杏仁中央核損毀對缺鈉大鼠鈉欲行為啟動和表達的影響*

趙志欣， 廖瑩瑩， 范媛媛， 蔣恩社Δ

(1. 河南大學護理與健康研究所， 開封 475004； 2. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學護理學院， 呼和浩特 010050； 3. 河南大學生命科學學院， 開封 475004)

鈉離子是動物細胞外液中重要的陽離子，它對于機體維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)元的興奮和傳導等生理過程起著十分重要的作用，但由于機體自身不能合成Na+，只能從外界環(huán)境中獲取，因此動物自身形成了一套完善的攝鈉和排鈉機制，其中動物鈉欲活動以及相關腦區(qū)對咸味覺和攝食活動的調(diào)控發(fā)揮了重要作用。鈉欲是由于機體缺鈉引發(fā)人和動物對正常情況下產(chǎn)生厭惡味覺的高濃度鈉鹽溶液表現(xiàn)出味覺喜愛，從而引發(fā)動物積極尋找并攝取大量含鈉鹽食物的行為[1]。這一行為學反應的意義在于能夠驅使機體積極尋找并攝取外界環(huán)境中的含鈉溶液或食物從而滿足自身需求。對人類而言，鈉欲過強時將引起機體過量攝入鈉鹽，從而導致或加重充血性心力衰竭、鹽敏感性高血壓和肝腎功能衰竭等疾病，而有效地控制鈉鹽攝入是治療或改善這些疾病的基礎。因此對于鈉欲調(diào)控機制的研究，具有重要的價值和臨床意義。

鈉欲行為包括鈉欲的啟動和鈉欲的行為表達兩個過程。這些行為的產(chǎn)生需要腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和中樞多個核團的參與。其中，杏仁中央核(central nucleus of amygdala, CeA)被證明能夠整合多種與鈉欲行為相關的信息和調(diào)控動物的鈉欲行為。先前的研究表明，電損毀CeA后，體鈉正常大鼠對不同濃度的NaCl溶液、檸檬酸溶液和鹽酸奎寧溶液的攝入量顯著降低，提示CeA可通過影響中樞味覺評估機制改變大鼠對不同味覺刺激的欣快閾值，從而參與動物攝食行為的調(diào)控[2]。此外，預先損毀CeA還會顯著影響臂旁核外側區(qū)對鈉欲行為的抑制性調(diào)節(jié)作用[3]。Sakai等研究工作者發(fā)現(xiàn)給予大鼠鹽皮質激素的反義寡核苷酸激動劑去結合CeA中的鹽皮質激素受體，能夠明顯減弱由去氧皮質酮所誘導的鈉欲，但這一結果卻并不影響由腎上腺切除術后產(chǎn)生的鈉欲[4]，這些實驗結果均說明CeA參與正常動物鈉鹽攝入以及鈉欲行為的調(diào)控。長期的低鈉飲食可以導致動物體內(nèi)缺鈉進而引發(fā)動物鈉欲增強，那么CeA功能是否也參與對缺鈉大鼠鈉欲行為表達的調(diào)控作用，有待進一步闡明。另外，在腦干NTS的尾端分布有一類醛固酮敏感神經(jīng)元，因該類神經(jīng)元可同時表達鹽皮質激素受體和11β-羥類固醇二型脫氫酶(11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2, HSD2)，故也被稱作為HSD2神經(jīng)元[5]。NTS內(nèi)HSD2 神經(jīng)元活動增加可以作為動物鈉欲啟動的標志之一，前腦CeA是否參與了低鈉飲食誘導的動物鈉欲的啟動，尚不得而知。

本研究旨在闡明CeA損毀對低鈉飲食誘發(fā)的缺鈉大鼠鈉欲啟動和鈉欲行為表達的影響，為CeA調(diào)控缺鈉大鼠的鈉欲行為提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年雄性SD大鼠42只，大鼠初始體重220～260 g，由西安交通大學動物中心提供，大鼠單籠喂養(yǎng)，實驗前大鼠自由進食飲水。動物房溫度維持在22～24℃，濕度55%±10%，光暗周期為12∶12 h。放置兩個飲水瓶(500 ml)于籠前，間隔5 cm，在上述條件下喂養(yǎng)1周以適應環(huán)境。

