芍藥苷調(diào)控JAK/STAT3通路干預(yù)HepG2細(xì)胞PD-L1表達(dá)的研究

萬南燕，蔣翠花，高 萌，張 健，殷志琦，潘 珂

(1中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院天然藥物化學(xué)系，南京 210009；2江蘇省中醫(yī)藥研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，南京 210028；3南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 南京 210028；4中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥制藥系&天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009)

肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最常見和最具侵襲性的腫瘤之一[1-2]。盡管多激酶抑制劑在分子治療方面取得了進(jìn)展，但晚期HCC的預(yù)后仍然很差，5年生存率為3%～11%[3]。免疫逃逸是腫瘤發(fā)展的重要因素，程序性死亡配體1(PD-L1)的過度表達(dá)參與腫瘤的免疫逃逸，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后不良密切相關(guān)[2,4]。PD-L1是PD-1的配體，在腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞上均表達(dá)，而PD-1主要在活化的T細(xì)胞上表達(dá)。PD-L1與PD-1的結(jié)合通過誘導(dǎo)T細(xì)胞的衰竭和凋亡來抑制T細(xì)胞效應(yīng)功能，導(dǎo)致免疫抑制狀態(tài)[5]。研究表明PD-L1/PD-1信號(hào)通路在T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，且針對(duì)PD-1/PD-L1的治療性阻斷已經(jīng)證實(shí)可以使部分腫瘤患者具有持久的抗腫瘤反應(yīng)[6-7]。目前HCC的免疫治療試驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)組織學(xué)證實(shí)的腫瘤自發(fā)性消退，但患者反應(yīng)率相對(duì)較低，并且基于抗體檢查點(diǎn)抑制劑的不良反應(yīng)和高成本限制了其應(yīng)用[8-9]。近年來，小分子抑制劑的研究逐步興起，天然小分子對(duì)PD-L1調(diào)控的研究也取得了一定進(jìn)展，挖掘潛在干擾PD-1/PD-L1表達(dá)的天然小分子可能是腫瘤治療的新領(lǐng)域[10-11]。

芍藥苷(paeoniflorin)是一種單萜葡萄糖苷，作為天然植物藥被廣泛使用。芍藥苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、肝臟和神經(jīng)保護(hù)、認(rèn)知障礙改善和抗高血糖效應(yīng)等藥理作用[12-13]。近年來臨床前研究表明芍藥苷對(duì)非小細(xì)胞肺癌、胃癌、肝癌和白血病等發(fā)揮抗腫瘤活性[14-15]，可通過調(diào)控PI3K/AK、JAK/STAT3、NF-κB等多種通路調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，抑制腫瘤生長(zhǎng)[16-17]。因此，推測(cè)芍藥苷可能通過JAK/STAT3通路調(diào)節(jié)PD-L1，參與腫瘤患者的免疫調(diào)控系統(tǒng)，增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答。因此，本研究擬通過IFN-γ誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞模型探究芍藥苷對(duì)PD-L1的調(diào)節(jié)作用及其作用機(jī)制。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

芍藥苷(HPLC面積歸一化法測(cè)定純度大于99%，四川維克奇生物科技有限公司)；胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)；DMEM、胰蛋白酶、噻唑蘭MTT(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；牛血清白蛋白(BSA)、IFN-γ(美國(guó)R&D公司)；PD-L1 ELISA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Protintech公司)、IL-2 ELISA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Novus公司)；PHA、PMA、Ruxolitinib(美國(guó)Sigma公司)；BCA蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)；二甲基亞砜DMSO、RIPA裂解液、PMSF、Anti-PD-L1抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；Trizol(美國(guó)Life Technologies公司)，引物、DEPC水(上海捷瑞生物工程有限公司)；SYBR Green Real-time PCR Master Mix、ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover[東洋紡(上海)生物科技有限公司]；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀 器

全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)；超速控溫離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)；熒光倒置顯微鏡(德國(guó)Carl Zeiss公司)；A101439電泳儀、QuantStudioTMDx Real-Time PCR循環(huán)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)自上海ATCC細(xì)胞庫。HepG2細(xì)胞用含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)，每隔3天用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，按1∶3比例進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)[18]。

