枸杞多糖對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制*

潘 虹， 施 真， 楊泰國(guó)， 于臘梅， 徐愛麗

(1. 濱州醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 山東 煙臺(tái) 264003； 2. 平邑縣人民醫(yī)院骨科， 山東 平邑 273300)

隨著我國(guó)生活水平的提高，糖尿病(diabetes mellitus, DM)的發(fā)病率日漸增加，其死亡率位于心血管疾病和腫瘤之后，列第三位，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的重大公共衛(wèi)生問題。糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病眼部并發(fā)癥中嚴(yán)重的致盲病變，是導(dǎo)致患者失明致盲的主要原因[1]。研究發(fā)現(xiàn)在DR病人和動(dòng)物模型中均存在體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的明顯升高[2-4]，而且DR中出現(xiàn)臨床可見的視網(wǎng)膜微血管病理改變之前即有視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的功能損傷，高糖所造成的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡的主要原因之一。目前單純降血糖的治療并不能有效阻斷視網(wǎng)膜的損害，所以亟待尋求一種有效的藥物來(lái)對(duì)抗氧化應(yīng)激、保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的正常功能，延緩DR的進(jìn)展。

枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides, LBP)是枸杞子最主要的活性成分。研究表明LBP具有抗氧化和降血糖的作用[5,6]，在鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)誘導(dǎo)的糖尿病鼠和老齡鼠中LBP可保護(hù)多種組織對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷[7,8]，而且LBP能夠有效的改善糖尿病視網(wǎng)膜各層組織的病理?yè)p傷[6]，但是其分子機(jī)制尚未完全闡明。有研究發(fā)現(xiàn)，LBP可通過(guò)促進(jìn)內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)的生成，如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)等來(lái)增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力[9,10]。但是NF-E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)/血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)這一機(jī)體重要的抗氧化通路是否參與LBP對(duì)DR的保護(hù)效應(yīng)尚未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究以STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，觀察LBP對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

STZ購(gòu)自Sigma；LBP購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司；二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)購(gòu)自Invitrogen；BCA法蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自普利萊基因技術(shù)有限公司；兔抗RBPMS多克隆抗體購(gòu)自ProSci Incorporated；山羊抗ChAT多克隆抗體購(gòu)自Millipore；兔抗Nrf2多克隆抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體、山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗鼠IgG-HRP均購(gòu)自Santa Cruz；兔抗HO-1多克隆抗體購(gòu)自Enzo Life Sciences；DyLight 488抗兔IgG(H+L)、DyLight 488 抗山羊IgG(H+L)均購(gòu)自Vector Labs。

1.2 糖尿病大鼠模型的建立及分組

8周齡SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)種系大鼠，體重240～260 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證編號(hào)：SYXK(京)2012-0036。將18只大鼠隨機(jī)分為2組，即正常對(duì)照組(NC)6只和造模組12只。動(dòng)物禁食不禁水12 h，造模組大鼠均一次性腹腔注射STZ(60 mg/kg，溶于0.1 mol/L的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液中，質(zhì)量濃度為20 g/L，pH=4.5)，NC組大鼠注射相同體積的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液。造模3 d后，采大鼠尾尖血測(cè)空腹血糖，血糖值大于16.7 mmol/L視為糖尿病模型誘導(dǎo)成功，隨機(jī)分為糖尿病模型組(DM)6只和LBP治療組(DM+LBP)6只。DM+LBP組大鼠給予LBP(1 mg/kg)每天定時(shí)定量灌胃，NC組和DM組大鼠每天給予等量的生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥12周。建模成功后所有大鼠每周監(jiān)測(cè)空腹血糖和體重，不合格者剔除。給藥完成后，檢測(cè)空腹血糖和體重進(jìn)行分析。

1.3 活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)的測(cè)定

大鼠麻醉后，迅速摘除眼球，去除角膜、晶狀體、玻璃體后，將帶有新鮮視網(wǎng)膜的眼杯迅速用OCT包埋并用液氮速凍后切片，用37℃ PBS(pH 7.4)清洗5 min，用5 μmol/L DHE 37℃孵育30 min后，37℃ PBS清洗3次，用封片劑封片，熒光顯微鏡下綠光激發(fā)，觀察和拍攝視網(wǎng)膜細(xì)胞紅色發(fā)射圖像。隨機(jī)選取圖像使用Image J軟件測(cè)定視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(ganglion cell layer, GCL)、內(nèi)核層(inner nuclear layer, INL)和外核層(outer nuclear layer, ONL)的光密度，每個(gè)圖像選取5個(gè)區(qū)域。

