UPLC-MS/MS法測定阿膠糕中6種黃曲霉毒素的方法

周艷華，李濤*，潘小紅

1. 長沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院（長沙 410004）；2. 湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院（長沙 410111）

阿膠糕屬于藥食同源產(chǎn)品，是用阿膠、黑芝麻、核桃仁、枸杞、冰糖、黃酒等制作出的保健食品，具有補(bǔ)血養(yǎng)氣、美容養(yǎng)顏、潤腸通便、提高免疫力的綜合保健功效，近年來越來越受到消費(fèi)者的青睞，阿膠糕類產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大，阿膠糕的質(zhì)量安全也越來越受到重視[1-2]。黃曲霉毒素（Aflatoxins，以下簡稱AF）是生長在食物及飼料中的黃曲霉和寄生曲霉代謝的一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的產(chǎn)物，AF具有強(qiáng)毒性和致癌性，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將AF列入Ⅰ類致癌物清單[3-4]。據(jù)研究表明，AF在飼料、糧油產(chǎn)品、堅(jiān)果及籽類（特別是花生、核桃、芝麻）、調(diào)味品、乳制品中檢出率較高[5-8]。阿膠糕中含有多種易產(chǎn)生AF的原料，因此加強(qiáng)阿膠糕中AF的監(jiān)測具有重要意義。目前，AF的檢測方法主要包括薄層色譜法（TLC）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、高效液相色譜法（HPLC）等[9-11]，其中TLC分離效果差、準(zhǔn)確度和靈敏度低；ELISA易出現(xiàn)假陽性；HPLC法使用熒光檢測器檢測，專屬性不強(qiáng)，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，對于基質(zhì)較為復(fù)雜樣品，如蜂膠等保健食品，仍會出現(xiàn)回收率低、不易分離等問題。超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）因其高準(zhǔn)確度和高靈敏度成為一種理想的檢測方法。試驗(yàn)采用UPLC-MS/MS同時測定保健食品阿膠糕中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2，為保健食品中6種AF的同時快速檢測提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津LC-30超高壓液相色譜儀，日本島津公司；API 4500型串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國AB Sciex公司；BS 224 S電子分析天平，德國賽多利斯公司；TG 16-WS臺式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；Hypersil Gold C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μ m）、Hypersil Gold C8色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm），美國Thermo Fisher公司；XB-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μ m），月旭科技上海股份有限公司。

HLB固相萃取小柱（60 mg/3 mL）、C18固相萃取小柱（60 mg/3 mL），美國Waters公司；AF免疫親和柱（B1、B2、G1、G2、M1、M2），北京華安麥科公司；M226 Aflazon凈化柱，Romer Labs公司；AFB1、AFB2、AFG1、AFG2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及AFM1、AFM2，美國O2si公司；乙腈、甲醇，均為色譜純，德國Meker公司；甲酸、乙酸銨，均為分析純，上海國藥。女士型阿膠糕、即食阿膠糕、桃花阿膠糕囊，市售。

1.2 液相色譜條件

色譜柱：Hypersil Gold C8色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）；柱溫：35 ℃；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL：流動相：A為0.1%甲酸水溶液，C為乙腈；梯度洗脫程序見表1。

1.3 質(zhì)譜條件

電離方式：ESI，正離子模式掃描，氣簾氣25 Psi，鞘氣38 Psi，輔助氣40 Psi，碰撞氣中等，離子化電壓5 500 V，霧化溫度550 ℃；多反應(yīng)監(jiān)測掃描（MRM）采集參數(shù)見表2。

表2 液質(zhì)采集參數(shù)表

1.4 樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取5.0 g粉碎混勻的樣品，加入1.0 g氯化鈉和25 mL 84%乙腈水溶液，振搖提取30 min，于6 000 r/min離心10 min，取5.0 mL上清液，加入50.0 mL 10%吐溫20 PBS緩沖液，混勻，于6 000 r/min離心5 min，離心后上清液過柱，用4.0 mL甲醇洗脫后氮吹干，用1.0 mL流動相復(fù)溶后，供液質(zhì)聯(lián)用儀分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱選擇

在相同條件，分別研究了Hypersil Gold C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）、Hypersil Gold C8色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）、XB-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）測定相同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。GOLD C8柱較GOLD C18柱對AF的分離效果更好，GOLD C8柱較XB-C18有更高的靈敏度，填料粒徑為1.8 μm的色譜柱工作壓力較大，并易出現(xiàn)壓力波動，引起保留時間漂移。因此采用Hypersil Gold C8（150 mm×2.1 mm，3 μm）色譜柱效果更佳。圖1為標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）TIC圖，圖2為加標(biāo)樣品多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）TIC圖。

圖1 Gold C8色譜柱分離標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）TIC圖

圖2 Gold C8色譜柱分離加標(biāo)樣品的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）TIC圖

