HPLC-PAD法測定硫酸新霉素含量及其有關物質

張 倩，黃敏文，FANG Wang，張 玫，杭太俊，袁耀佐**

(1江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，南京 210019；2中國藥科大學藥物分析教研室，南京 210019;3St Jude Children′s Research Hospital,Memphis,TN,USA)

硫酸新霉素(neomycin sulfate)是1949年從新霉素鏈霉菌(streptomyces fradiae)的代謝產物中分離得到的混合物[1](圖1)，含有A、B、C 3個成分，其中新霉素B和C為主要成分，新霉素A(即新霉胺)僅微量。其主要通過與細菌核糖體30S亞單位結合，抑制細菌蛋白質的合成[2-3]。新霉素的耳、腎毒性較強，但當局部應用時，很少引起毒性或過敏性反應，因此主要用于治療皮膚感染性疾??；新霉素口服極少吸收，在腸道內濃度很高，與其他抗生素混合口服可用于對腸道微生物群系的控制，適合于手術前的腸道消毒等[4-5]。其原料藥在《中國藥典》(2015)(ChP2015)、歐洲藥典9.0(EP9.0)、國際藥典第五版(Ph.In 5th)、美國藥典40-國家處方集35(USP40-NF35)、日本藥局方17版(JP17)、韓國藥典第10版均有收錄[6-11]，含量測定均采用專屬性差、繁瑣耗時的抗生素微生物檢定法，但有關物質檢查項除EP9.0外，其他藥典中均未設定。

Figure1 Chemical structures of neomycin B,neomycin C and neamine

脈沖安培電化學檢測器(pulsed amperometric detector，PAD)是通過測定電化學活性物質在工作電極表面發(fā)生氧化或還原反應時所產生的電流變化實現對其定量分析，其與HPLC聯用在氨基糖苷類抗生素質量控制中已有很多應用，因其靈敏度高、專屬性好、濃度與響應呈線性等優(yōu)點越來越受到重視，并有多個品種被相關藥典收載[12]，在ChP2015版的硫酸依替米星原料藥的標準中，也首次將該技術應用于產品質量控制。

EP9.0采用高效液相色譜-脈沖安培檢測法測定硫酸新霉素的有關物質，但在預實驗過程中發(fā)現，該方法還有一些不足之處。EP9.0采用三電位檢測波形(triple-potential waveform，TPW)施加電位的檢測模式，文獻報道[13-15]及實踐表明，TPW模式存在電極耗損快，方法重復性、重復性及耐用性差等缺點，而四電位檢測波形(quadruple-potential waveform，QPW)能較好改善上述不足，已成為氨基糖苷類抗生素質量控制的新手段，并在阿米卡星、依替米星等檢測時得到應用。另外，在EP9.0色譜條件下，原料中的部分雜質與主峰及各雜質之間的分離欠佳。

因此，本研究在EP9.0方法的基礎上，采用QPW作為檢測波形，對色譜條件進行優(yōu)化，并進行了系統的方法學驗證，建立了HPLC-PAD法測定硫酸新霉素的含量和有關物質的方法，與EP9.0方法相比，該方法在專屬性、靈敏度和重復性等方面均取得較大改善。

1 材 料

1.1 儀 器

Dionex ICS-5000+離子色譜儀(美國Dionex公司)；脈沖安培電化學檢測器(Ag-AgCl參比電極；金電極，3mm)；變色龍數據分析軟件(Chromeleon7.2 SR4)；PC10池(Pneumatic Controller)；XS205電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)及Milli-Q IQ7000超純水發(fā)生裝置(美國Millipore公司)。

1.2 藥品與試劑

新霉素標準品(批號：130309-201512)、巴龍霉素(批號：130371-200305)、新霉胺標準品(批號：130411-200908)均來源于中國食品藥品監(jiān)督檢驗研究院。硫酸新霉素B精制品(以新霉素B計：66.007%，批號：180803)、硫酸新霉素C精制品(以新霉素C計：60.776%，批號：180801，宜昌三峽制藥有限公司)；新霉胺精制品(96.2%，無錫福祈制藥有限公司)。12批硫酸新霉素原料藥來源于A、B兩個不同企業(yè)2018年國家評價性抽驗供研究用樣品。

五氟丙酸、50%無二氧化碳氫氧化鈉水溶液(HPLC級，美國Sigma-Aldrich公司)；三氟乙酸(HPLC級，J&K Scientific公司)；高純氦氣(南京天澤氣體有限責任公司)；超純水。