1.2 實驗分組與處理

在實驗I中，選用6只成年雄性SD大鼠，每天8:00 am于籠前置于兩個盛有蒸餾水(distilled water, DW)飲水瓶，并每天調(diào)換兩個飲水瓶的左右位置，對大鼠進行雙瓶味覺選擇適應性訓練5 d，于第6日8: 00 am將分別盛有DW和0.3 mol/L NaCl的飲水瓶置于籠前，檢測大鼠24 h內(nèi)對DW和0.3 mol/L NaCl飲用量，液體飲用量單位以毫升(ml)表示。于第7日開始給予大鼠低鈉飼料喂養(yǎng)(含有 0.02%NaCl)和雙瓶DW 飲水14 d，建立缺鈉大鼠模型。于第21日再次將分別盛有DW和0.3 mol/L NaCl的飲水瓶置于籠前，檢測大鼠24 h內(nèi)對0.3 mol/L NaCl和DW飲用量及大鼠對0.3 mol/L NaCl和DW的偏愛率。在雙瓶選擇實驗中，大鼠對某種味覺刺激的偏愛率可由以下公式求得：某種溶液的偏愛率 = 大鼠對某種溶液的飲用量/大鼠飲用兩種溶液的總量。

在實驗II中，將18只成年雄性SD大鼠隨機分為3組(每組6只)，分別為：雙側CeA電損毀組(lesion，L)、雙側CeA假損毀組(sham，S)和正常組(normal，N)大鼠，L組大鼠按照以下方法CeA進行電損毀，首先給予大鼠腹腔注射10%的水合氯醛(300 mg/kg)麻醉，將其俯臥位置于腦立體定位儀(SN-2N, Narishige, Tokyo, Japan)上，使其前后囟處于同一水平面。剃毛消毒后切開頭部皮膚以暴露顱骨，根據(jù)Paxinos & Wastson 大鼠腦立體定位圖譜確定CeA的位置(取前囟后2.5 mm，中線旁開4.2 mm，顱骨表面下7.65 mm)。用微型電鉆在雙側CeA上方顱骨相應部位開孔。將損毀電極由腦表面垂直向下置入CeA正中處利用電損毀儀(UGO53500，Italy)進行損毀(400 μA，30 s)。術中所用器械及電極均需消毒，且嚴格遵守無菌操作流程，注意為動物保暖。術后連續(xù)3 d給予大鼠青霉素(2×105U)皮下注射以防感染。S組大鼠除了不給予CeA電流損毀外，其他操作同L組大鼠。N組大鼠不給予CeA任何處理。術后動物恢復7 d并進行單籠雙瓶選擇適應性訓練，于第8日開始給予14 d的大鼠低鈉飼料喂養(yǎng)和雙瓶DW 飲用，于第22日給予DW和0.3 mol/L NaCl雙瓶選擇飲食，檢測大鼠于1 h、3 h、6 h、12 h和24 h五個時間段的DW和0.3 mol/L NaCl的飲用量和計算大鼠對DW和0.3 mol/L NaCl的偏愛率。

在實驗III中，將24只大鼠隨機分為4組(每組6只)：雙側CeA損毀+低鈉飲食組(L+L)、雙側CeA損毀+正常飲食組(L+N)、雙側CeA假損毀低鈉飲食組(S+L)和雙側CeA假損毀+正常飲食組(S+N)。CeA損毀及假損毀操作同上，術后給予大鼠7 d恢復期并行單籠雙瓶選擇適應性訓練，低鈉飲食組于第8日開始給予大鼠低鈉飼料和DW飲食14 d以誘導大鼠慢性缺鈉，正常飲食組大鼠給予正常飼料和自由飲水(DW)14 d，于第23日將大鼠麻醉、常規(guī)4%多聚甲醛灌流固定和收集大鼠大腦標本。

