PD-L1基因多態(tài)性對(duì)接受卡培他濱輔助化療結(jié)直腸癌患者的生存期影響

張 宇，王 敏，侯艷華，張俊杰

0 引 言

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）在我國每年新發(fā)病例約為37.5萬，死亡病例約為19.1萬［1］。西妥昔單抗顯著降低CRC患者進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)［2］。貝伐珠單抗和瑞戈非尼為患者帶來生存獲益［3］。Pembrolizumab為微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（MSI-H）的患者帶來新的治療選擇［4］。Ⅲ期結(jié)腸癌推薦3個(gè)月的化療時(shí)長［5］?？ㄅ嗨麨I的輔助化療方案降低了CRC患者的術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)［6］。免疫治療領(lǐng)域的程序性死亡配體1（Programmed death-ligand 1，PD-L1）是近年來最熱門的基因，也是免疫治療藥物的重要的生物標(biāo)志物之一［7-8］。該基因編碼的蛋白主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表面通過和激活的T細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合后，抑制T細(xì)胞活性，引起T細(xì)胞凋亡，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸［9］。PD-L1的表達(dá)和患者預(yù)后關(guān)系目前結(jié)論尚不統(tǒng)一［10］。

PD-L1基因位于染色體9p24.1，包含8個(gè)外顯子。PD-L1的表達(dá)具有個(gè)體差異［11］。先前的研究結(jié)果提示，在肝癌患者中PD-L1基因的多態(tài)性位點(diǎn)和肝癌的易感性和預(yù)后均顯著相關(guān)［12］。然而，目前在輔助化療方面缺乏PD-L1基因遺傳變異和預(yù)后的關(guān)聯(lián)研究。因此，本研究旨在評(píng)估PD-L1基因901T＞C位點(diǎn)對(duì)接受卡培他濱為基礎(chǔ)輔助化療的CRC患者的無疾病生存期（disease free survival，DFS）和總生存期（overall survival，OS）的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象回顧性分析2010年1月至2017年12月鄭州人民醫(yī)院普外科行手術(shù)切除治療的CRC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～80歲，東部腫瘤協(xié)作組（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）評(píng)分0～2分，心功能正常（左心室射血分?jǐn)?shù)＞50%），腎功能正常（肌酐≤1.5 ULN），骨髓功能正常（中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)≥1.5×109/L，血小板計(jì)數(shù)≥100×109/L，血紅蛋白≥9 g/dL）；②病理診斷為CRC，且接受手術(shù)切除治療；③預(yù)期壽命≥3個(gè)月；④接受卡培他濱為基礎(chǔ)輔助化療；⑤有輔助化療前外周血標(biāo)本可供檢測(cè)PD-L1基因遺傳變異。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有家族性腺瘤性息肉??；②患有其他遺傳性CRC綜合征。本組最終納入研究患者265例。本研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（倫理批號(hào)：ZZRMYY-100025-3）。

接受卡培他濱為基礎(chǔ)的輔助化療，具體用法用量為術(shù)后3～4周，卡培他濱1000～1250 mg/m2，2 次/d，第1～14天，每21天為1個(gè)周期。奧沙利鉑，80～130 mg/m2，靜脈滴注，第1天。輔助化療結(jié)合患者情況6～8個(gè)周期。根據(jù)治療過程中出現(xiàn)的血液學(xué)或非血液學(xué)毒性調(diào)整相應(yīng)的給藥劑量，發(fā)生可能威脅生命的毒性反應(yīng)時(shí)中止治療。

