Hippo信號(hào)通路在頸動(dòng)脈結(jié)扎所致大鼠動(dòng)脈血管重構(gòu)中的表達(dá)及其意義*

朱 寧， 陳 皓， 趙旭勇， 葉凡豪， 王 毅

(溫州醫(yī)科大學(xué)第三臨床學(xué)院， 溫州市人民醫(yī)院， 浙江 溫州 325000)

冠狀動(dòng)脈疾病(coronary artery disease，CAD)是指冠狀動(dòng)脈粥樣硬化致使冠狀動(dòng)脈管腔堵塞及發(fā)生功能性改變的一類疾病。它是導(dǎo)致病人發(fā)生心絞痛，心肌梗死，心力衰竭以及猝死的根本病因[1]。目前介入治療是公認(rèn)的治療冠狀動(dòng)脈疾病的有效方法。目前支架內(nèi)再狹窄仍然是阻礙CAD治療進(jìn)展的主要原因，還需進(jìn)一步尋找能減少支架內(nèi)再狹窄的藥物或者方法[2-3]。支架內(nèi)再狹窄的本質(zhì)問題正是血管的不良重構(gòu)，目前頸動(dòng)脈結(jié)扎或者球囊損傷的模型被廣泛應(yīng)用于血管重構(gòu)的研究。雖然轉(zhuǎn)基因小鼠及大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型已經(jīng)被廣泛用于藥物靶點(diǎn)的研究，但是大鼠頸動(dòng)脈結(jié)扎致血管重構(gòu)模型對(duì)于藥物靶點(diǎn)的研究和后續(xù)藥物的開發(fā)仍然具有重要的意義。之前大鼠和小鼠頸動(dòng)脈重構(gòu)的模型多應(yīng)用球囊進(jìn)行血管內(nèi)的損傷，這就需要特殊的介入材料，而且手術(shù)操作難度較高，需要操作者反復(fù)練習(xí)[4]。在本研究中我們擬建立操作更方便，效果良好的大鼠頸動(dòng)脈結(jié)扎模型，以用于血管重構(gòu)的進(jìn)一步研究。Hippo信號(hào)通路是近年來發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)細(xì)胞大小以及穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵信號(hào)途徑。Hippo信號(hào)通路能對(duì)于眾多細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的信號(hào)產(chǎn)生調(diào)節(jié)效應(yīng)，包括細(xì)胞-細(xì)胞接觸、細(xì)胞極性、G蛋白偶聯(lián)受體的配體，細(xì)胞能量狀況。Hippo信號(hào)通路通過抑制YAP和TAZ轉(zhuǎn)錄共激活因子來調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡和干性。Hippo信號(hào)通路促進(jìn)諸多癌癥發(fā)生發(fā)展的作用已經(jīng)得到了明確[5]。也有越來越多的研究開始關(guān)注Hippo信號(hào)通路在心血管疾病中的作用。目前的研究表明Hippo信號(hào)通路的激活能促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，但是Hippo信號(hào)通路在大鼠頸動(dòng)脈結(jié)扎介導(dǎo)的血管重構(gòu)中的表達(dá)以及意義尚不明確。本研究旨在建立新的大鼠頸動(dòng)脈結(jié)扎致血管重構(gòu)模型，同時(shí)探討Hippo信號(hào)通路的主要效應(yīng)因子YAP和TAZ在該模型中的表達(dá)以及可能的意義。

1 材料與方法

1.1 主要?jiǎng)游锱c試劑

60只(250～280 g)健康雄性SD大鼠購買自上海動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)購買自Sigma公司；磷酸酶抑制劑購買自Cell Signaling Technology公司；HE以及MASSON試劑盒購買自北京索萊寶科技有限公司；YAP (Yes Associated Protein), TAZ (Transcriptional Coactivator With PDZ-Binding Motif)、PCNA (proliferating cell nuclear antigen)，GAPDH，TEAD1一抗購買自Cell Signaling Technology公司，Bcl-2-like protein 4 (Bax)、Bcl-2-like protein 4 (Bax)一抗購買自Abcam公司、anti-α smooth muscle actin (α-SMA)購買自Sigma公司，鼠以及兔二抗購買自Cell Signaling Technology公司；RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒以及Diaminobenzidine (DAB)購買自碧云天公司。