2 方 法

2.1 PD-L1高表達(dá)模型建立和藥物溶解

IFN-γ 100 μg用去離子水500 μL溶解為0.2 mg/mL母液，然后用PBS稀釋為400 ng/mL儲(chǔ)備液，0.22 μm濾膜過濾待用。

取一定量的芍藥苷，先用DMSO溶解至一定濃度，使DMSO濃度不超過藥物最終使用濃度的0.1%，然后用DMEM稀釋至相應(yīng)濃度。

2.1.1 ELISA檢測(cè)IFN-γ對(duì)HepG2細(xì)胞PD-L1表達(dá)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后分別給予含有10、20、30 ng/mL IFN-γ的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，裂解細(xì)胞后收集上清液，用ELISA試劑盒測(cè)定上清液中PD-L1的含量。同時(shí)抽提各孔細(xì)胞總蛋白，采用BCA定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，以較正PD-L1濃度。

2.1.2 Real-time PCR檢測(cè)IFN-γ對(duì)HepG2細(xì)胞PD-L1表達(dá)的影響 HepG2細(xì)胞按照“2.1.1”項(xiàng)下方法處理后，PBS清洗細(xì)胞2次，用Trizol試劑提取細(xì)胞RNA，酶標(biāo)儀測(cè)定A260/280及其濃度。RNA在65 ℃條件下熱變性5 min后，立即置于冰上，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明配制體系，使RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)參數(shù)分別為：37 ℃，15 min；50 ℃，5 min；98 ℃，5 min。按照PCR試劑盒配制反應(yīng)體系后進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)為95 ℃，15 s；60 ℃，15 s；72 ℃，45 s。其中，95 ℃預(yù)變性60 s；共循環(huán)40次[19]。測(cè)得基因引物序列見表1。

2.1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IFN-γ對(duì)HepG2細(xì)胞PD-L1表達(dá)的影響 HepG2細(xì)胞按照“2.1.1”項(xiàng)下方法處理后，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞兩次，之后用胰酶消化收集離心后棄去上清液，細(xì)胞用0.1% BSA稀釋的一抗稀釋液(兔抗，1∶400) 100 μL重新懸浮，孵育1 h后，離心去上清液，用預(yù)冷PBS清洗兩遍后，加入用0.1% BSA稀釋的二抗稀釋液(抗兔，1∶8 000) 100 μL重新懸浮，孵育40 min后，離心去上清液，用預(yù)冷PBS清洗兩遍，加入PBS 50 μL重新懸浮后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PD-L1蛋白的表達(dá)。

2.2 MTT法檢測(cè)芍藥苷對(duì)HepG2細(xì)胞的活性的影響

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞，消化后以每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)基，加入不含血清的DMEM饑餓8 h后，分別給予1，5，10，20，40 μmol/L的芍藥苷，空白組加入不含血清的DMEM，孵育24 h后吸去培養(yǎng)基，每孔加入含5 mg/mL MTT的空白培養(yǎng)基100 μL，孵育4 h，吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸收度，計(jì)算細(xì)胞活力，實(shí)驗(yàn)平行3次。

2.3 檢測(cè)芍藥苷對(duì)HepG2細(xì)胞PD-L1表達(dá)的影響

2.3.1 ELISA檢測(cè)芍藥苷對(duì)HepG2細(xì)胞PD-L1表達(dá)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，分別設(shè)置空白組(Control)、模型組(Model)和芍藥苷給藥組(20 μmol/L)?？瞻捉M每孔加入空白DMEM培養(yǎng)基，模型組每孔加入30 ng/mL IFN-γ的DMEM培養(yǎng)基，給藥組每孔分別加入30 ng/mL IFN-γ和20 μmol/L 芍藥苷的DMEM培養(yǎng)基，孵育24 h后，裂解細(xì)胞后收集上清液，用ELISA試劑盒測(cè)定上清液中PD-L1的含量。同時(shí)抽提各孔細(xì)胞總蛋白，采用BCA定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，以較正PD-L1濃度。