1.2 血液樣本收集DNA提取及基因分型每位入組研究的患者在接受輔助化療前收集外周血樣本4 mL，用苯酚氯仿法提取基因組DNA，之后于-20℃保存。對(duì)于PD-L1基因多態(tài)性分析，本研究納入了經(jīng)過NCBI數(shù)據(jù)庫查閱在中國人群中突變頻率＞10%的 3個(gè)標(biāo)記多態(tài)性位點(diǎn)（901T＞C、-1813G＞C和-1457T＞A）。設(shè)計(jì)901T＞C（rs2297136）位點(diǎn)的上下游PCR引物，對(duì)該位點(diǎn)及附近的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，上游引物為：5′-GCTCCCTGTTTGACTCCATC-3′，下游引物為：5′-TTTTTCCCCAGACCACTTCC-3′，產(chǎn)物片段為274bp，用TɑqI內(nèi)切酶通過限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP）方法對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。通過條帶大小判斷該位點(diǎn)的基因型：TT型1條274 bp條帶；TC型3條條帶：1條274 bp條帶、1條105 bp條帶、1條169 bp條帶；CC型2條條帶：1條105 bp條帶、1條169 bp條帶。部分樣本的分型結(jié)果通過直接測(cè)序的方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 組織樣本收集及PD-L1基因mRNA表達(dá)分析納入研究的部分患者在手術(shù)過程中收集被切除的CRC癌組織標(biāo)本，最終納入89例癌組織標(biāo)本，液氮保存。之后用Trizol試劑進(jìn)行RNA提取，采用上海羅氏real-time PCR儀器進(jìn)行PD-L1基因mRNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)，PD-L1基因的上游引物為：5′-CTTCCCGAGGCTCCGCACCA-3′，下游引物為：5′-GCCCCGATGAACCCCTAAAC-3′。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系如下：SYBN Premix Ex Tag 溶液10 μL，PD-L1基因上游引物（20 μmol/L）0.2 μL，PD-L1基因下游引物（20 μmol/L）0.2 μL，dd H2O 7.6 μL，cDNA2 μL，反應(yīng)體系總計(jì)20 μL，GAPDHmRNA表達(dá)用作內(nèi)參。PD-L1基因mRNA用相對(duì)定量法2-△△Ct進(jìn)行計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0進(jìn)行分析。χ2檢驗(yàn)分析多態(tài)性位點(diǎn)基因分型是否符合哈迪溫伯格平衡。在基線臨床資料當(dāng)中，離散型的變量和901T＞C位點(diǎn)不同基因型的分布采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。連續(xù)型的變量和901T＞C位點(diǎn)不同基因型的分析采用非參的Mann-Whitney U檢驗(yàn)。

通過Stata繪制Kaplan-Meier曲線比較不同基因型患者DFS和OS的差異，組間差異采用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行比較。DFS的計(jì)算設(shè)為從手術(shù)開始到患者出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)或任何原因出現(xiàn)的死亡或最后一次隨訪結(jié)束；OS的計(jì)算設(shè)為手術(shù)開始到患者因各種原因出現(xiàn)的死亡日期或最后一次隨訪結(jié)束日期。多變量分析時(shí)，為進(jìn)一步校正其他混雜因素的影響，采用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型，將可能影響OS的風(fēng)險(xiǎn)因素如年齡、性別、ECOG評(píng)分、病理分期以及901T＞C位點(diǎn)納入該模型，用后退法篩選和校正潛在的混雜變量。以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 入組患者基線臨床資料901T＞C、-1813G＞C和-1457T＞A 3個(gè)位點(diǎn)中，僅901T＞C位點(diǎn)在分析中發(fā)現(xiàn)了顯著的臨床意義。后期分析主要針對(duì)901T＞C位點(diǎn)開展。901T＞C位點(diǎn)的基因分型結(jié)果顯示，TT型185例（69.81%）、TC型72例（27.17%）、CC型8例（3.02%），最小等位基因頻率為0.17，3種基因型分布頻率符合哈迪溫伯格平衡（P=0.758）。后期分析中將TC和CC基因型患者合并。該位點(diǎn)不同基因型患者在基線臨床資料中的分布基本均衡。見表1。

