再生胰島衍生家族成員4在不同分子分型乳腺癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

宋姍姍，聶艷紅，王紅霞，王永芳，陳 昊

0 引 言

2013年St Gallen乳腺癌會(huì)議國(guó)際共識(shí)，將乳腺癌分為L(zhǎng)uminal A型（LA）、Luminal B型（LB）、HER-2過表達(dá)型和三陰性乳腺癌（Triple-negative breast cancer，TNBC）［1］。在分子分型的基礎(chǔ)上對(duì)乳腺癌患者采取個(gè)性化治療，可有效降低患者的病死率。但目前TNBC仍缺乏化療之外其他有效治療手段，具有預(yù)后差、轉(zhuǎn)移率高、總生存率低等特點(diǎn)［2］，關(guān)于TNBC的研究仍是目前熱點(diǎn)之一。再生胰島衍生家族成員4（regenerating islet-derived family，member 4，RegIV）主要在近端胃腸道表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、抗凋亡和耐藥，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［3］。在結(jié)直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)Reg IV與表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）呈正相關(guān)［4］，推測(cè)Reg IV是EGFR/Akt/AP-1通路的上游因子［5-6］。鑒于TNBC中亦有EGFR相關(guān)信號(hào)通路的發(fā)生［7］，EGFR在TNBC中的陽性表達(dá)率較高［8］，推測(cè)Reg IV在TNBC中可能發(fā)揮作用。本研究檢測(cè)Reg IV在乳腺癌不同分子分型中的表達(dá)情況，并分析其與EGFR、臨床病理特征、生存預(yù)后之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2011年3月至2017年10月連云港市第一人民醫(yī)院病理科存檔的284例乳腺癌患者的病理資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均為浸潤(rùn)性乳腺癌；排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前進(jìn)行放化療。乳腺癌分子分型采用免疫組織化學(xué)替代分型：LA、LB、HER-2+和TNBC型［1］。LA型（n=71）：ER陽性，PR表達(dá)≥20%，HER-2陰性且Ki-67＜20%者。LB型（n=84）分為2種亞型：①HER-2陰性亞型為ER陽性、HER-2陰性、Ki-67≥20%或PR＜20%者；②HER-2陽性亞型為ER陽性、HER-2陽性、PR及Ki-67任何表達(dá)者。HER-2過表達(dá)型（n=69）：ER和PR陰性、HER-2陽性者。TNBC型（n=60）：ER、PR及HER-2均為陰性者。

1.2 免疫組織化學(xué)及結(jié)果判讀手術(shù)標(biāo)本經(jīng)3.7%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚切片，采用免疫組織化學(xué)EnVision二步法對(duì)石蠟切片進(jìn)行染色，光鏡觀察。一抗Reg IV購(gòu)自Proteintech公司，ER、PR、HER-2、Ki-67、EGFR均購(gòu)自廣州安必平公司。用結(jié)腸癌陽性切片作陽性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照，其評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：Reg IV陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)，根據(jù)染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比乘積得分進(jìn)行綜合計(jì)分。①隨機(jī)選取5～10個(gè)高倍鏡視野（*400）計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞百分比的平均數(shù)，按照陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)分：無陽性細(xì)胞為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；②按照著色強(qiáng)弱計(jì)分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；③陽性細(xì)胞百分比的得分乘以染色強(qiáng)度的得分：≤3分為陰性，＞3分為陽性。結(jié)果均由2位正高級(jí)職稱病理醫(yī)師雙盲評(píng)估。ER、PR的結(jié)果判讀依據(jù)2012年美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO）的標(biāo)準(zhǔn)。HER-2的判讀依據(jù)2013年ASCO/CAP乳腺癌HER-2檢測(cè)指南，將細(xì)胞膜染色（3+）定義為HER-2陽性，（0）及（1+）定義為HER-2陰性；對(duì)于EGFR存在肯定的胞膜染色即視為陽性；Ki-67＜20%為低表達(dá)，≥20%為高表達(dá)。

1.3 熒光原位雜交對(duì)HER-2免疫組化（++）者，再次進(jìn)行FISH檢測(cè)。采用HER-2/neu基因檢測(cè)試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司），檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中HER-2/neu基因的擴(kuò)增情況，基因擴(kuò)增者為HER-2陽性，無擴(kuò)增者為HER-2陰性。

1.4 生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析Kaplan-Meier Plotter公共數(shù)據(jù)庫(kù)收錄了54675個(gè)基因和10461個(gè)癌癥樣本信息，其中包含5143例乳腺癌患者生存資料和基因表達(dá)信息。分析數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)Reg IVmRNA在乳腺癌中的表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系（http：//kmplot.com/analysis）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Reg IV在不同分子分型乳腺癌中的表達(dá)情況Reg IV在LA、LB、HER-2過表達(dá)型及TNBC型中的陽性率分別為52.11%（37/71）、50.00%（42/84）、65.22%（45/69）及20.00%（12/60），組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HER-2陽性亞型的Reg IV陽性率高于HER-2陰性亞型（60.00%vs38.46%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。乳腺癌細(xì)胞中Reg IV的染色主要定位于細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)，陽性染色呈棕黃色。見圖1。

圖1 乳腺癌組織中的Reg IV蛋白免疫組化染色（EnVision ×200）Figure 1 Immunohistochemical staining of the Reg IV protein in breast cancer tissue（EnVision ×200）

2.2 Reg IV與乳腺癌分型相關(guān)標(biāo)志物的關(guān)系Reg IV在PR、HER-2陽性中表達(dá)較陰性明顯增高（P＜0.01），見表1。Reg IV與PR、HER-2的Pearson相關(guān)系數(shù)r分別為0.192、0.243（P＜0.01）。

