-3α-SA的準備：將-70 ℃保存的MIP-3α-SA用PBS分別稀釋為不同濃度（1 000 ng/mL、 100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL、0.1 ng/mL），PBS為空白對照；③加入MIP-3α-SA：將稀釋好后37 ℃預溫的MIP-3α-SA樣品加入Costar 3422微孔趨化板的下槽中，每個濃度MIP-3α-SA加3個復孔，每孔 600 μL，裝上上槽小室，MIP-3α做陽性對照；④加入人淋巴細胞：將稀釋好的人淋巴細胞懸液加入上槽小孔中，每孔100 μL；⑤孵育：將趨化小室放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，孵育3～4 h；⑥計數(shù)：將趨化小室下層細胞充分混勻，計數(shù)各孔細胞數(shù)并計算趨化指數(shù)（chemo tactic index，CI：是指細胞遷移到待測樣品液的數(shù)目和遷移到空白對照液的數(shù)目的比值）。CI=實驗組趨化的細胞數(shù)/陰性對照組趨化的細胞數(shù)。

1.2.8 MIP-3α-SA融合蛋白對腫瘤細胞表面錨定修飾效率的檢測：取生長狀態(tài)良好的RM-1細胞，調(diào)整細胞濃度至5×109/L，加入Sulfo-NHS-LC-Biotin使終濃度為1 g/L，37 ℃，30 min；PBS洗滌，加入MIP- 3α-SA，37 ℃，60 min；PBS洗滌，加入抗MIP-3α抗體，37 ℃，30 min；PBS洗滌，加入FITC標記的二抗，37 ℃，避光30 min；500 μL PBS重懸，流式細胞儀分析MIP-3α-SA融合蛋白對腫瘤細胞的錨定修飾效率。

2 結果

2.1 MIP-3α-SA融合蛋白的誘導表達 將MIP-3α-SAPET21重組表達質(zhì)粒轉入大腸桿菌Rosetta（DE3）中，經(jīng)IPTG篩選后獲得工程菌，經(jīng)12% SDS-PAGE電泳檢測證實在相對分子質(zhì)量31 kDa處有蛋白帶，與預測的目的蛋白相對分子質(zhì)量相符。而未經(jīng)誘導的工程菌在同一位置未見蛋白帶。BandScan軟件分析得出目的蛋白約占總蛋白的30%。表達菌破碎后（見圖1），分析上清或包涵體表達：證明目的蛋白主要以包涵體形式存在。分析不同濃度IPTG（見圖2A）和相同濃度IPTG不同時間（見圖2B）的誘導表達情況：證明IPTG終濃度0.3 mmol/L，誘導時間5 h為最佳。

圖1 12% SDS-PAGE鑒定MIP-3α-SA融合蛋白的誘導表達

圖2 12% SDS-PAGE鑒定MIP-3α-SA融合蛋白的表達情況

2.2 包涵體的提取及MIP-3α-SA融合蛋白的純化 比較2種方法進行包涵體的提取，鎳柱親和層析，12% SDS-PAGE鑒定結果顯示：加入溶菌酶后，掛柱效果佳（見圖3A-B），包涵體洗滌后經(jīng)過鎳柱親和層析，雜蛋白主要被穿透和50 mmol/L咪唑洗脫出，從峰值圖（見圖4）上可以看到目的蛋白在75 mmol/L咪唑濃度下被洗脫，且純度和濃度最高，其中純度達到95%以上（見圖5A-B）。

圖3 12% SDS-PAGE鑒定MIP-3α-SA融合蛋白純化情況

圖4 MIP-3α-SA融合蛋白鎳柱親和層析AKTA峰值圖

2.3 MIP-3α-SA融合蛋白的復性 采用尿素梯度透析復性，復性后非還原狀態(tài)的融合蛋白主要以多聚體的形式存在（見圖6A-B）。

2.4 MIP-3α-SA融合蛋白的Western blot分析和銀氨染色 Western blot結果證實，MIP-3α-SA融合蛋白純化后，復性后蛋白質(zhì)單體與多聚體均可與抗-HIS抗體結合，并顯色（見圖7A）；銀氨染色結果證實，第一泳道m(xù)arker條帶經(jīng)銀離子染色后顯示出多條雜帶，而目的蛋白復性后經(jīng)染色顯示為單一條帶（見圖7B）。