2.3.2 Real-time PCR檢測(cè)芍藥苷對(duì)HepG2細(xì)胞PD-L1表達(dá)的影響 HepG2細(xì)胞按照“2.3.1”項(xiàng)下方法處理后，PBS清洗細(xì)胞2次，用Trizol試劑提取細(xì)胞RNA，酶標(biāo)儀測(cè)定A260/280及其濃度。RNA在65 ℃條件下熱變性5 min后，立即置于冰上，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明配制體系，使RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)參數(shù)分別為：37 ℃，15 min；50 ℃，5 min；98 ℃，5 min。按照PCR試劑盒配置反應(yīng)體系后進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)為95 ℃，15 s；60 ℃，15 s；72 ℃，45 s。其中，95 ℃預(yù)變性60 s；共循環(huán)40次。測(cè)得基因引物序列見表1。

Table1 Primer sequence for real-time PCR assay

GenePrimer sequencePD-L1Forward 5'-GGTGCCGACTACAAGCGAAT-3'Reverse 5'-AGCCCTCAGCCTGACATGTC-3'GAPDHForward 5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3'Reverse 5'-GCCATCACGCCACAGTTTC-3'

2.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)芍藥苷對(duì)HepG2細(xì)胞PD-L1表達(dá)的影響 HepG2細(xì)胞按照“2.3.1”項(xiàng)下方法處理后，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次，之后用胰酶消化收集離心后棄去上清液，細(xì)胞用0.1% BSA稀釋的一抗(1∶400) 100 μL重新懸浮，孵育1 h后，離心去上清液，用預(yù)冷PBS清洗兩遍后，加入用0.1% BSA稀釋的二抗(1∶800) 100 μL重新懸浮，孵育40 min后，離心去上清液，用預(yù)冷PBS清洗兩遍，加入PBS 50 μL重新懸浮后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PD-L1蛋白的表達(dá)。

2.4 T細(xì)胞和HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，以每孔1×105個(gè)接種于12孔板中，分別設(shè)置空白組(Control)、模型組(Model)和芍藥苷給藥組(20 μmol/L)。給藥后1 h加IFN-γ，孵育24 h 后，用PBS清洗兩遍后，Jurkat細(xì)胞按照每孔8×105個(gè)細(xì)胞加入孔中，加入10 μg/mL PHA+10 ng/mL PMA孵育24 h后，收集上清液和Jurkat細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min,分別檢測(cè)Jurkat細(xì)胞活性和上清液中IL-2的濃度。

2.5 Western blot分析

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，以每孔1×106個(gè)接種于6孔板中，分別設(shè)置空白組(Control)、模型組(Model)、芍藥苷給藥組(20 μmol/L)和抑制劑組?？瞻捉M每孔加入空白DMEM培養(yǎng)基，模型組每孔加入30 ng/mL IFN-γ的DMEM培養(yǎng)基，給藥組每孔分別加入30 ng/mL IFN-γ和20 μmol/L芍藥苷的DMEM培養(yǎng)基，孵育24 h后，PBS清洗細(xì)胞兩次，用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，收集后300 r/min離心5 min，分別加蛋白裂解液60 μL在冰上裂解30 min，吹打細(xì)胞數(shù)次，收集裂解液，12 000 r/min離心15 min，收集上清液，用BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。將蛋白質(zhì)樣品稀釋至相同且合適的濃度進(jìn)行SDS-PAGE電泳(電泳參數(shù)：85 V、20 min；120 V、80 min)，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上在5%脫脂奶粉封閉液中室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)于4 ℃過夜，后加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，采用電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法(ECL法)顯色。對(duì)感光膠片條帶進(jìn)行灰度分析，以目的條帶與內(nèi)參照條帶GAPDH的比值代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié) 果

3.1 HepG2細(xì)胞PD-L1高表達(dá)模型的建立

IFN-γ刺激HepG2細(xì)胞24 h后，ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示：30 ng/mL IFN-γ對(duì)于PD-L1的上調(diào)作用最為明顯(圖1)，PCR檢測(cè)結(jié)果證明IFN-γ對(duì)于PD-L1 mRNA的上調(diào)呈現(xiàn)劑量依耐性(圖2)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果也進(jìn)一步證明了這個(gè)結(jié)論(圖3)。