2.2 凈化柱效果評價

在相同條件下，分別研究了HLB凈化柱、C18凈化柱、M226凈化柱和免疫親和柱對阿膠糕提取液中AF凈化效果，以回收率為評價指標(biāo)，4種凈化柱回收率見表3。由表3可見，HLB凈化柱對阿膠糕中AF凈化后回收率在54.7%～86.3%之間，C18凈化柱對阿膠糕中AF凈化后回收率在51.1%～83.5%之間，M226凈化柱對阿膠糕中AF凈化后回收率在57.7%～73.3%之間，免疫親和柱對阿膠糕中AF凈化后回收率在86.8%～100.9%之間，說明免疫親和柱具有良好的回收率，凈化效果最好。因此選取免疫親和柱作為測定阿膠糕中AF的凈化柱。

表3 4種凈化柱對阿膠糕中AF凈化回收率

2.3 線性范圍、檢出限和定量限

5.0，10.0，15.0，20.0和40.0 ng/mL，AFB2、G2濃度為0.15，0.30，0.6，1.5，3.0，4.5，6.0和12.0 ng/mL，以峰面積的響應(yīng)值Y為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度X（ng/mL）為橫坐標(biāo)，外標(biāo)法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線?；|(zhì)空白響應(yīng)值的2～3倍對應(yīng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液AFB1、AFG1、AFM1、AFM2濃度為0.5 ng/mL，AFB2、AFG2濃度為0.15 ng/mL，平行測定11次，根據(jù)檢出限的計算方法LOD=3SD/b和LOQ=10SD/b（SD為標(biāo)準(zhǔn)偏差，b為工作曲線斜率），當(dāng)取樣量為5.0 g，定容體積為5.0 mL時，6種AF線性方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限和定量限見表4。由表4可知，AFB1、AFG1、AFM1、AFM2在0.5～40 ng/mL濃度范圍內(nèi)，AFB2、AFG2在0.15～12.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，線性回歸系數(shù)均在0.999以上。各組分的檢出限在0.07～0.03 μg/kg之間，定量限在0.02～0.15 μg/kg之間。

表4 6種AF的線性方程和相關(guān)系數(shù)

2.4 準(zhǔn)確度和精密度

在空白阿膠糕樣品中加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)后樣品濃度分別為1.0，2.0和10.0 μg/kg，每個濃度樣品制備6份，測定6種AF的濃度，計算回收率和RSD值。由表5可知，當(dāng)加標(biāo)濃度為1.0 μg/kg時，回收率在69.2%～84.1%之間，精密度RSD為1.2%～4.1%；當(dāng)加標(biāo)濃度為2.0 μg/kg時，回收率在73.7%～90.1%之間，精密度RSD為2.2%～4.1%；當(dāng)加標(biāo)濃度為10.0 μg/kg時，回收率在76.3%～106.7%之間，精密度RSD為0.9%～4.0%。

表5 6種AF回收率和精密度

2.5 實(shí)際樣品的檢測

按擬定方法測定3種保健食品阿膠糕，女士型阿膠糕和桃花阿膠糕均未檢出AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2；即食阿膠糕檢出AFB1，其含量為0.47 μg/kg，小于規(guī)定限量值，樣品中AFB1定量離子色譜圖見圖3。

圖3 樣品中AFB1定量離子色譜圖

3 討論與結(jié)論

保健食品阿膠糕是高蛋白、高脂肪、高糖分的混合體，在一定的環(huán)境下極易產(chǎn)生AF。食品中AFB族和G族提取劑通常選擇70%的甲醇或84%的乙腈，AFM族提取劑通常選擇甲醇，基于保健食品阿膠糕的特殊基質(zhì)，試驗(yàn)采用84%的乙腈作為提取劑，乙腈具有沉淀蛋白的作用，利用AF充分溶解進(jìn)入提取液，也有利于AF的凈化。

通過使用多種凈化柱進(jìn)行凈化，結(jié)果表明，僅使用免疫親和柱時6種AF都具有較高回收率，免疫親和柱利用高特異性抗體與提取液中AF結(jié)合保留在親和柱中，其他雜質(zhì)則隨提取液流出。當(dāng)凈化液中有機(jī)相超過一定比例時，免疫親和柱中抗體無法全部與提取液中AF進(jìn)行結(jié)合，會產(chǎn)生回收率低的現(xiàn)象，因此在凈化前，需采用10%吐溫20 PBS緩沖溶液進(jìn)行稀釋，可有效提升AF的回收率和凈化效果。免疫親和柱的高特異性和高靈敏度，十分適合阿膠糕這種基質(zhì)復(fù)雜的保健食品。

此研究利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀建立了保健食品阿膠糕中6種AF的快速檢測方法。色譜條件：Hypersil Gold C8色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）；正離子模式，使用0.1%甲酸水溶液和乙腈進(jìn)行梯度洗脫，流速0.2 mL/min，柱溫30 ℃。結(jié)果表明：6種AF在0.15～40.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999），各組分的檢出限在0.07～0.03 μg/kg之間，定量限為0.02～0.15 μg/kg。當(dāng)加標(biāo)濃度為1.0～10.0 μg/kg時，回收率在69.2%%～106.7%之間，精密度在0.9%～4.1%之間。該方法快速、簡便、可靠，應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測重現(xiàn)性良好，可為阿膠糕及其它保健食品中AF的快速檢測提供參考依據(jù)。