1.2 大鼠頸動(dòng)脈結(jié)扎模型的建立及分組設(shè)計(jì)

所以SD大鼠隨機(jī)分為 2組：對(duì)照組(n=40)和模型組(n=20)。使用戊巴比妥(60 mg/kg)一次性腹腔注射麻醉大鼠，模型組經(jīng)頸部正中切口游離出左側(cè)頸總動(dòng)脈，用6-0不可吸收線在盡量靠近近心端處結(jié)扎，完全阻斷血流。對(duì)照組僅將手術(shù)線穿過頸總動(dòng)脈而不結(jié)扎，閉合切合。14 d后處死所有動(dòng)物，經(jīng)原手術(shù)路徑分離頸總動(dòng)脈，收集結(jié)扎處至遠(yuǎn)心端的動(dòng)脈。所有血管經(jīng)生理鹽水漂洗，根據(jù)后續(xù)處理在-80℃冰箱凍存，或者在福爾馬林中固定。

1.3 HE和MASSON染色檢測(cè)

血管固定于4%多聚甲醛過夜，隨后用分級(jí)乙醇脫水，用二甲苯脫脂，用石蠟包埋，連續(xù)切片(4 μm)。隨后玻璃片在二甲苯中脫蠟，并通過磷酸鹽緩沖鹽水(pH 7.2～7.4)洗滌以及酒精梯度脫水。HE及MSASSON染色步驟按試劑盒說明進(jìn)行，最后在光學(xué)顯微鏡下觀察血管組織的變化。image J軟件用于檢測(cè)新生內(nèi)膜/中膜區(qū)域比例。

1.4 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)增殖

血管石蠟切片后(4 μm)，進(jìn)行脫蠟和水化，然后進(jìn)行PBS(pH 7.2 - 7.4)漂洗。在PBS(pH 7.2 ～ 7.4)中用高壓鍋10 min進(jìn)行抗原修復(fù)。用5% BSA封閉后，用抗PCNA抗體(1∶100)、α-SMA、抗YAP抗體(1∶100)、抗TAZ抗體(1∶100)、抗體(1∶400)在4℃過夜孵育，再用HRP結(jié)合的第二抗體(1∶200)孵育。然后用光鏡(400×放大，尼康，日本)對(duì)染色切片進(jìn)行觀察。

1.5 Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)

取出存于-80℃的血管組織，用蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑保存在裂解緩沖液中，然后立即在液氮中冷凍，直至均勻化。用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)量上清液的蛋白濃度。用10%～12%的SDS-PAGE分離相同量的蛋白質(zhì)(50 μg)，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5% BSA封閉，在4°C與一抗孵育過夜。GAPDH作為內(nèi)對(duì)照。用HRP偶聯(lián)的抗兔或抗小鼠IgG作為第二抗體(1∶1 000)檢測(cè)免疫反應(yīng)帶。然后通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光儀器檢測(cè)蛋白條帶。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 建模存活率

實(shí)驗(yàn)組 40 只大鼠中1只因麻醉過量死亡，2只術(shù)后14 d內(nèi)死、最終存活大鼠37 只，存活率 92.5%。平均手術(shù)時(shí)間(10.26±3.86)min。

2.2 HE觀察頸動(dòng)脈重構(gòu)

實(shí)驗(yàn)組病理檢查均出現(xiàn)內(nèi)膜增生增厚，成活的大鼠均造模成功。血管切片HE染色后顯微鏡檢測(cè)及image J軟件檢測(cè)大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)膜 / 中膜面積比(I/M)的比較結(jié)果：血管切片形態(tài)學(xué)顯微鏡檢測(cè)(圖1)，模型組大鼠頸總動(dòng)脈 I/M的比值(1.52± 1.00)顯著高于對(duì)照組(0.73±0.09，P<0.01)。

Fig.1Morphological changes were observed by HE staining (original magnification ×40)

**P<0.01vscontrol group

2.3 MASSON染色觀察頸動(dòng)脈

血管切片MASSON染色提示，模型組比對(duì)照組藍(lán)色的膠原纖維明顯增多(圖2)，結(jié)果提示模型組頸總動(dòng)脈纖維化明顯。

Fig.2Fibrosis was observed by Masson staining (original magnification ×40)