2 方 法

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo AcclaimTMAmG (4.6 mm×150mm，3 μm)；以2%三氟乙酸溶液[含0.01%五氟丙酸+0.6%氫氧化鈉]為流動相；流速：0.8 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：25 μL。用積分脈沖安培電化學檢測器檢測，檢測電極為金電極(推薦使用3 mm直徑)，參比電極為Ag/AgCl復合電極，鈦合金對電極，四波形檢測電位(圖2，0.2～0.4 s檢測信號積分)，柱后堿液：50%NaOH溶液(1.0 mL 50% NaOH加水制成25 mL溶液)，堿液推薦流速：0.3 mL/min。

Figure2 Settings of quadruple-potential waveform-time

2.2 溶液的制備

2.2.1 柱后堿液 量取超純水960 mL，以50 mL/min流量通氦氣脫氣8 min后，立即量取質量分數為50%的氫氧化鈉溶液40 mL混合，繼續(xù)脫氣3 min，即得。

2.2.2 系統適用性溶液 精密稱取新霉胺精制品及新霉素標準品，加水溶解并稀釋成每毫升含新霉胺10 μg、硫酸新霉素30 μg的溶液，即得。

2.2.3 標準溶液 精密稱取硫酸新霉素標準品(標準品采用硫酸新霉素B精制品及硫酸新霉素C精制品標化)，加水溶解并稀釋成含新霉素B分別為0.14，0.34，0.69，1.38，3.4，6.89，13.79，27.89 μg/mL的溶液，及含新霉素C分別為0.14，0.28，0.70，1.41，2.82，4.69 μg/mL的溶液，精密稱取新霉胺精制品，加水溶解并稀釋成含新霉胺分別為0.36，0.76，1.51，3.03，6.06，12.11 μg/mL的溶液。

2.2.4 含量測定溶液 精密稱取硫酸新霉素供試品和新霉素標準品適量，加水溶解并稀釋制成30 μg/mL的溶液，分別作為供試品溶液和對照溶液。

2.2.5 有關物質測定溶液 精密稱定硫酸新霉素供試品，用流動相溶解并稀釋制成0.4 mg/mL的溶液為供試品溶液，精密量取2 mL，用流動相稀釋制成8 μg/mL的溶液為對照溶液。

3 方法學驗證

3.1 系統適用性

取“2.2.2”項系統適用性溶液，按照“2.1”色譜條件下測定，出峰順序依次為：新霉胺、新霉素C及新霉素B。新霉素B、新霉素C與相鄰雜質的分離度均符合規(guī)定。

3.2 專屬性

取硫酸新霉素原料藥，加水稀釋成含硫酸新霉素0.4 mg/mL的溶液，作為供試品溶液。取上述溶液，分別經酸破壞(0.1 mol/L 三氟乙酸破壞10 min后，0.1 mol/L NaOH中和)、堿破壞(0.1 mol/L NaOH破壞10min后，0.1 mol/L 三氟乙酸中和)、氧化破壞(30% H2O2密閉環(huán)境放置1 h)、高溫(60 ℃、80 ℃水浴中水浴1 h)和光照破壞(254 nm紫外照射20 h)處理，結果見圖3。

結果表明，通過酸、堿、氧化、高溫、紫外光照射處理樣品后，照“2.1”項色譜條件下，主峰與雜質之間，以及雜質與雜質之間分離良好，在酸破壞條件下，新霉胺峰面積略有增加，表明該方法的專屬性良好。

3.3 線性及新霉胺校正因子

新霉素B：在0.14～27.89 μg/mL的質量濃度范圍內線性關系良好，線性回歸方程為Y=3.628 3X+1.952 6，r=0.998 5。

新霉素C：在0.14～4.69 μg/mL的質量濃度范圍內線性關系良好，線性回歸方程為Y=3.280 9X+0.081 4，r=0.999 6。

新霉胺：在0.36～12.11 μg/mL的質量濃度范圍內線性關系良好，線性回歸方程為Y=2.662 7X+1.405 2，r=0.998 0。

新霉素C對新霉素B的校正因子為1.11；新霉胺對新霉素B的校正因子為1.36。

因此，在計算有關物質中新霉胺的量時應采用加校正因子的自身對照法。樣品中存在的其他雜質，含量較低，對其進行單獨制備較為困難，另外從結構上看，基本含有新霉素的3個母環(huán)，推測這些雜質響應與新霉素B一致，故采用自身對照法對其他雜質進行計算。