1.4 免疫組織化學(xué)染色法

取各組大鼠帶有新鮮視網(wǎng)膜的眼杯，常規(guī)固定、脫水后OCT包埋，液氮速凍，在切片機(jī)上沿眼球顳鼻軸橫向切割，連續(xù)切取厚度為10 μm的切片，選取包含視盤的冰凍切片用于實(shí)驗(yàn)。PBS清洗切片后，室溫封閉1 h，然后分別加入一抗：兔抗RBPMS多克隆抗體(1∶5 000)、山羊抗ChAT多克隆抗體(1∶200)，4℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗，分別加入免疫熒光二抗：DyLight 488 抗兔IgG (H+L)(1∶ 10 000)、DyLight 488 抗山羊IgG (H+L)(1∶400)靜置，室溫孵育2 h，從此步驟開始以后均避光。PBS沖洗后，封片劑封片，熒光顯微鏡觀察并拍照，分別計(jì)數(shù)GCL和INL的RBPMS、ChAT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.5 Western blot檢測(cè)Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)

提取各組視網(wǎng)膜組織蛋白，檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整蛋白量。取適量蛋白樣品進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉1 h后，分別加入一抗：兔抗Nrf2多克隆抗體(1∶200)、兔抗HO-1多克隆抗體(1∶1 000)、β-actin鼠抗單克隆抗體(1∶2 000)，4℃孵育過(guò)夜，洗膜后分別與二抗：山羊抗兔IgG-HRP(濃度分別為1∶400、1∶2 000)、山羊抗鼠IgG-HRP(1∶4 000)室溫孵育1 h，充分洗膜后，在暗室中與ECL超敏感光混合液反應(yīng)，X光膠片壓片曝光，經(jīng)顯影及定影獲得結(jié)果，通過(guò)掃描儀掃描膠片圖像輸入計(jì)算機(jī)，用軟件Image J進(jìn)行圖像分析，以β-actin為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算相對(duì)含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 LBP對(duì)糖尿病大鼠血糖和體重的影響

與NC組比較，DM組大鼠體重明顯降低、空腹血糖值升高(P<0.01)；與DM組相比，LBP治療組糖尿病大鼠的體重明顯升高、血糖顯著降低(P< 0.01，表1)。

GroupBody weight (g)Blood glucose (mmol/L)NC457.50±15.355.28±0.66DM246.80±7.43**23.26±2.67**DM+LBP293.10±16.06**##16.50±1.29**##

LBP: Lycium barbarum polysaccharides; NC: Normal control; DM: Diabetes mellitus; DM+LBP: LBP-treatment diabetic rats

**P< 0.01vsNC;##P<0.01vsDM

2.2 LBP對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜ROS生成的影響

與NC組相比，DM組大鼠視網(wǎng)膜DHE的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(P<0.01)，提示糖尿病大鼠視網(wǎng)膜ROS的生成明顯增加；與DM組相比，LBP治療組的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜DHE的熒光強(qiáng)度顯著減弱(P<0.01，圖1)。

A: Representative micrographs of retinal sections stained with DHE; B: Quantification analysis of ROS levels in the whole retina. Scale bar=50 μm; NC: Normal control; DM: Diabetes mellitus; DM+LBP: LBP-treatment diabetic rats; ROS: Reactive oxygen species

**P< 0.01vsNC;##P<0.01vsDM

2.3 LBP對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells, RGCs)的影響

與NC組相比，DM組大鼠視網(wǎng)膜RGCs數(shù)量減少68%(P<0.01)；與DM組相比，LBP治療組的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜RGCs的數(shù)量明顯增加(P<0.01，圖2)。

A: Representative micrographs of retinal sections stained with anti-RBPMS; B: Quantitative analysis of RBPMS-positive cells in the retina. Scale bar=50 μm; NC: Normal control; DM: Diabetes mellitus; DM+LBP: LBP-treatment diabetic rats; RGCs: Retinal ganglion cells

**P< 0.01vsNC;##P<0.01vsDM

2.4 LBP對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的影響

NC組大鼠視網(wǎng)膜ChAT陽(yáng)性的無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞主要分布在GCL和INL的最內(nèi)層；與NC組相比，DM組視網(wǎng)膜兩細(xì)胞層的ChAT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均明顯減少(P<0.01)；與DM組相比，LBP治療組大鼠視網(wǎng)膜ChAT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P<0.05，圖3)。

A: Representative micrographs of retinal sections stained with anti-ChAT; B: Quantitative analysis of ChAT-positive cells in the retina. Scale bar=50 μm; NC: Normal control; DM: Diabetes mellitus; DM+LBP: LBP-treatment diabetic rats

**P< 0.01vsNC;#P<0.05vsDM

2.5 LBP對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響

與NC組相比，DM組大鼠視網(wǎng)膜Nrf2的蛋白表達(dá)增加(P<0.01)；與DM組相比，LBP治療組大鼠視網(wǎng)膜Nrf2的蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；3個(gè)組間大鼠視網(wǎng)膜中Nrf2下游分子HO-l蛋白的表達(dá)量明顯不同，與NC組相比，DM組大鼠視網(wǎng)膜HO-1的蛋白表達(dá)增加(P< 0.05)，與DM組相比，LBP治療組大鼠視網(wǎng)膜HO-1的蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01，圖4)。