3.2 芍藥苷對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響

通過MTT檢測(cè)不同濃度的芍藥苷對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響。如圖4顯示，與正常對(duì)照組相比，1、5、10、20 μmol/L的芍藥苷處理后的細(xì)胞活力明顯大于90%，無明顯細(xì)胞毒性，故選擇20 μmol/L芍藥苷作為藥物安全濃度開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.3 芍藥苷對(duì)HepG2細(xì)胞PD-L1表達(dá)的影響

如圖5所示，與正常對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞PD-L1的表達(dá)水平顯著增加。加入芍藥苷后，PD-L1的表達(dá)受到抑制。ELISA檢測(cè)PD-L1與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果一致(圖6)，30 ng/mL IFN-γ處理的細(xì)胞PD-L1的蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著增加。與模型組相比，給予20 μmol/L的芍藥苷24 h后，給藥組HepG2細(xì)胞的PD-L1蛋白和mRNA的表達(dá)水平顯著降低(圖7)。

Figure3 Effect of IFN-γ on PD-L1 protein expression of HepG2 cells.HepG2 cells were treated with different concentration of IFN-γ for 24 h,and then PD-L1 was measured by flow cytometry
A：Control group；B：HepG2 cell treated with 10 ng/mL IFN-γ；C：HepG2 cell treated with 20 ng/mL IFN-γ；D：HepG2 cell treated with 30 ng/mL IFN-γ

Figure5 Effect of IFN-γ on PD-L1 protein expression of HepG2 cells.HepG2 cells were treated with different concentration of IFN-γ for 24 h,and then PD-L1 was measured by flow cytometry
A:Control group;B:HepG2 cell treated with 30 ng/mL IFN-γ;C:HepG2 cell treated with 20 μmol/L paeoniflorin in the absence or presence of 30 ng/mL IFN-γ for 24 h

3.4 芍藥苷對(duì)共培養(yǎng)體系中T細(xì)胞IL-2分泌的影響

為了檢測(cè)芍藥苷是否能夠逆轉(zhuǎn)PD-L1高表達(dá)的HepG2細(xì)胞對(duì)表達(dá)PD-1細(xì)胞的T細(xì)胞的抑制作用，將IFN-γ刺激的PD-L1高表達(dá)的HepG2細(xì)胞用芍藥苷20 μmol/L處理24 h后，與激活的Jurkat T細(xì)胞共孵育，24 h后分別收集上清和Jurkat T細(xì)胞，檢測(cè)IL-2的分泌水平和T細(xì)胞的增殖情況。如圖8和9所示，模型組較空白組，HepG2高表達(dá)PD-L1，顯著抑制T細(xì)胞的增殖活性，IL-2的分泌也受到抑制。加藥組與模型組相比，芍藥苷顯著逆轉(zhuǎn)了高表達(dá)PD-L1的HepG2細(xì)胞對(duì)高表達(dá)PD-1的T細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制作用，T細(xì)胞增殖活性顯著增強(qiáng)，IL-2的分泌水平也顯著提高。

3.5 芍藥苷對(duì)HepG2細(xì)胞中PD-L1、JAK和STAT3磷酸化水平的影響

與正常組相比，IFN-γ刺激下的模型組的PD-L1、JAK和STAT3的表達(dá)水平均顯著上升。芍藥苷干預(yù)后，PD-L1的表達(dá)顯著降低，與抑制劑作用結(jié)果類似。JAK、STAT3的磷酸化水平在芍藥苷作用后均有所降低(圖10)。

4 討 論

腫瘤免疫逃逸是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因之一，PD-L1表達(dá)上調(diào)是腫瘤細(xì)胞的常見免疫逃避策略[20]，并預(yù)示著腫瘤治療的預(yù)后不良。本研究采用IFN-γ刺激HepG2細(xì)胞24 h，成功建立PD-L1高表達(dá)模型，評(píng)價(jià)天然小分子芍藥苷對(duì)PD-L1的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)芍藥苷能夠顯著降低PD-L1的表達(dá)，降低JAK、STAT3的磷酸化水平，提示芍藥苷可能通過JAK/STAT3通路抑制PD-L1的表達(dá)，從而改善腫瘤免疫逃逸。