1.3 HSD2神經(jīng)元免疫熒光染色及計數(shù)

將實驗III中的大鼠大腦使用恒冷箱切片機，進行NTS后端連續(xù)冠狀切片(隔3取1)，片厚25 μm，每只大鼠收集2片腦切片，進行HSD2蛋白免疫熒光化學染色。將漂洗后的腦切片移入含有Rabbit anti-HSD2 一抗(14192-1-AP, Proteintech; 1∶500稀釋)的抗體稀釋液中，于4℃冰箱中孵育72 h。漂洗后再將腦切片移入含F(xiàn)ITC標記goat anti-rabbit IgG二抗(SA00003-2, Proteintech, 1∶1 000稀釋)的抗體稀釋液中，4℃過夜。漂洗后在避光情況下將腦片裱于載玻片，并加蓋玻片封片。利用熒光顯微鏡進行觀察并拍照。利用Image-Pro Plus圖像分析軟件檢測每張腦切片NTS內(nèi)HSD2免疫陽性細胞數(shù)目，取每只大鼠2張腦切片中NTS兩側HSD2陽性細胞數(shù)的總數(shù)作為該只大鼠NTS內(nèi)的HSD2陽性神經(jīng)元數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學處理

對于CeA損毀大鼠，在實驗結束后，對大鼠雙側CeA部位進行Nissl染色并在顯微鏡下觀察CeA損毀情況，只將CeA損毀準確大鼠的數(shù)據(jù)用于本實驗的統(tǒng)計分析。所有的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤表示。采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。利用配對t檢驗對實驗I中的數(shù)據(jù)進行分析，用雙因素重復測量的方差分析和單因素方差分析分析實驗II中各組大鼠中在5個時間點上攝鈉攝水量的差異，利用獨立樣本t檢驗分析實驗III中各組之間HSD2陽性神經(jīng)元活動的差異。

2 結果

2.1 缺鈉大鼠鈉欲行為的表達增強

先前的研究表明，給予大鼠8～10 d的低鈉飲食就可以誘導大鼠體內(nèi)缺鈉以及鈉欲的產(chǎn)生。在本研究中，當給予大鼠14 d低鈉飲食后，雙瓶味覺選擇測試結果顯示24 h 內(nèi)缺鈉大鼠對0.3 mol/L NaCl溶液飲用量比低鈉飲食前顯著增多(22.55±1.56 mlvs7.73±1.44 ml，P< 0.01)，對DW飲用量卻顯著減少(17.22±1.64 mlvs34.75±2.59 ml，P<0.01)，而總液體攝入量并沒有明顯變化(39.77±1.20 mlvs42.48±1.31 ml，P>0.05，圖1A)。大鼠對0.3 mol/L NaCl的偏愛率在低鈉飲食后較低鈉飲食前明顯上升(P< 0.01)，而對DW的偏愛率在低鈉飲食后明顯下降(P< 0.01，圖1B)。結果表明低鈉飲食后大鼠的鈉欲行為表達明顯增強。

DW: Distilled water

**P<0.01vsbefore low sodium diet

2.2 CeA損毀抑制缺鈉大鼠鈉欲行為的表達

對CeA損毀組L、CeA假損毀組S和正常組N三組大鼠在低鈉飲食后1 h、3 h、6 h、12 h和24 h對 0.3 mol/L NaCl溶液、DW、總液體飲用量及其偏愛率進行雙因素重復測量方差分析，結果表明(表1)，不同分組大鼠的對0.3 mol/L NaCl和DW的攝入量和偏愛率具有顯著的差異。單因素方差分析表明L組大鼠在5個時間點內(nèi)對0.3 mol/L NaCl溶液的攝入量比S組和N組大鼠顯著減少(P<0.01，P< 0.05, 表2)，對DW溶液的攝入量在12 h和24 h兩個時間點內(nèi)比S組和N組顯著增多(P<0.05,P< 0.01，表3)。3組大鼠在5個時間點內(nèi)對總液體的攝入量沒有明顯差異(表4)。L組大鼠比S組和N組大鼠在5個時間點內(nèi)對0.3 mol/L NaCl溶液的偏愛率顯著下降(P<0.01，表5)，對DW溶液的偏愛率顯著增高(P<0.05,P<0.01，表6)。測量時間因素對不同分組大鼠的0.3 mol/L NaCl溶液和DW攝入量和偏愛率都有顯著影響。不同分組和測量時間在大鼠0.3 mol/L NaCl溶液的攝入量分析中存在交互效應，隨著測量時間的延長，L組大鼠對0.3 mol/L NaCl溶液的攝入量增加幅度小于S組和N組大鼠。

