貴州漢族慢性阻塞性肺疾病患者Toll樣受體1基因多態(tài)性與肺念珠菌感染及定植的相關(guān)性

劉海文，彭春紅，林潔如，張湘燕

0 引 言

近年來(lái)隨著糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物的廣泛使用、各種廣譜抗生素的濫用以及各項(xiàng)導(dǎo)管技術(shù)的推廣，慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）合并肺部真菌感染的發(fā)病率明顯上升［1-5］。我國(guó)多項(xiàng)肺部真菌感染臨床特點(diǎn)研究顯示，白色念珠菌居肺部真菌感染菌屬中的第1位［6-8］。真菌感染屬機(jī)會(huì)性感染，除與機(jī)體免疫力、基礎(chǔ)狀況、菌株毒力及載量等因素有關(guān)外，遺傳因素也起著重要作用。

Toll樣受體（toll-like receptors，TLRs）是固有免疫中重要的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）之一。其通過(guò)識(shí)別一系列真菌的病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），如病原真菌的殼聚糖、葡聚糖、甘露聚糖、蛋白類和糖脂類及核酸物質(zhì)等，而啟動(dòng)信號(hào)通路引起機(jī)體抗真菌感染免疫應(yīng)答。目前研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)于人體組織的10種TLRs，除TLR8以外均可參與天然抗真菌感染。近年來(lái)，單核苷酸多態(tài)性在疾?。ㄈ绺腥拘约膊　⒛[瘤、自身免疫性疾病等）發(fā)生發(fā)展中的重要作用已成為研究的一個(gè)重要方向。國(guó)外研究 表明TLR1基 因（rs5743611、rs4833095、rs5743618）、TLR2 基因（rs5743708）及TLR4基因（rs4986790、rs4986791）的多態(tài)性可增加白種人念珠菌血癥的易感性，并影響上述基因的功能，引起一系列細(xì)胞因子表達(dá)水平的改變［9-10］；國(guó)內(nèi)關(guān)于TLRs基因多態(tài)性與真菌感染的相關(guān)性研究極少，而上述3個(gè)基因的多態(tài)性與中國(guó)漢族人群真菌感染的相關(guān)性尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究選取上述6個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行基因型的分析及多態(tài)性功能結(jié)果的評(píng)估，探討其多態(tài)性與貴州漢族COPD患者肺念珠菌感染、定植之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象344例研究對(duì)象均來(lái)自于2017年1月至2018年5月就診于貴州省人民醫(yī)院呼吸科及急診科住院病房患者。所有納入個(gè)體間無(wú)親緣關(guān)系，均來(lái)自貴州地區(qū)的漢族人群。所有納入患者均符合COPD全球倡議2018年修訂版《GOLD慢性阻塞性肺疾病全球倡議：COPD診斷、治療與預(yù)防全球策略》［11］。排除惡性腫瘤或癌前狀態(tài)、免疫功能極度低下（實(shí)體器官或骨髓或異基因造血干細(xì)胞移植、放化療、HIV感染、血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病）、肝硬化、腎功能不全、近期高危外科手術(shù)、近期多成分輸血、肺葉切除、肺結(jié)核、嚴(yán)重?zé)齻燃膊』颊?，同時(shí)排除微生物學(xué)檢查中有其他病原菌檢出者。按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)感染學(xué)組2007年發(fā)布的《肺真菌病診斷和治療專家共識(shí)》診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分組［12］。其中80例確診病例納入肺念珠菌感染組；痰液或血培養(yǎng)念珠菌陽(yáng)性，但不符合感染標(biāo)準(zhǔn)者（導(dǎo)管植入并從導(dǎo)管處取血，血培養(yǎng)陽(yáng)性者需綜合考慮）納入念珠菌定植組（n=103）；微生物學(xué)檢查均陰性者納入對(duì)照組（n=161）。收集所有研究對(duì)象的臨床資，包括年齡、性別、吸煙史、合并癥、呼吸衰竭、機(jī)械通氣、靜脈或口服糖皮質(zhì)激素、抗生素使用等情況。本研究?jī)?nèi)容均經(jīng)貴州省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（批號(hào)：2016018），并取得患者本人或監(jiān)護(hù)人的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 外周血基因組DNA提取抽取全部受試者外周靜脈EDTA抗凝血3 mL。及時(shí)以3500 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min。分離血漿與血細(xì)胞并分裝保存于-80℃冰箱中備用。由上海生工生物工程股份有限公司提供的Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，提取的DNA測(cè)定濃度及純度，合格者置于-20℃冰箱中保存。