Figure3 Chromatograms of specificity of HPLC-PAD

3.4 檢測限與定量限

當新霉素B與新霉素C質量濃度分別為0.07 μg/L時，信噪比均約為3；質量濃度分別為0.14 μg/mL時，信噪比均約為10，按進樣量25 μL換算，則新霉素B和新霉素C的檢測限均為1.75 ng，定量限均為3.5 ng。

3.5 重復性

取同一批號硫酸新霉素樣品6份以及新霉素標準品按照“2.2.4”項含量測定溶液方法配制，按照“2.1”項色譜條件進樣分析，新霉素B含量的RSD(n=6)為0.6%，新霉素C含量的RSD(n=6)為0.6%。

取同一批號硫酸新霉素樣品6份按照“2.2.5”項有關物質測定溶液方法配制，按照“2.1”項色譜條件進樣分析，各雜質的含量的RSD均符合要求，雜質總量RSD(n=6)為1.10%，方法重復性良好。

3.6 耐用性考察

取一批硫酸新霉素樣品，按“2.2.5”項下方法配制溶液，略微改變“2.1”項下色譜條件的參數如：柱溫、流速，分別進樣。各峰分離良好，方法的耐用性良好。

4 方法的應用

4.1 雜質譜研究

采用本研究建立的色譜條件，運用在線膜抑制技術[16]，實現了液質聯用，對硫酸新霉素中的雜質進行結構推定和來源分析，發(fā)現硫酸新霉素原料藥中除有新霉胺，還有核糖霉素、巴龍霉素及其異構體、巴龍霉胺、乙酰新霉胺、乙酰新霉素B及其異構體等其他雜質，主要降解雜質為新霉胺[17]，推定結果見表1。

Table1 Presumed results of mass spectrometry for impurities of neomycin sulfate

NumberPresumed resultsAImpurity related to neomycinBImpurity related to paromamycinCParomamineDUnknown 1ENeamineFAcetyl-neamineGRibostamycinHImpurity related to ParomamycinIUnknown 2JParomamycin IKParomamycin IILAcetyl-neomycin B isomerMAcetyl-neomycin B

4.2 有關物質測定結果

按“2.2.5”項下方法制備有關物質溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，有關物質典型色譜圖見圖4，結果見表2。有關物質除新霉胺外采用不加校正因子的主成分自身對照法計算。

Figure4 Typical chromatogram of related substances for neomycin sulfate

Table2 Result of related substance in 12 batches of raw materials

ManufacturersSamplenumberA/%B/%C/%D/%E/%F/%G/%H/%I/%J/%K/%L/%M/%Total/%Maximum single impurity*/%A10.220.060.680.070.310.710.190.200.210.750.200.480.284.28J(0.75)20.290.110.530.061.830.420.120.090.150.640.110.320.124.79E(1.83)30.170.111.110.141.021.340.240.210.181.020.270.630.556.69F(1.34)40.170.110.270.060.610.370.430.100.160.720.260.320.233.64J(0.72)50.230.100.340.050.340.480.300.130.161.070.650.370.344.48J(1.07)60.160.211.020.101.101.220.180.120.121.440.390.600.436.79J(1.44)B70.060.261.330.190.691.680.130.260.261.981.360.460.478.96J(1.98)80.060.231.390.190.641.930.130.300.171.951.460.480.719.47J(1.95)90.050.171.410.070.671.670.120.350.181.611.170.510.768.58F(1.67)100.030.251.030.140.671.820.100.210.151.050.650.690.887.50F(1.82)110.030.110.930.060.561.280.080.190.220.980.740.580.786.41F(1.28)120.050.150.960.060.751.440.110.200.141.060.750.620.856.94F(1.44)

A:Impurity related to neomycin;B:Impurity related to Paromamycin;C:Paromamine;D:Unknown 1;E:Neamine;F:Acetyl- neamine;G:Ribostamycin;H:Impurity related to Paromamycin;I:Unknown 2;J:Paromamycin I;K:Paromamycin II;L:Acetyl-neomycin B isomer;M:Acetyl-neomycin B

*:Maximum single impurity of sample

Tip:The sample of enterprise B was over effective period for the research

由兩個企業(yè)各6批共12批原料藥的檢測結果可見，各批次檢出來的雜質種類一致，僅雜質量不同，各批原料藥樣品的單個雜質量基本都大于0.1%，最大雜質多集中在巴龍霉素Ⅰ；部分批次乙酰新霉胺為最大雜質，其余新霉素相關雜質、巴龍霉素相關雜質和核糖霉素略低?？紤]本品為多組分發(fā)酵的抗生素，結合歐洲藥典雜質限度要求和樣品的實際測定情況，將雜質限度定為“新霉胺不得大于2.0%，單個雜質不得大于5.0%，雜質總量不得大于15.0%”。12批樣品有關物質結果均符合規(guī)定。