目前，靶向免疫檢查點(diǎn)PD-1/PD-L1和CTLA-4的抗體治療晚期肝細(xì)胞癌的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中，PD-1/PD-L1抗體nivolumab在晚期HCC中的Ⅰ/Ⅱ期試驗(yàn)中顯示出有利的結(jié)果，目前正在進(jìn)行兩項(xiàng)Ⅲ期研究比較PD-1/PD-L1抗體和激酶抑制劑索拉非尼在HCC患者一二線治療療效，臨床前研究數(shù)據(jù)明確了免疫檢查點(diǎn)抑制劑在腫瘤治療中的發(fā)展前景[23]，結(jié)果表明，抗PD-1抗體與局部治療或其他靶向分子相結(jié)合藥物是HCC的有效治療策略。因此，免疫檢查點(diǎn)抑制劑可以為HCC的治療打開新的大門。但PD-1/PD-L1檢查點(diǎn)抑制劑的高昂價(jià)格和所引起的嚴(yán)重免疫相關(guān)副反應(yīng)限制了其在HCC中的應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，天然小分子化合物如芹菜素、人參皂苷Rg3、雷公藤甲素、青藤堿等均能抑制PD-L1的表達(dá)，顯示了天然小分子下調(diào)PD-L1表達(dá)的潛力。

已有研究表明，實(shí)體瘤可通過上調(diào)腫瘤微環(huán)境中的IFN-γ誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)，從而抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答[5,24]。例如，肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系(HepG2，Hep3B和PLC)暴露于IFN-γ或IFN-α后PD-L1的表達(dá)顯著增加[25]。本研究發(fā)現(xiàn)采用IFN-γ刺激HepG2細(xì)胞，PD-L1蛋白和mRNA表達(dá)顯著增加，說明模型成立。文獻(xiàn)報(bào)道PD-1/PD-L1相互作用，引起T細(xì)胞凋亡和耗竭，抑制T細(xì)胞分泌IL-2，從而減弱T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[26]。本研究結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞經(jīng)IFN-γ刺激后高表達(dá)PD-L1，與活化的Jurkat細(xì)胞表達(dá)的PD-1結(jié)合，Jurkat細(xì)胞活性顯著下降，其分泌的IL-2較空白組相比顯著降低。加入芍藥苷干預(yù)后，T細(xì)胞增殖顯著增強(qiáng)，IL-2的分泌水平較模型組也顯著增加。由此說明芍藥苷能夠通過抑制PD-L1的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)PD-L1與PD-1結(jié)合后對(duì)T細(xì)胞活性的抑制作用。

JAK/STAT3信號(hào)通路對(duì)免疫反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化等都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子與激活非受體酪氨酸激酶JAK的膜受體結(jié)合，STAT轉(zhuǎn)錄因子被活化的JAK磷酸化并二聚化，后入核與相應(yīng)DNA片段結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[27]。STAT3作為腫瘤發(fā)生過程中的癌蛋白已被廣泛研究，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的不斷激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[28-29]。JAK/STAT3通路在多種癌癥中被證明與PD-L1的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)，STAT3能結(jié)合到PD-L1啟動(dòng)子區(qū)域從而調(diào)控PD-L1的表達(dá)[30]。文獻(xiàn)研究證實(shí)芍藥苷可通過調(diào)控STAT3表達(dá)抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞、胃癌細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞增殖[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷能顯著降低IFN-γ誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的PD-L1的高表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)JAK、STAT3的磷酸化水平，進(jìn)一步提示芍藥苷具有通過抑制JAK/STAT3信號(hào)通路達(dá)到抑制PD-L1表達(dá)的作用。

綜上所述，芍藥苷可能通過JAK/STAT3通路抑制PD-L1表達(dá)，從而發(fā)揮改善腫瘤免疫逃逸的作用，但仍需體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。