1.2.2 目的基因PCR產(chǎn)物擴(kuò)增PCR擴(kuò)增體系50 μL，包括2×Taq Master Mix 25 μL，模板、上下游引物各1 μL，由去離子水補(bǔ)足至50 μL，引物設(shè)計(jì)與合成由上海生工生物工程股份有限公司提供，rs5743611、 rs4833095、 rs5743618、 rs5743708、rs4986790及rs4986791 6個(gè)SNP位點(diǎn)反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，退火時(shí)間30 s，退火溫度分別為61、65、67、65、60、60、72 ℃延伸時(shí)間分別為 22、20、23、17、21、21s，共 30 個(gè)循環(huán)，最后72℃進(jìn)入補(bǔ)充延伸10 min。PCR引物信息見(jiàn)表1。

表1 6個(gè)SNP位點(diǎn)引物信息Table 1 Primersequencesofthe 6singlenucleotidepolymorphismsoftheTLR1,TLR2andTLR4genesintheCOPDpatients

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳取制好的1.5%瓊脂糖凝膠浸入電泳液（0.5×TAE）中，以 DNA Marker作為片段分子量標(biāo)記，依次將Marker及各目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL加入瓊脂糖凝膠中，調(diào)節(jié)電泳電壓110 V，時(shí)間90 min，進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。電泳實(shí)驗(yàn)完成后將瓊脂糖凝膠放置于凝膠成像分析儀中，觀察各個(gè)SNP位點(diǎn)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序基因分型將PCR產(chǎn)物標(biāo)本送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序分析。chromas軟件閱讀測(cè)序圖譜，結(jié)合dbSNP庫(kù)中目的基因序列比列分析各SNP位點(diǎn)基因型。

1.2.5 血漿中IL-6、IL-8、IL-1β及TNF-α蛋白水平采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)肺念珠菌感染組及對(duì)照組血漿中IL-6、IL-8、IL-1β及TNF-α濃度，ELISA試劑盒由美國(guó)R&D公司提供。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行資料分析。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)研究樣本的群體代表性，以P＞0.05為符合Hardy-Weinberg規(guī)律。應(yīng)用Solé等［11］的在線軟件SNPstats分析在4種不同的遺傳模式下（顯性、隱性、共顯性、超顯性）單個(gè)SNP與COPD患者肺念珠菌感染、念珠菌定植的相關(guān)性，用OR值和95%CI評(píng)價(jià)相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)，然后采用赤池信息量準(zhǔn)則（Akaike S information criterion，AlC）和貝葉斯信息準(zhǔn)則（Bayesian information criterion，BIC）確定最適合的遺傳模式。分析血漿中IL-6、IL-8、IL-1β及TNF-α蛋白水平在組間差異性。計(jì)量資料比較符合正態(tài)分布采用t檢驗(yàn)（2組）或方差分析（3組），計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基本資料肺念珠菌感染組、念珠菌定植組與對(duì)照組年齡分別為（72.03±9.87）、（71.20±9.29）以及（73.97±9.68），組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。性別、吸煙史、糖尿病史、呼吸衰竭、機(jī)械通氣、長(zhǎng)時(shí)間使用抗生素、靜脈或口服糖皮質(zhì)激素等分布差異亦均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組研究對(duì)象基本情況比較[n（%）]Table 2 Basic information on the COPD patients in different groups n（%）

2.2 目的基因SNP位點(diǎn)基因型及Hardy-Weinberg平衡結(jié)果各目的基因SNP位點(diǎn)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為337、346、352、273、326和375bp，電泳圖譜見(jiàn)圖1。將測(cè)序結(jié)果與dbSNP庫(kù)中序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)TLR4基因rs4986790及rs4986791、TLR1基因rs5743611、TLR2基因rs5743708在所有研究對(duì)象中只檢測(cè)到野生純合子，故不做進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；TLR1基因rs4833095檢測(cè)到CC、CT、TT 3種基因型，rs5743618檢測(cè)到TT、GT 2種基因型，測(cè)序圖譜見(jiàn)圖2。TLR1基因rs4833095與rs5743618多態(tài)性位點(diǎn)的基因型頻率在肺念珠菌感染組、念珠菌定植組與對(duì)照組均符合Hardy-Weinberg平衡rs4833095在3組的P值分別為0.53、0.3、0.067；rs5743618在3組的P值均為1，提示本研究的樣本均來(lái)自隨機(jī)婚配的大群體，具有良好代表性。