2.4 大鼠頸總動(dòng)脈PCNA及α-SMA蛋白表達(dá)情況

血管切片免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組PCNA以及α-SMA蛋白比對(duì)照組明顯上調(diào)(圖 3)，提示結(jié)扎介導(dǎo)了頸總動(dòng)脈中層的平滑肌細(xì)胞增殖顯著增加。

Fig.3PCNA and α-SMA were evaluated by immunohistochemical staining (original magnification ×40)

2.5 大鼠頸總動(dòng)脈YAP，TAZ以及TEAD1蛋白表達(dá)情況

與對(duì)照組相比，Western blot檢測(cè)提示模型組YAP，TAZ及TEAD1的表達(dá)明顯上調(diào)(圖4，表 1)。

Fig.4The expression of YAP, TAZ and TAED1 were evaluated by Western blot

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

GroupYAP/GAPDHTAZ/GAPDHTEAD1/GAPDHControl0.15±0.030.23±0.050.13±0.02Model0.31±0.03*0.38±0.02**0.27±0.03*

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.6 大鼠頸總動(dòng)脈Bax，Bcl-2蛋白表達(dá)情況以及Bax/Bcl-2比值的變化

與對(duì)照組相比，Western blot檢測(cè)提示模型組中促進(jìn)凋亡的Bax降低，抑制凋亡的Bcl-2明顯增加以及Bax/Bcl-2比值明顯降低(圖5，表 2)。

Fig.5The expression of Bax, Bcl-2 were evaluated by Western blot

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

GroupBax/GAPDHBcl-2/GAPDHBax/Bcl-2Control0.86±0.090.80±0.091.08±0.16Model0.47±0.12*1.38±0.07**0.34±0.01*

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

3 討論

雖然隨著介入治療器械的不斷發(fā)展，但是支架內(nèi)再狹窄仍然是阻礙CAD治療進(jìn)展的主要原因。然而永久性支架的存在始終是導(dǎo)致冠脈內(nèi)皮化的延遲和不完全所致的刺激因素，血管損傷將持續(xù)不斷地刺激平滑肌細(xì)胞的增殖遷移，導(dǎo)致血管的異常重構(gòu)。同時(shí)也促進(jìn)冠脈內(nèi)血栓的形成，最終還是使得晚期支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生率顯著增加[6-7]。通常情況下在成熟血管中平滑肌細(xì)胞極少處于增殖狀態(tài)以及表現(xiàn)出分泌活性[8]。但是在應(yīng)對(duì)血管損傷，炎癥，血流剪切力增加的時(shí)候，由于各種生長因子釋放明顯增加，同時(shí)促進(jìn)增殖的相關(guān)信號(hào)通路明顯的激活，而抑制增殖的信號(hào)通路受到了抑制[9-10]。比如同型半胱氨酸以及血小板源性生長因子都可以誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的增殖以及遷移，這是研究平滑肌細(xì)胞功能的基本方法[11-12]。

平滑肌細(xì)胞因各種刺激處于活躍的增殖和遷移狀態(tài)時(shí)會(huì)促進(jìn)血管重構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致官腔狹窄，最終產(chǎn)生相應(yīng)的病變[13]。因此，如何抑制平滑肌細(xì)胞的異常增殖，防止血管重構(gòu)以及再狹窄的發(fā)生，是目前心血管疾病研究的一個(gè)熱點(diǎn)問題。

雖然小鼠的頸動(dòng)脈結(jié)扎和損傷模型已經(jīng)廣泛應(yīng)用于血管重構(gòu)的研究，但是大鼠模型仍有其不可替代的地位，特別是臨床前的藥物篩選。之前的研究表明不管是大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型或者顯微外科手術(shù)建立的模型，對(duì)于操作以及設(shè)備和材料等要求都較高，特別是外科手術(shù)的方法應(yīng)用很少[4]。在本研究中我們建立了結(jié)扎介導(dǎo)的大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜新生模型，該模型具有操作簡(jiǎn)單，模型優(yōu)良等特點(diǎn)。HE以及MASSON染色提示造模組血管重構(gòu)明顯，免疫組化表明代表細(xì)胞增殖的標(biāo)志物PCNA以及平滑肌特異性的標(biāo)志物α-SMA表達(dá)明顯增高，說明大鼠頸動(dòng)脈中層平滑肌細(xì)胞增殖明顯，進(jìn)而促進(jìn)血管重構(gòu)。

