SPME-HPLC-MS同時檢測尿液中氯胺酮與MDMA及其體內(nèi)主要代謝物

劉 紅，李華云，龔 冶，孫 琴，4*，代 勇**

(1西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院；2西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部；3四川警察學(xué)院刑事科學(xué)技術(shù)系；4西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合藥物研究中心，瀘州 646000)

“搖頭丸”(3，4-亞甲二氧基甲基苯丙胺為主要成分)和“K粉”(氯胺酮)是吸毒人員經(jīng)?；旌衔车亩酒?，目前對混合毒品檢測的報道主要集中在對原料藥和繳獲毒品的分析測定方面[1]，對生物檢材中毒品的檢測大多針對單一毒品及其代謝物，其前處理通常采用液相萃取或固相萃取等方式[2]。近年來，固相微萃取作為一種快速便捷的提取方式，已廣泛用于生物樣品的前處理。在公安機(jī)關(guān)打擊毒品犯罪的實(shí)際工作中，尿液因其易于采集、無損害且能反映毒品在體內(nèi)代謝情況，已作為一種重要的生物物證，成為公安機(jī)關(guān)判斷吸毒嫌疑人是否吸食毒品的首選檢材[3]。目前，對混合毒品的檢測大多采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行檢測，對實(shí)驗條件有一定的要求。本研究采用固相微萃取-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，為此類混合毒品及其代謝產(chǎn)物的檢測提供新的檢測方法。

本研究以尿液中的氯胺酮與3，4-亞甲二氧基甲基苯丙胺(MDMA)及其主要代謝物去甲氯胺酮、3，4-亞甲二氧基苯丙胺(MDA)為檢測對象，以固相微萃取作為樣品前處理手段，并考察了其萃取條件，確定了HPLC-MS對尿液中氯胺酮、去甲氯胺酮、MDMA和MDA的檢測方法，希望為公安機(jī)關(guān)提供較為便捷、準(zhǔn)確的生物檢材中混合毒品的鑒別方法，同時也為其他混合毒品及其體內(nèi)代謝物的分析與檢測提供參考與借鑒。

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器及測試條件

儀器：Agilent-1200 Series液相色譜儀，配G6130A質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)；色譜柱為鍵合EC-C18柱(4.6 mm×100 mm，2.7 μm；美國Agilent公司)。萃取頭：85 μm聚丙烯(PA)、100 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)、60 μm聚二甲基硅烷-二乙烯基苯共聚物萃取頭(PDMS/DVB)、SPME進(jìn)樣器、CORNING固相微萃取采樣臺(美國Supelco公司)；GPA224S萬分之一分析天平(德國Sartorius公司)；KH3200E型超聲清洗儀(上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司)。

色譜條件：采用EC-C18柱(4.6 mm×100 mm，2.7 μm)色譜柱，以0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)作為流動相，梯度洗脫：0～6 min，70%A→30%A，6～7 min，30%A→10%A，保持3 min。流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，柱溫40 ℃。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧電離源正離子掃描(ESI+)，SIM監(jiān)測模式；干燥氣(N2)流速：10 L/min，干燥器溫度：350 ℃，霧化電壓3 kV，數(shù)據(jù)采集0～10 min，待檢測物的SIM監(jiān)測離子和碰撞能見表1。

Table1 SIM of analyte monitor ions and collision energy

DrugParent ions/(m/z)Product ions/(m/z)Collision energy/eVKetamine238.1179*18Norketamine224.1207*15MDMA194.1163*15MDA180.1163.1*11

*Quota ion

MDMA:3,4-Methylenedioxymethamphetamine;MDA:3,4-Methylenedioxyamphetamine

1.2 藥品與試劑

對照品氯胺酮、去甲氯胺酮、MDMA、MDA(均為甲醇液，質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL)均由瀘州市公安局提供。甲醇、乙腈均為色譜純，鹽酸、碳酸鈉和氫氧化鈉等其余試劑均為分析純，水為純化水。