2.5 趨化活性測定 利用人淋巴細胞趨化實驗，發(fā)現(xiàn)不同濃度的MIP-3α-SA有趨化人血淋巴細胞的活性且成劑量依賴效應，其中100 ng/mL趨化活性最高，之后提高MIP-3α-SA融合蛋白濃度趨化活性反而減低（見表1和圖8）。

圖5 12% SDS-PAGE電泳鑒定MIP-3α-SA融合蛋白鎳柱親和層析純化圖

圖6 SDS-PAGE電泳鑒定MIP-3α-SA融合蛋白復性圖

圖7 MIP-3α-SA融合蛋白的Western blot分析（A）和銀氨染色（B）

2.6 FCM分析 用MIP-3α的抗體及熒光標記的二抗，經(jīng)FCM對錨定在已生物素化的RM-1腫瘤細胞表面的MIP-3α-SA融合蛋白進行檢測，結果顯示：MIP-3α-SA融合蛋白能高效錨定修飾表面已生物素化的RM-1腫瘤細胞，修飾效率為99.7%（見圖9）。左圖峰為未修飾的細胞（陰性對照），而右峰為MIP-3α-SA融合蛋白錨定修飾的細胞。

3 討論

目前CCL20 應用于腫瘤治療的常用研究方法有：①單一趨化因子的療法：將趨化因子導入腫瘤環(huán)境中在體內(nèi)可招募相關的白細胞亞群，減少惡性細胞的腫瘤形成，目前我們課題組正在致力于應用鏈親和素標記的CCL20治療前列腺癌及膀胱癌等的研究，CCL20可以較強地趨化未成熟的DC細胞，將CCL20腺病毒注射入不同的腫瘤模型（B16黑色毒瘤細胞，Lewis肺細胞癌等）較明顯地抑制了腫瘤的生長并增加了腫瘤宿主特異性存活。CCL20腺病毒注射可刺激局部CD8+細胞明顯聚集，激活細胞毒T細胞，進而抵抗腫瘤細胞[5]，其具體的機制還有待進一步的研究。②共同應用2種趨化因子或細胞因子與趨化因子結合治療的療法：目前國外有文獻報道，聯(lián)合應用CCL3和CCL20對小鼠胃癌有積極的治療作用[9]；另外CXCL9與IL-12聯(lián)合應用也取得明顯的抑瘤效果，將趨化因子與活化的細胞因子聯(lián)合用于腫瘤微環(huán)境中，可以誘導強烈的抗腫瘤反應并能明顯地減少系統(tǒng)地使用細胞因子所致的劑量限制性毒性作用；而我們課題組已經(jīng)研究出鏈親和素標記的sCD40L[10]、TNFα[11]、白介素系列[12-14]蛋白對不同腫瘤的治療作用，而CCL20與其中兩兩聯(lián)合還有待進一步實驗，且其相應的機制還有待研究。③趨化因子與腫瘤相關抗原（TSA）相融合：我們研究的CCL20是否也有與相應的白介素甚至GM-CSF結合發(fā)揮抗腫瘤作用，有待進一步的探討。④腫瘤疫苗：將趨化因子導入腫瘤環(huán)境中在體內(nèi)可招募相關的白細胞亞群，減少惡性細胞的腫瘤形成，將趨化因子與其他免疫刺激細胞因子結合可提供較強的長期抗腫瘤免疫。因此，趨化因子也許作為潛在的天然佐劑而應用于試驗性抗腫瘤免疫治療即腫瘤疫苗。然而，目前國內(nèi)外尚無CCL20與細胞因子聯(lián)合應用治療腫瘤的相關報道，因而CCL20聯(lián)合其他細胞因子治療腫瘤的應用前景尚有待進一步研究。⑤CCL20聯(lián)合放射治療：應用于腫瘤治療放射治療一直是惡性腫瘤的主要治療方法之一，但是無論治療的條件如何優(yōu)化，其療效始終難有突破性的提高。目前將CCL20基因串聯(lián)到早期生長反應啟動子（Egr21）下游，構建Egr21啟動的CCL20真核表達載體并轉染Lewis肺癌細胞，通過放射誘導使腫瘤細胞中CCL20表達增強，有效趨化樹突狀細胞及淋巴細胞產(chǎn)生抗腫瘤治療效應，是對放射-基因治療新的嘗試[15-16]。