許多基于模式生物的研究已經(jīng)明確Hippo通路是調(diào)節(jié)器官大小和組織穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵信號(hào)途徑。近年的研究揭示,Hippo通路在器官大小的控制上具有重要的作用。Hippo通路中的Hpo、SAV、WTS和MAT在基因和生理上相互作用，其突變引起顯著的器官增大表型在其他已建立的發(fā)育信號(hào)途徑中是前所未有的。因此，它們被歸類為一種新的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊：以河馬的巨大體型命名的Hippo信號(hào)通路。對(duì)于一系列細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的刺激，Hippo信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡和干性[14]。轉(zhuǎn)錄共激活劑YES相關(guān)蛋白(YAP)和轉(zhuǎn)錄共激活子與PDZ結(jié)合基序(TAZ)是Hippo途徑中進(jìn)化保守的關(guān)鍵效應(yīng)因子，目前認(rèn)為正是通過抑制YAP/TAZ共激活因子，進(jìn)而調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄來實(shí)現(xiàn)Hippo途徑調(diào)控的生物學(xué)功能。除了調(diào)節(jié)正常的細(xì)胞以及腫瘤的形態(tài)大小和穩(wěn)態(tài)，最近有文獻(xiàn)提示,Hippo信號(hào)通路中MST通過上調(diào)caspase 3促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的凋亡，所以MST的降低導(dǎo)致了小鼠頸動(dòng)脈球囊損傷介導(dǎo)的血管重構(gòu)[15]。同時(shí)也有研究表明YAP和TAZ能夠調(diào)控促有絲分裂基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)毛喉素介導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖和遷移[16]。這些研究表明YAP/TAZ在促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖中的重要作用。在本研究中,我們也發(fā)現(xiàn)結(jié)扎介導(dǎo)的頸動(dòng)脈狹窄模型中，在中層的平滑肌細(xì)胞中YAP和TAZ表達(dá)明顯上調(diào)，結(jié)合其他增殖標(biāo)志物的表達(dá)升高，說明它們可能是促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵信號(hào)分子。然而YAP和TAZ不含其自身的DNA結(jié)合基序，主要通過與DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子相互作用而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。最近的研究已經(jīng)表明,YAP和TAZ主要是通過與DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子TEAD1結(jié)合介導(dǎo)下游促增殖基因的表達(dá)[17]。沉默TEAD能阻斷大部分YAP誘導(dǎo)的基因表達(dá)，并在很大程度上減弱YAP誘導(dǎo)的過度生長表型。此外，TEAD1/2基因缺失的小鼠的表型類似于YAP基因缺失的小鼠。Bax可以促進(jìn)cleaved caspases-3和cleaved PAPR的表達(dá)從而促進(jìn)凋亡，而Bcl-2可以抑制Bax的表達(dá)從而抑制凋亡, bax/bcl-2比值的下調(diào)說明促進(jìn)細(xì)胞的增殖。YAP/TAZ可以促進(jìn)TEAD入核，介導(dǎo)Bcl-2以及下游的cleaved caspases-3和cleaved PAPR的表達(dá)促進(jìn)增殖。本研究同樣也證明TEAD1在模型組中表達(dá)上調(diào)，同時(shí)伴隨著其所調(diào)控的下游蛋白bax/bcl-2比例下調(diào)。研究結(jié)果表明YAP和TAZ可能通過結(jié)合TEAD1入核介導(dǎo)，促進(jìn)增殖凋亡相關(guān)的bax/bcl-2比值改變促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖。

Hippo信號(hào)通路在生物發(fā)育，穩(wěn)態(tài)，腫瘤中的作用已經(jīng)被充分地證明，未來在心血管疾病中也可能被證實(shí)發(fā)揮著巨大的作用。YAP和TAZ是Hippo信號(hào)通路主要的效應(yīng)分子，但是目前尚缺少YAP和TAZ有效的直接抑制劑。本研究證明大鼠頸動(dòng)脈結(jié)扎模型中Hippo信號(hào)通路明顯激活，這與血管重構(gòu)的發(fā)生相一致，結(jié)果有助于在動(dòng)物水平上研究以YAP和TAZ為靶點(diǎn)的藥物。