對照儲備溶液的制備：分別取氯胺酮、去甲氯胺酮、MDMA、MDA標(biāo)準(zhǔn)品甲醇液1 mL，稀釋為100 mL，置于4 ℃冰箱保存。

1.3 實(shí)驗動物

清潔級別大鼠，重量(200±10)g，雌雄各半，西南醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗中心提供(使用許可證號：SCXK(川)2018-17)。給藥前禁食不禁水12 h，灌胃給藥。

1.4 尿液樣品的制備

取健康人空白尿液10 mL，分別添加氯胺酮、去甲氯胺酮、MDMA和MDA對照儲備液，配制成氯胺酮、去甲氯胺酮、MDMA、MDA均為1 μg/mL的毒品尿液樣品，備用。

1.5 操作方法

取尿液樣品5 mL于10 mL樣品瓶中，用1.25 mol/mL HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至11，加入Na2CO30.5 g，放入磁攪拌子，擰緊瓶蓋，將樣品瓶置于SPME專用采樣臺上于60 ℃下加熱攪拌，同時將經(jīng)老化過的含60 μm聚二甲基硅烷-二乙烯基苯共聚物萃取頭(PDMS/DVB)的SPME針管插入樣品瓶中，推出萃取纖維頭，使之浸入樣品液中萃取15 min后取出，再將SPME針管插入SPME/HPLC接口解吸池中解析1 min后，進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱及流動相的考察

預(yù)實(shí)驗中比較了C18柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)和C18柱(4.6 mm×100 mm，2.7 μm)的檢測效果，發(fā)現(xiàn)因所檢測的氯胺酮和MDMA等物質(zhì)含有胺基和羰基等基團(tuán)，為中等偏強(qiáng)極性物質(zhì)，所以其保留時間較短，均在0.6 min左右出峰，為了提高分離效果，最終選擇了EC-C18柱(4.6 mm×100 mm，2.7 μm)作為分析柱。

氯胺酮、去甲氯胺酮、MDMA和MDA的保留時間、分離度和峰行受流動相體系及其PH的影響。本實(shí)驗分別考察了甲醇/乙腈-水、甲醇/乙腈-甲酸水溶液、甲酸乙腈-水溶液和甲酸乙腈-甲酸溶液體系等作為流動相。結(jié)果表明，在酸性條件下，有助于化合物母離子的形成。比較甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.1%、0.2%、0.3%時，發(fā)現(xiàn)增大甲酸濃度對化合物檢測靈敏度影響不大，因此，最終選擇甲醇和0.1%甲酸水溶液體系作為流動相。

按以上色譜柱與流動相對混合毒品進(jìn)行檢測，氯胺酮、去甲氯胺酮、MDMA和MDA的保留時間分別為6.52、6.60、4.99、5.03 min，見圖1。

Figure1 SIM chromatogram of ketamine,norketamine,MDMA,and MDA
A:Ketamine,m/z238.1;B:Ketamine,m/z179;C:Norketamine,m/z224.1;D:Norketamine,m/z207;E:MDMA,m/z194.1;F:MDMA,m/z163;G:MDA,m/z180.1;H:MDA,m/z163.1

2.2 固相微萃取前處理影響因素考察

2.2.1 萃取纖維種類和萃取模式考察 在實(shí)驗中主要選擇了3種不同極性且適合于HPLC進(jìn)樣分析的萃取頭進(jìn)行考察：85 μm聚丙烯(PA) 、100 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)、60 μm聚二甲基硅烷-二乙烯基苯共聚物萃取頭(PDMS/DVB)，在相同的萃取條件下進(jìn)行直接浸入式(DI-SPME)萃取，以峰面積大小作為萃取效果的評價指標(biāo)，結(jié)果表明，由于PA萃取頭對強(qiáng)極性的物質(zhì)富集效果更好，PDMS萃取頭對弱極性物質(zhì)的萃取效果更好，故這兩種萃取頭的萃取效率略低。比較而言，PDMS/DVB共聚物極性介于前兩者之間，且適合于對胺類化合物的提取，故其萃取效率較前兩者高。