表1 MIP-3α-SA雙功能融合蛋白趨化實驗結果

圖8 MIP-3α-SA雙功能融合蛋白淋巴細胞趨化效率

圖9 FCM分析MIP-3α-SA融合蛋白對已生物素化的RM-1腫瘤細胞錨定圖

本研究基于本實驗室建立的細胞膜表面錨定修飾技術平臺，利用該平臺制備了一系列鏈親和素連接的多種具有免疫佐劑作用的免疫刺激因子制備雙功能融合蛋白[10-14]，發(fā)揮其生物學活性，并誘發(fā)機體產(chǎn)生特異性主動免疫，已取得了良好成效。并且部分蛋白已建立了中試制備工藝，該平臺具有簡便快捷、高效，對細胞、組織，機體無明顯的毒副作用等特點。本研究利用人淋巴細胞趨化實驗，發(fā)現(xiàn)不同濃度的MIP-3α-SA有趨化人血淋巴細胞的活性且成劑量依賴效應，其中100 ng/mL趨化活性最高，之后提高MIP-3α-SA融合蛋白濃度趨化活性反而減低，猜測不同劑量的MIP-3α-SA對腫瘤的作用不同；有研究報道MIP-3α的表達可能參與了肺癌的侵襲及淋巴結轉移，可能的機制為：MIP-3α與其受體CCR6結合后，引發(fā)細胞內(nèi)骨架蛋白的重新分布，調(diào)節(jié)腫瘤細胞遷移，促進腫瘤細胞的侵襲與轉移[17]。因而不同劑量的MIP-3α對腫瘤的促進還是抑制作用還有待進一步實驗，而探索合適的藥物劑量是今后研究的趨勢。

目前，我們已研發(fā)出部分SA標記的可用于錨定修飾的膀胱癌及前列腺癌治療性疫苗。研究證明：SA標記的細胞因子雙功能融合蛋白錨定修飾的表淺膀胱癌瘤苗可誘導小鼠機體產(chǎn)生有效的抗腫瘤作用，并且能有效防治表淺膀胱癌的復發(fā)[18-21]。

利用基因重組技術，我們構建了MIP-3α-SAPET21重組表達質(zhì)粒，在C端設計了6×His標簽使后期更利于鎳親和層析制備高純度的雙功能融合蛋白；SA和MIP-3α之間靠甘氨酸和絲氨酸的15肽連接，使各單元蛋白質(zhì)分子獨立折疊，保留各自生物學活性。我們制備的融合蛋白能夠在大腸桿菌中高效表達，純化后通過尿素梯度透析復性，經(jīng)人淋巴細胞趨化實驗驗證了MIP-3α-SA融合蛋白有MIP-3α介導的對人淋巴細胞的趨化作用且呈劑量依附性，以及SA介導的高效結合至表面已生物素化的小鼠前列腺癌RM-1細胞的功能（表面錨定修飾效率大于95%），以上研究為今后腫瘤防治以及新型腫瘤疫苗研制奠定了堅實的基礎。