圖1 6個(gè)SNP位點(diǎn)PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Figure 1 AGR images of the PCR products of the 6 single nucleotide polymorphisms of the TLR1，TLR2 and TLR4 genes in the COPD patients

2.3 rs4833095與rs5743618位點(diǎn)在4種遺傳模型下的基因型分布為避免人群分層影響，將性別與年齡作為協(xié)變量進(jìn)行校正后計(jì)算OR值與95%CI。TLR1基因rs4833095在共顯性、顯性及超顯性遺傳模式下在肺念珠菌感組與對(duì)照組間基因型分布的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，在共顯性遺傳模式下，以野生型CC為參照，CT基因型是肺念珠菌感染的風(fēng)險(xiǎn)基因型（OR=2.48，95%CI：1.36～4.54，P=0.0099）；顯性遺傳模型下，CT+TT突變型攜帶者較CC野生純合型攜帶者肺念珠菌感染的發(fā) 病 風(fēng) 險(xiǎn) 增 高（OR=2.36，95%CI：1.33～4.20，P=0.0028）；在超顯性遺傳模式下，以純合基因型CC+TT為參照，雜合性攜帶者CT是肺念珠菌感染的危險(xiǎn)因素（OR=2.08，95%CI：1.20～3.60，P=0.0084）。根據(jù)最小AIC與BIC值，推測(cè)該位點(diǎn)最佳遺傳模式是顯性；而TLR1基因rs5743618在肺念珠菌感染組與對(duì)照組間基因型頻率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。兩位點(diǎn)在念珠菌定植組與對(duì)照組間基因型頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表4。此外，采用SNPstats在線軟件對(duì)rs4833095與rs5743618進(jìn)行連鎖不平衡分析，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)SNP之間不存在連鎖不平衡，故不進(jìn)一步做單倍型分析。

圖2 6個(gè)SNP位點(diǎn)PCR產(chǎn)物測(cè)序圖譜Figure 2 Sequencing of the PCR products of the 6 single nucleotide polymorphisms of the TLR1，TLR2 and TLR4 genes in the COPD patients

表3 肺念珠菌感染組與對(duì)照組在4種遺傳模型下基因型分布Table 3 Genotype frequency in different genetic models in the COPD patients of the pulmonary candida infection and negative control groups

2.4 rs4833095多態(tài)性與血漿中 IL-6、IL-8、IL-1β及TNF-α蛋白水平的關(guān)系肺念珠菌感染組CT和TT突變基因型血漿中IL-6、IL-8及IL-1β水平顯著低于CC野生基因型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），但CT和TT型間血漿中上述細(xì)胞因子水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。肺念珠菌感染組CT和TT型血漿中TNF-α水平也低于CC型，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CT和TT型間血漿中TNF-α水平差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖3。

表4 念珠菌定植組與對(duì)照組在4種遺傳模型下基因型分布Table 4 Genotype frequency in different genetic models in the COPD patients of the pandida colonization and negative control groups

圖3 肺念珠菌感染組rs4833095各基因型血漿細(xì)胞因子水平比較Figure 3 Levels of IL-6，IL-8，IL-1β and TNF-α in the plasma of the COPD patients in the pulmonary candida infection group with different rs4833095 genotypes