固相微萃取分為直接浸入模式(DI-SPME)和頂空模式(HS-SPME)兩種方式，由于本次檢測目的是以HPLC為檢測手段對兩種毒品在體內(nèi)的微量原型物和代謝物樣品進(jìn)行分析，故選用直接浸入模式，提高萃取效率。

2.2.2 萃取溶液酸堿度考察 本次檢測的4種物質(zhì)均為弱堿性，因此在堿性條件下，有利于減少其在基質(zhì)中的電離度和溶解度，促進(jìn)其從基質(zhì)中解析出，提高萃取率。為此，本研究考察了pH為9，10，11，12，13的不同條件下，對萃取效果的影響。隨著pH的增加，各物質(zhì)的萃取率均存在不同程度的上升，在pH為11以后時，4種物質(zhì)的萃取率基本保持恒定，且尿液基質(zhì)中開始出現(xiàn)少許沉淀(可能在較強(qiáng)堿性條件下，其中的蛋白質(zhì)成分變性所致)，故選擇萃取酸堿度為pH 11。

2.2.3 萃取溫度和時間考察 查閱相關(guān)文獻(xiàn)[4]，發(fā)現(xiàn)溫度對萃取效果有較大的影響，其機(jī)制是通過改變目標(biāo)成分在溶液與萃取介質(zhì)間的分配系數(shù)，從而影響萃取纖維對目標(biāo)成分的吸附效率。隨著溫度升高，溶液中目標(biāo)成分的熱運(yùn)動增加，目標(biāo)成分的分子向萃取纖維擴(kuò)散的概率大大提高，從而達(dá)到富集目標(biāo)成分的目的。但是，當(dāng)溫度過高時，將導(dǎo)致萃取纖維中的目標(biāo)成分向溶液中擴(kuò)散，破壞了分配平衡，這種反相擴(kuò)散有可能導(dǎo)致萃取的效率銳減。因此，在實(shí)驗過程中，須篩選適宜的溫度，才能取得較好的萃取效果。

在30～70 ℃區(qū)間范圍內(nèi)，以10 ℃遞增進(jìn)行萃取溫度條件考察，其結(jié)果如圖2所示，4種目標(biāo)物質(zhì)的萃取效率隨著溫度改變呈現(xiàn)先上升后下降的現(xiàn)象，因各物質(zhì)結(jié)構(gòu)間存在差異，其最佳萃取溫度并不一致，綜合考慮具體情況，選擇萃取溫度為60 ℃，同時，在萃取時加入攪拌子以增加待測物質(zhì)在基質(zhì)溶液中的熱運(yùn)動，改善萃取平衡系數(shù)。

目標(biāo)物質(zhì)在基質(zhì)溶液與萃取介質(zhì)間的平衡時間受其物理化學(xué)性質(zhì)(如化學(xué)結(jié)構(gòu)、在兩相間的分配系數(shù)等)、基質(zhì)條件和萃取介質(zhì)吸附特性等多種因素決定，萃取時間短，介質(zhì)吸附不充分，未達(dá)到分配平衡，目標(biāo)物回收率較低，萃取時間過長，實(shí)驗費(fèi)時，達(dá)不到優(yōu)化實(shí)驗條件的目的。