2.2 PD-L1基因901T＞C位點(diǎn)對(duì)預(yù)后的影響本組患者隨訪0.6～7.5年，中位隨訪時(shí)間為5.45年。納入研究的265例患者均可評(píng)價(jià)療效，整體人群的中位DFS為4.6年（95%CI：3.83～5.35），中位OS為6.5年（95%CI：5.74～7.27）。

將TC和CC基因型患者合并后，共計(jì)80例。單因素分析結(jié)果顯示，野生型TT基因型患者和TC/CC基因型患者中位DFS分別為4.8和3.5年，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。見圖1。2種基因型患者的中位OS分別為6.7和4.7年，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見圖2。經(jīng)多變量校正901T＞C位點(diǎn)對(duì)OS獨(dú)立的影響仍均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR=1.89，P=0.006）。Cox分析結(jié)果顯示，年齡（OR=1.42，P=0.025）、ECOG評(píng)分（OR=2.21，P=0.005）和病理分期（OR=2.98，P＜0.001）為獨(dú)立影響因素。

圖1 PD-L1基因901T＞C位點(diǎn)不同基因型CRC患者的無疾病生存期曲線對(duì)比Figure 1 Disease-free survival of the colorectal cancer patients with different 901T＞C genotypes of the PD-L1 gene

表1 265例CRC患者的基線臨床資料及901T＞C位點(diǎn)基因型分布比較Table 1 Baseline characteristics and 901T＞C genotypes of the 265 patients with colorectal cancer

圖2 PD-L1基因901T＞C位點(diǎn)不同基因型CRC患者的總生存期曲線對(duì)比Figure 2 Overall survival of the colorectal cancer patients withdifferent901T＞CgenotypesofthePD-L1gene

2.3 PD-L1基因901T＞C位點(diǎn)對(duì)mRNA表達(dá)的影響89例癌組織標(biāo)本的901T＞C位點(diǎn)基因分型結(jié)果顯示，TT型62例、TC型23例、CC型4例，3種基因型分布頻率同樣符合哈迪溫伯格平衡（P=0.338）。另外，89例患者的外周血標(biāo)本和癌組織標(biāo)本的901T＞C位點(diǎn)基因分型結(jié)果的吻合率為100%。CC型患者相對(duì)較少，同樣將TC型和CC型患者合并，共計(jì)27例。901T＞C位點(diǎn)不同基因型患者的PD-L1基因mRNA表達(dá)見圖3。相對(duì)于TT基因型患者，TC/CC型患者癌組織中PD-L1基因mRNA表達(dá)水平明顯較高（4.08±1.11vs2.63±1.78），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

圖3 PD-L1基因901T＞C位點(diǎn)不同基因型PD-L1基因mRNA表達(dá)情況對(duì)比Figure 3 Relative expression of PD-L1 mRNA in the colorectal cancer patients with different 901T＞C genotypes

3 討 論

本研究納入的265例CRC患者接受卡培他濱為基礎(chǔ)輔助化療的中位DFS為4.6年（95%CI：3.83～5.35），中位OS為6.5年（95%CI：5.74～7.27），總體數(shù)值低于NO16968的研究結(jié)果［13］。推測(cè)原因在于本研究納入了較多的ECOG評(píng)分為2分的患者，NO16968研究中只納入了ECOG評(píng)分為0～1分的患者，且均接受了卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑的化療方案。

CRC在臨床治療結(jié)果和預(yù)后上也有較大的個(gè)體差異［14］。目前已經(jīng)有較多可以預(yù)測(cè)CRC療效的生物標(biāo)記物。2018年報(bào)道的VEGFR2基因多態(tài)性對(duì)接受卡培他濱為基礎(chǔ)輔助化療的治療結(jié)果的影響［15］；2017年報(bào)道的四氫葉酸轉(zhuǎn)移酶MTHFR多態(tài)性對(duì)氟尿嘧啶療效的影響［16］；2016年報(bào)道的胸苷酸合成酶TS多態(tài)性對(duì)結(jié)腸癌一線5-FU放療療效的影響［17］。這些研究結(jié)果均提示藥物基因組學(xué)在CRC療效預(yù)測(cè)方面的價(jià)值。