Tab. 1 Summary of the results for the two-way ANOVA with repeated measurement

Tab. 2 Cumulative intake of 0.3 mol/L NaCl in rats with low-sodium diets in three groups (ml， n=6)

L: CeA lesion group; S: CeA sham group； N: Normal rat group

*P<0.05,**P<0.01vsN；#P<0.05，##P<0.01vsS

Tab. 3 Cumulative intake of DW in rats with low-sodium diets in three groups (ml， n=6)

L: CeA lesion group; S: CeA sham group； N: Normal rat group

*P<0.05,**P<0.01vsN；#P<0.05，##P<0.01vsS

Tab. 4 Cumulative intake of total solution in rats with low-sodium diets at in three groups(ml， n=6)

L: CeA lesion group; S: CeA sham group； N: Normal rat group

Tab. 5 Intake preference of 0.3 mol/L NaCl at 1 h, 3 h, 6 h, 12 h and 24 h in three groups n= 6)

L: CeA lesion group; S: CeA sham group； N: Normal rat group

*P<0.05,**P<0.01vsN；#P<0.05，##P<0.01vsS

Tab. 6 Intake preference of DW at 1 h, 3 h, 6 h, 12 h and 24 h in three groups n= 6)

L: CeA lesion group; S: CeA sham group； N: Normal rat group

*P<0.05,**P<0.01vsN；#P<0.05，##P<0.01vsS

2.3 CeA損毀不影響缺鈉大鼠鈉欲行為的啟動

大鼠體內(nèi)缺鈉可以激活NTS內(nèi)的HSD2神經(jīng)元，圖2顯示了來自CeA假損毀組大鼠低鈉飲食后NTS內(nèi)HSD2神經(jīng)元表達情況。HSD2神經(jīng)元主要分布在NTS尾端中線兩側，HSD2蛋白主要位于胞體內(nèi)。HSD2神經(jīng)元的胞體多呈卵圓形或圓形(圖2)。實驗III觀察了四組不同處理大鼠NTS內(nèi)HSD2神經(jīng)元表達情況，結果顯示，L+L組(93.00±4.35)和S+L組(98.67±11.37)大鼠NTS內(nèi)HSD2神經(jīng)元表達較L+N組(55.00±5.37)和S+N組 (54.67±2.62)大鼠顯著增加(P<0.01)。而L+L組與S+L組大鼠之間和L+N組與S+N組大鼠之間NTS內(nèi)的HSD2神經(jīng)元表達沒有顯著性差異 (P> 0.05，圖3)。結果提示，大鼠體內(nèi)是否缺鈉是影響鈉欲啟動的主要因素，不論是缺鈉大鼠還是鈉正常大鼠，CeA損毀與否并未影響其NTS內(nèi)HSD2神經(jīng)元的表達情況。

Fig.2The representative graph showing the HSD2 positive neurons in NTS in a rat with low sodium diet ( Scale bar = 50 μm). The HSD2 neurons were revealed by the immunofluorescent staining and the picture was viewed and taken under the fluorescent microscope

AP: Area postrema; CC: Central canal

L + L: CeA lesion+ low sodium diet; S+L: CeA sham + low sodium diet; L+N: CeA lesion + normal sodium diet; S+N: CeA sham + normal sodium diet

**P<0.01vsL+N, S+N；##P<0.01vsL+N, S+N

3 討論

攝鈉行為是動物體鈉缺失的一種適應性行為反應。以往有研究表明低鈉飲食喂養(yǎng)大鼠8～10 d左右就能夠誘導大鼠鈉欲產(chǎn)生和大鼠攝鈉增加，改變大鼠對咸味覺刺激的感受性，削弱大鼠腦干NTS內(nèi)味覺神經(jīng)元對高滲NaCl溶液刺激的反應性[6-9]。本研究中，當給予大鼠低鈉飼料(0.02%)喂養(yǎng)14 d造成體內(nèi)缺鈉之后，用雙瓶選擇味覺測試檢測大鼠對 0.3 mol/L NaCl溶液攝入量的變化，發(fā)現(xiàn)大鼠對 0.3 mol/L NaCl溶液的24 h飲用量較大鼠低鈉飲食前明顯增高，對0.3 mol/L NaCl的偏愛率顯著增加。大鼠24 h內(nèi)總液體的飲用量比低鈉飲食前并沒有顯著改變。在正常情況下，大鼠對給予的高濃度的0.3 mol/L NaCl溶液起厭惡反應，這提示缺鈉改變了大鼠對高濃度鹽溶液的味覺喜好，使之正常體鈉狀態(tài)下對高濃度鹽溶液的厭惡轉變?yōu)榈外c狀態(tài)下對高濃度鹽溶液的喜好。與NTS內(nèi)味覺神經(jīng)元口內(nèi)給予高滲NaCl溶液刺激反應相一致[6-8]，缺鈉使得大鼠味覺感受系統(tǒng)對高滲鹽味覺刺激的反應性降低，厭惡閾值升高，從而可以促使大鼠攝入高濃度的NaCl溶液以改善機體的鈉缺乏狀態(tài)。這種缺鈉大鼠對高濃度鈉鹽溶液喜好的改變是由于大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)包括CeA在內(nèi)的多個相關核團相互作用和調(diào)節(jié)的結果。