在5～25 min區(qū)間內(nèi)，以每5分鐘為一檢測點(diǎn)，峰面積為檢測指標(biāo)，選擇合適的萃取時間，其結(jié)果如圖3所示。由于4種目標(biāo)物質(zhì)相對分子質(zhì)量較小，在基質(zhì)與萃取介質(zhì)間的能較快地達(dá)到平衡，故選擇萃取時間為15 min。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍及檢測限 取空白尿液檢材5份，添加氯胺酮、去甲氯胺酮、MDMA、MDA對照品，用流動相稀釋，配制成0.03、0.20、0.50、0.75和1.0 μg/mL系列質(zhì)量濃度對照品的尿液樣本，按以上所述實(shí)驗方法進(jìn)行目標(biāo)物提取與檢測分析，以待測物定量離子峰面積Y為縱坐標(biāo)，以所配制的系列對照品濃度X為橫坐標(biāo)，匯制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到4種待測物的線性方程、其各自的相關(guān)系數(shù)r和最低檢出限(檢測時信噪比為S/N=3)見表2。結(jié)果表明，4種待測物在0.03～1.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

Table2 Linear equations,correlation coefficient and detection limit (S/N,n=3)

AnalyteLinear regression equationrDetection limit/(ng/mL)KetamineY=5.527×104X-4.150×10-10.999 211.2NorketamineY=7.769×104X-8.998×10-10.999 110.8MDMAY=3.000×105X-6.103×10-20.998 913.6MDAY=3.850×105X-1.266×10-20.998 514.3

2.3.2 加樣回收試驗及精密度考察 取空白尿液，分別加入高、中、低3個濃度的對照品，配制成5個平行樣品，按照“1.1”、“1.5”項下進(jìn)行檢測分析，連續(xù)測定3 d，并記錄色譜峰面積，計算氯胺酮、去甲氯胺酮、MDMA、MDA的日內(nèi)、日間精密度，結(jié)果如下表3所示。

在4種待測物線性方程范圍內(nèi)，取高、中、低3個濃度分別添加對照品，配制成5個平行樣本檢材，然后按“1.1”、“1.5”項下進(jìn)行樣品處理、分析。以所添加待測物的峰面積與相同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積之比值計算回收率(結(jié)果見表3)。

Table3 Results of recovery and reproducibility test (n=5)

Compoundc/(μg/mL)RSD within day/%Inter-day RSD/%Average recovery/%Ketamine0.054.215.35103.440.201.652.33101.261.003.774.26102.18Norket-amine0.055.696.32101.850.202.313.6699.861.004.786.46104.38MDMA0.056.808.1797.190.203.685.0699.321.007.328.96102.88MDA0.054.796.2898.270.202.963.95101.631.008.559.13105.44

2.4 樣品分析

據(jù)文獻(xiàn)文獻(xiàn)[5-6]報道，大鼠以氯胺酮290 mg/kg灌胃給藥后，出現(xiàn)急性中毒現(xiàn)象，大鼠灌胃給藥150 mg/kg MDMA后，也同樣出現(xiàn)急性中毒。根據(jù)現(xiàn)在毒品的吸食模式，綜合考慮動物生命周期，取喂食“K粉”與“搖頭丸”粉末(“搖頭丸”研磨成粉狀)(氯胺酮按280 mg/kg灌胃，MDMA按140 mg/kg灌胃)的急性中毒大鼠24 h內(nèi)自然排泄尿液樣品5 mL，按以上所述試驗方法進(jìn)行檢驗，檢材中分別出現(xiàn)與對照品相對應(yīng)的質(zhì)譜圖，因此可認(rèn)定檢材中存在氯胺酮、去甲氯胺酮、MDMA和MDA 4種成分。進(jìn)一步測定得出該尿液樣本中的氯胺酮、去甲氯胺酮、MDMA和MDA的含量分別為2.02、3.01、1.05、1.98 μg/mL。

3 結(jié) 論

本試驗采用SPME-HPLC-MS法對尿液中的“K粉”與“搖頭丸”混合毒品及其體內(nèi)主要代謝產(chǎn)物進(jìn)行了定性和定量分析，本方法操作便捷，結(jié)果準(zhǔn)確，可為公安機(jī)關(guān)對吸毒嫌疑人的尿液等生物樣品進(jìn)行檢測提供新的方法，為公安機(jī)關(guān)打擊毒品犯罪提供法庭證據(jù)。