表1 浸潤(rùn)性乳腺癌患者Reg IV與乳腺癌分型相關(guān)標(biāo)志物的關(guān)系Table 1 Correlation between the expression of Reg IV and related markers in breast cancer

2.3 Reg IV與臨床病理特征的關(guān)系Reg IV與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)（P＜0.05）。Reg IV陽性者腫瘤直徑更小，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低，TNM分期低。見表2。

表2 浸潤(rùn)性乳腺癌患者Reg IV與臨床病理特征之間的關(guān)系（n）Table 2 Correlation of clinicopathological features in 284 breast cancer patients and Reg IV expression level（n）

2.4 Reg IV與乳腺癌患者生存預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)中，Reg IV對(duì)應(yīng)的AffyID分別為1554436_a_at和223447_at。生存分析結(jié)果示：Reg IV高表達(dá)的乳腺癌患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)明顯低于低表達(dá)者（HR=0.59，95%CI：0.50～0.69），進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)Reg IV高表達(dá)的LA乳腺癌患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)明顯低于低表達(dá)者（HR=0.63，95%CI：0.48～0.82），Reg IV高表達(dá)的LB乳腺癌患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)明顯低于低表達(dá)者（HR=0.56，95%CI：0.40～0.76），Reg IV 高表達(dá)的 TNBC 乳腺癌患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)明顯低于低表達(dá)者（HR=0.51，95%CI：0.36～0.71）。見圖 2。

圖2 浸潤(rùn)性乳腺癌患者Reg IV表達(dá)與RFS之間的關(guān)系Figure 2 Relationship between Reg IV expression level and RFS in breast cancer patients

3 討 論

乳腺癌分子分型的個(gè)性化治療已在臨床廣泛應(yīng)用，但TNBC型乳腺癌由于其獨(dú)特的分子表型決定了對(duì)常規(guī)化療及靶向治療均不敏感，是目前唯一未建立特異性靶向治療的亞型。因此尋找特異性治療靶點(diǎn)是目前TNBC型乳腺癌研究中的熱點(diǎn)之一。Reg IV是從炎癥性腸病基因庫(kù)中篩選出的一個(gè)新型基因，可參與多種惡性腫瘤的發(fā)生，但目前的研究主要集中在消化系統(tǒng)，如胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌及膽囊癌等［10-12］，在乳腺癌中尚罕見報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，Reg IV在乳腺癌中的陽性表達(dá)率為47.89%，該結(jié)果與Oue等［13］和Sentani等［14］結(jié)果不符，可能是由于文獻(xiàn)中的組織學(xué)類型不同（研究對(duì)象僅為少量乳腺印戒細(xì)胞癌的患者），或樣本數(shù)量較少導(dǎo)致。本研究亦發(fā)現(xiàn)Reg IV在HER-2陽性者中表達(dá)最高，且LB型的HER-2陽性亞型的陽性率高于HER-2陰性亞型（P＜0.05），Reg IV與HER-2表達(dá)呈正相關(guān)。HER-2是一種原癌基因，在美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)指南中已明確其擴(kuò)增與乳腺癌的預(yù)后和靶向治療顯著相關(guān)，因此推測(cè)Reg IV有望成為HER-2+乳腺癌的潛在靶點(diǎn)。

有研究認(rèn)為EGFR信號(hào)通路的異常與TNBC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［7］，Numata等［5］和Wang等［6］研究亦發(fā)現(xiàn)Reg IV與EGFR的信號(hào)通路有關(guān)，并促使腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究顯示Reg IV與EGFR無相關(guān)性，且在TNBC中表達(dá)最低，推測(cè)Reg IV在TNBC中可能不起主要作用。研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中Reg IV表達(dá)與EGFR相關(guān)［4］，與本研究差異可能源于組織特異性、腫瘤異質(zhì)性、實(shí)驗(yàn)誤差等，仍需大量的研究來證實(shí)。ER、PR狀態(tài)是乳腺癌常規(guī)治療的重要參考指標(biāo)，在臨床上單獨(dú)PR狀態(tài)并不常規(guī)用于指導(dǎo)治療決策，但PR在乳腺癌中的作用始終存在爭(zhēng)議［15-16］。PR是ER依賴型基因產(chǎn)物，PR的表達(dá)受ER調(diào)控。而本研究顯示Reg IV僅與PR相關(guān)、而與ER不相關(guān)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)存在ER-/PR+的乳腺癌類型［17］，表明PR并非一直與ER同步表達(dá)。

另有研究發(fā)現(xiàn)PR+乳腺癌患者生存率高，是乳腺癌預(yù)后良好的指標(biāo)［18］。本研究Reg IV與PR呈正相關(guān)；預(yù)后最差的TNBC型中Reg IV表達(dá)最低；Reg IV陽性患者腫瘤直徑更小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率及臨床分期更低，提示Reg IV有可能是評(píng)估乳腺癌患者預(yù)后良好的指標(biāo)之一。通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析，Reg IV高表達(dá)患者RFS更好，進(jìn)一步從分子分型角度分析發(fā)現(xiàn)在LA、LB和TNBC型乳腺癌中Reg IV高表達(dá)患者預(yù)后更佳。上述研究結(jié)果均支持Reg IV有可能與預(yù)后良好相關(guān)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)Reg IV在非TNBC型乳腺癌中表達(dá)較高（HER-2過表達(dá)型＞LA型＞LB型），與PR及HER-2表達(dá)呈正相關(guān)，有望在非TNBC的診斷、治療中發(fā)揮潛在作用；Reg IV的表達(dá)與EGFR不相關(guān)，在TNBC的發(fā)生發(fā)展中可能不起主要作用；Reg IV在浸潤(rùn)性乳腺癌中的表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、生存預(yù)后密切相關(guān)，可用于評(píng)估患者預(yù)后。