本研究報(bào)道了在中國CRC患者接受5-FU為基礎(chǔ)的輔助化療方案時(shí)，PD-L1基因901T＞C位點(diǎn)的C等位基因攜帶者可能通過影響該基因的表達(dá)，從而影響接受5-FU為基礎(chǔ)輔助化療的CRC患者預(yù)后。首先，本研究中901T＞C位點(diǎn)的最小等位基因頻率為0.17，這與NCBI數(shù)據(jù)庫中國人群中的突變頻率一致；另外也與Xie等［12］的研究中901T＞C位點(diǎn)的分布頻率基本一致。Xie等［12］研究納入225例肝癌患者和200例健康志愿者，通過對(duì)PD-L1基因上4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)901T＞C位點(diǎn)CC基因型患者和肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。另外，在該位點(diǎn)和肝癌患者預(yù)后分析方面，Xie等［12］研究和本研究結(jié)果也基本一致，即901T＞C位點(diǎn)較少等位基因攜帶患者的預(yù)后較差。另外，Du等［18］的研究探討了位于PD-L1基因的3′-UTR區(qū)域的多態(tài)性901T＞C位點(diǎn)和非小細(xì)胞肺癌的易感性的研究。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明901T＞C位點(diǎn)通過擾亂miR-296-5p、miR-138以及PD-L1基因mRNA，從而影響了非小細(xì)胞肺癌的易感性。Du等［18］研究的901T＞C位點(diǎn)的分布頻率和本研究存在差異，可能緣于納入癌種差異。Xie等［12］研究也初步提示有類似趨勢(shì)；但Du等［18］的研究并沒有繼續(xù)探討901T＞C位點(diǎn)不同基因型患者的PD-L1基因mRNA表達(dá)情況。

另一方面，PD-L1基因是目前腫瘤免疫治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)基因，多項(xiàng)免疫治療的臨床研究結(jié)果顯示PD-L1的表達(dá)水平可以預(yù)測(cè)PD1和PD-L1抑制劑的療效［19］。然而，在PD-L1基因表達(dá)水平和接受常規(guī)化療的CRC患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)上，目前尚存在較大的爭議。本研究結(jié)果初步表明PD-L1基因mRNA高表達(dá)的人群在接受5-FU輔助化療時(shí)具有較差的預(yù)后，這和先前Enkhbat等［20］的研究結(jié)果一致。他們的研究納入了116例手術(shù)切除的Ⅱ期和Ⅲ期的CRC患者，分析了PD-1、PD-L1，以及TGF-β的表達(dá)水平相關(guān)性和預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PD-L1高表達(dá)的人群預(yù)后較差。然而，另一方面也有很多研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PD-L1基因編碼的蛋白主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表面，通過與激活的T細(xì)胞表面PD-1結(jié)合，進(jìn)而抑制T細(xì)胞活性，引起T細(xì)胞凋亡；但體內(nèi)的作用尚存疑問。因此，也有部分臨床研究結(jié)果表明，PD-L1高表達(dá)人群患者的預(yù)后較好［21］。這些結(jié)果可能和納入研究樣本的異質(zhì)性、接受輔助化療等情況相關(guān)，故尚需要進(jìn)一步的深入探討。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)了在中國CRC人群當(dāng)中PD-L1基因901T＞C位點(diǎn)是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后影響因素。本研究也存在一定局限性：首先納入研究的樣本量較少，缺乏大樣本中評(píng)估該位點(diǎn)的預(yù)后指導(dǎo)意義；另外，研究為回顧性分析，存在研究偏倚。今后的研究可能需要從更大的樣本中繼續(xù)探討，同時(shí)也要從PD-L1基因蛋白表達(dá)層面去分析該基因的蛋白表達(dá)和臨床結(jié)果的關(guān)聯(lián)，從而闡明該位點(diǎn)造成預(yù)后差異的根本原因。