3 討 論

人體多種細(xì)胞均可表達(dá)TLRs，尤其參與固有免疫應(yīng)答的各種細(xì)胞。在這些細(xì)胞表面或內(nèi)吞體中TLRs通過(guò)MyD88和TRIF通路激活不同的轉(zhuǎn)錄因子，引起一系列炎癥因子的釋放，如TNF-α、IFN-γ、IL-10、IL-6等，在感染性疾病中發(fā)揮重要的天然免疫作用［14］。在小鼠模型中，Pinke 等［15］發(fā)現(xiàn)敲除TLR2基因的肥大細(xì)胞，其吞噬功能和產(chǎn)生一氧化氮的能力顯著減弱；對(duì)于TLR4缺陷的小鼠感染白假絲酵母菌ATCC 10231后感染部位中性粒細(xì)胞趨化作用減弱，且該菌在淋巴結(jié)和脾等處散播、持續(xù)定植［16］。TLRl主要與TLR2形成異源二聚體，參與對(duì)白假絲酵母菌的識(shí)別過(guò)程［17］。TLRs基因多態(tài)性與多種感染性疾病的易感性相關(guān)，如細(xì)菌感染、結(jié)核、病毒感染等［18-20］。目前在TLRs基因多態(tài)性與真菌感染的相關(guān)性研究中，絕大部分研究人群關(guān)于白種人，其結(jié)論尚需在不同種族及地區(qū)中進(jìn)一步研究。

本研究在貴州漢族人群中檢測(cè)了TLR1、TLR2和TLR4這3個(gè)基因共6個(gè)SNP位點(diǎn)。經(jīng)過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，TLR4基因 rs4986790及 rs4986791、TLR1基因rs5743611及TLR2基因rs5743708位點(diǎn)在所有研究對(duì)象中只檢測(cè)到野生純合子，TLR4基因rs4986790及rs4986791位點(diǎn)在日本人群中也未檢測(cè)到突變［21］，但上述位點(diǎn)的突變?cè)诎追N人中均可檢測(cè)出，且多態(tài)性與多種類型真菌感染有相關(guān)性［9-10］。此結(jié)果說(shuō)明不同種族基因型的分布存在差異性。中國(guó)是一個(gè)多民族國(guó)家，類似研究在中國(guó)人群中也許能得到多種可能性。

本研究基于基因型的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，TLR1基因的rs4833095多態(tài)性在共顯性、顯性及超顯性遺傳模式下與COPD患者肺念珠菌感染的易感相關(guān)；而與念珠菌定植不相關(guān)，可能該位點(diǎn)多態(tài)性在念珠菌定植的發(fā)生過(guò)程中并非重要原因。雖rs5743618位點(diǎn)在感染組與定植組中的突變基因型頻率高于對(duì)照組，但其分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。出現(xiàn)此陰性結(jié)果，可能與樣本量或種族差異有關(guān)。因本研究rs4833095與rs5743618兩SNP之間不存在連鎖不平衡，未能進(jìn)一步明確單倍型與COPD患者肺念珠菌感染、念珠菌定植的易感性關(guān)系。

體外予Pam3Cys刺激單核細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，TLR1基因的rs4833095突變基因型可降低上清液中IL-6、IL-8、IL-1β及TNF-α水平［17，22］。為了解該位點(diǎn)多態(tài)性在體內(nèi)與上述細(xì)胞因子的相關(guān)性，本研究測(cè)定了上述細(xì)胞因子在血漿中水平，結(jié)果顯示肺念珠菌感染組rs4833095的CT和TT突變基因型血漿中IL-6、IL-8及IL-1β水平顯著低于CC野生純合基因型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而CT和TT型間血漿中上述細(xì)胞因子水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rs4833095位于TLR1基因的外顯子區(qū)，是非同義單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。由此推測(cè)rs4833095的T等位基因突變影響了TLR1基因的表達(dá)，導(dǎo)致在信號(hào)傳導(dǎo)通路中細(xì)胞因子的釋放發(fā)生改變，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。TNF-α水平突變基因型雖低于CC野生純合基因型，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異，具體原因還有待進(jìn)一步分析研究。

綜上所述，本研究在貴州漢族人群中發(fā)現(xiàn)了TLR1基因rs4833095的多態(tài)性與COPD患者肺念珠菌感染的易感性相關(guān)，且該位點(diǎn)的T等位基因可能影響TLR1的功能，減少血漿中IL-6、IL-8、IL-1β的表達(dá)水平。但本研究結(jié)論仍需在多中心大樣本的研究予以論證；同時(shí)可以進(jìn)一步檢測(cè)該基因在組織或血液中的表達(dá)，從轉(zhuǎn)錄或蛋白水平進(jìn)一步闡明多態(tài)性位點(diǎn)在肺念珠菌感染發(fā)病過(guò)程中的作用，為肺念珠菌感染的治療提供新的診療策略。