NC: Normal control; DM: Diabetes mellitus; DM+LBP: LBP-treatment diabetic rats

*P< 0.05,**P< 0.01vsNC;##P<0.01vsDM

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)病程12周的糖尿病大鼠體重明顯降低、空腹血糖值升高、視網(wǎng)膜ROS生成明顯增加、RGCs和無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞凋亡數(shù)量增加；使用LBP治療后的糖尿病大鼠不僅體重和血糖均有所改善、ROS生成減少、視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)量增加，而且同時(shí)促進(jìn)Nrf2/HO-1抗氧化通路的激活，以上結(jié)果提示LBP可能通過(guò)激活Nrf2/HO-1通路緩解糖尿病氧化應(yīng)激導(dǎo)致的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷。

DR的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，由多種因素共同參與，目前認(rèn)為高糖所造成的氧化應(yīng)激損傷是糖尿病多種慢性并發(fā)癥不同發(fā)病機(jī)制的共同通路[11,12]。氧化應(yīng)激是由于組織或細(xì)胞的自由基產(chǎn)生增加以及抗氧化劑的減少而造成的氧化物質(zhì)相對(duì)負(fù)載所致。越來(lái)越多的研究包括我們以往的實(shí)驗(yàn)均證實(shí)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜存在明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)[13]，過(guò)量生成的自由基可發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，攻擊視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，造成視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡[14]。通過(guò)藥物抑制體內(nèi)的氧化應(yīng)激可以緩解DR的嚴(yán)重程度[13]。我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜ROS生成明顯增加，可見其氧化應(yīng)激損傷加重，同時(shí)RGCs和無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的存活數(shù)量明顯減少；給予LBP治療后顯著抑制ROS生成的同時(shí)，RGCs和無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的凋亡數(shù)量也能明顯減少，提示LBP對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜具有抗氧化的保護(hù)效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LBP雖然有一定降血糖的作用，但其降血糖作用是有限的，有研究表明即使是使用高劑量的LBP并延長(zhǎng)干預(yù)時(shí)間到20周亦不能使血糖降至正常水平[6]，這提示我們LBP對(duì)視網(wǎng)膜的保護(hù)作用可能與其降低血糖的作用不直接相關(guān)，而是通過(guò)其他機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

機(jī)體為了對(duì)抗多種疾病所引起的氧化應(yīng)激，建立起內(nèi)源性抗氧化防御體系，其中抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element, ARE)調(diào)控的II相解毒酶及多種下游抗氧化蛋白是機(jī)體主要的抗氧化通路之一，在多種組織器官中發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用并維持組織正常的氧化-還原狀態(tài)。Nrf2是參與氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它可與ARE結(jié)合，激活下游抗氧化蛋白，如HO-1、γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶(γ-glutamyl cysteine ligase, γ-GCL)、還原型輔酶/醌氧化還原酶-1(NAD(P)H: quinone oxidoreductase, NQO1)等，提高細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力[15]。HO-1的表達(dá)增加可減少ROS的產(chǎn)生，對(duì)抗氧化應(yīng)激。通過(guò)藥物誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)上調(diào)可起到保護(hù)糖尿病大鼠RGCs的作用[16]。本實(shí)驗(yàn)中DM組大鼠視網(wǎng)膜ROS的生成增加，說(shuō)明DM組大鼠視網(wǎng)膜存在氧化應(yīng)激損傷，同時(shí)我們觀察到DM組大鼠視網(wǎng)膜Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)均較NC組增加，說(shuō)明DM組大鼠在ROS刺激作用下，體內(nèi)抗氧化通路被激活，下游抗氧化蛋白表達(dá)增加，我們認(rèn)為這是機(jī)體自身對(duì)抗氧化應(yīng)激的一種內(nèi)源性代償機(jī)制，但不足以對(duì)抗疾病的進(jìn)展。LBP作為天然抗氧化劑，可通過(guò)促進(jìn)Nrf2和HO-1的表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)[5]。與以上研究結(jié)果相一致，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LBP治療組大鼠視網(wǎng)膜中Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)較DM組大鼠進(jìn)一步上調(diào)，說(shuō)明LBP可以通過(guò)上調(diào)Nrf2和HO-1蛋白水平從而減少視網(wǎng)膜組織細(xì)胞氧化損傷的程度，保護(hù)糖尿病引起的視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷。同時(shí)LBP治療后糖尿病大鼠視網(wǎng)膜RGCs和無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的數(shù)量也明顯增加，提示LBP對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)作用與Nrf2/HO-1抗氧化通路的激活有關(guān)。

綜上所述，LBP能改善糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的氧化應(yīng)激狀態(tài)，對(duì)RGCs和無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞等視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞有一定的保護(hù)效應(yīng)，其作用機(jī)制可能與其提高糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)為臨床上DR的早期防治提供了新的思路和重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及理論指導(dǎo)。