4.3 含量測定結果及量效一致性研究

按“2.2.4”項下方法制備含量測定溶液，按“2.1”項下色譜條件，用經標化的新霉素標準品以外標法計算新霉素B和新霉素C的量(以干燥品計)，測定結果見表3。

由于收錄硫酸新霉素的國內外藥典中含量測定方法均采用抗生素微生物檢定法，測定結果采用效價單位表示，而儀器法測得的含量為質量單位，兩個結果無法進行簡單的轉換，因此，需通過實驗得到量效轉換系數，再通過計算將質量含量轉換成效價含量，這一研究稱為量效一致性研究。參考USP[18-19]相關實驗指導原則及文獻[20]中關于硫酸慶大霉素的研究思路，采用本研究建立的HPLC-PAD法對12批樣品中新霉素B和新霉素C的質量含量進行測定，經新霉素B和新霉素C的量效轉換系數計算，轉換為效價含量后，與采用微生物鑒定法測定的效價值對比，經統計學分析無顯著性差異，表明含量測定結果真實可靠，完成了儀器測定法對微生物效價測定法的替代。

Table3 Result of content of neomycin sulfate in 12 batches of raw materials

BreedManufacturerSampleContent of neomycin C/%(By dry substance)Content of neomycin B/%(By dry substance)Neomycin sulfateA114.949.9215.950.7316.049.4411.654.2511.053.3615.549.2Neomycin sulfateB78.052.387.053.197.851.4109.450.8118.751.4128.851.4

Tip：The sample of enterprise B was over effective period for the research

5 討 論

5.1 色譜柱的選擇

相比于其他氨基糖苷類抗生素，硫酸新霉素的極性較大，在一般的ODS柱上保留較弱，EP9.0中有關物質測定方法流動相為含0.6%氫氧化鈉的2%三氟乙酸水溶液，不含有機相，pH約為1.2，對色譜柱的耐水性及耐酸性要求較高。本研究采用EP9.0的方法，考察了3種親水極性柱：Agilent Zorbax SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Waters Xselect T3(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Thermo AcclaimTMAmG C18(4.6 mm×250 mm，3 μm)對硫酸新霉素的分離情況。結果表明，Agilent Zorbax SB-Aq和Waters Xselect T3這兩根色譜柱對新霉素B、新霉素C及各雜質間的分離較差，且檢出的雜質個數少。Thermo AcclaimTMAmG C18色譜柱為Thermo公司專門針對氨基糖苷類抗生素開發(fā)的色譜柱，其對新霉素B、新霉素C及各雜質均能得到較好的分離，主峰峰形對稱，檢出的雜質個數較多，因此采用該色譜柱來進一步優(yōu)化硫酸新霉素HPLC-PAD檢測方法。

5.2 流動相的優(yōu)化

在重復EP9.0有關物質測定方法時，發(fā)現新霉素B與其前相鄰雜質分離不佳(圖5)。嘗試在流動相中降低三氟乙酸濃度，使新霉素B及其前相鄰雜質出峰變慢，以改善二者的分離度，但此時新霉素B又會包裹其后相鄰的雜質。同樣通過調整氫氧化鈉的濃度也未達到滿意的結果。參考硫酸依替米星[21-23]的研究思路，嘗試采用五氟丙酸替代三氟乙酸，但硫酸新霉素兩個主峰保留過強，分析時間太長。進一步在三氟乙酸存在的基礎上加入少量五氟丙酸，兩種離子對試劑對不同色譜峰保留時間形成協同影響，且因流動相中存在氫氧化鈉提高了pH，對峰型及各雜質間的分離均有改善。通過對兩種離子對試劑不同配比的考察，最終確定流動相為含0.01%五氟丙酸及0.6%氫氧化鈉的2%三氟乙酸溶液，在此條件下，新霉素B與前后相鄰雜質(雜質L、雜質M)的分離良好，其他雜質分離度均符合要求，并且比EP9.0方法多分離出雜質K，分離檢測能力有明顯改善。

Figure5 Chromatogram of related substances in EP9.0 by Thermo AcclaimTMAmG C18

6 結 論

本次建立的HPLC-PAD方法專屬性強、靈敏度高、重復性好，將方法用于實際樣品的有關物質及含量測定，方便快捷，結果準確可靠，該方法具有良好的應用前景，可以作為補充中國藥典硫酸新霉素標準的推薦方法。