CeA是邊緣前腦的重要結構，它參與中樞味覺和內(nèi)臟信息的整合，也參與情緒、情感及動機的控制，CeA在維持機體水鈉平衡代謝及促進攝食行為中也發(fā)揮著重要的作用[10]。此外CeA還參與了對下丘腦室旁核興奮后引起的升壓反應的調(diào)控作用[11]。已有研究表明，電損毀或化學損毀CeA后，體鈉正常大鼠對于含鈉溶液的攝入量明顯減少[2]。本研究發(fā)現(xiàn)電損毀CeA強烈抑制缺鈉大鼠對0.3 mol/L NaCl溶液的攝入量，損毀CeA可使缺鈉大鼠對0.3 mol/L NaCl溶液攝入量下降50%以上，而對總的溶液攝入量卻沒有發(fā)生明顯改變，這表明CeA損毀明顯降低了缺鈉大鼠對0.3 mol/L NaCl的味覺喜好，卻對大鼠的渴感沒有影響。這一結果說明CeA在功能正常的情況下，不僅具有調(diào)控體鈉正常動物的鈉欲行為，同時更對缺鈉大鼠鈉欲行為的表達具有較強的正性調(diào)節(jié)作用。在本實驗中假損毀組和正常組大鼠對0.3 mol/L NaCl溶液的攝入量沒有顯著差異，說明假手術過程中電極進入對大鼠腦部其他部位的損傷并不影響大鼠鈉欲行為的表達。

鈉欲行為的產(chǎn)生對機體的生存至關重要，它使得動物對本來引起強烈厭惡反應的高鹽溶液(如：0.3 mol/L NaCl)攝入增加，改變了對于高鹽溶液的味覺喜好，以滿足機體對鈉鹽的需求。孤束核內(nèi)HSD2神經(jīng)元的激活在這一過程發(fā)揮著十分重要的作用。有研究表明，通過低鈉飲食誘導大鼠缺鈉后引起的HSD2神經(jīng)元激活程度與其所表現(xiàn)的鈉欲程度相平行，并且當缺鈉大鼠飲用含鈉溶液后，HSD2神經(jīng)元則會被迅速滅活[12]。因此腦干NTS內(nèi)HSD2神經(jīng)元參與機體鈉鹽需求信號的傳遞及鈉欲行為的啟動。由于缺鈉導致NTS內(nèi)HSD2神經(jīng)元激活是動物鈉欲啟動的重要標志之一。鈉欲的啟動可由機體缺鈉和后腦內(nèi)人工注射醛固酮來誘導[13]。有研究表明NTS的HSD2神經(jīng)元主要投射到調(diào)控鈉鹽攝入相關的前腦核團并接受來自CeA的下行纖維投射[14]。在本研究中，無論CeA損毀與否，并未影響缺鈉大鼠和正常飲食大鼠NTS內(nèi)HSD2神經(jīng)元的激活。由于HSD2神經(jīng)元的激活反映了鈉欲的啟動情況，其激活受到大鼠缺鈉狀態(tài)的影響，而并不受CeA的功能調(diào)控。鑒于CeA損毀顯著抑制缺鈉大鼠對高鹽溶液的攝入量，因此，在正常情況下，CeA在調(diào)控缺鈉大鼠鈉欲行為的表達以及在大鼠對高濃度鹽溶液的味覺評估中發(fā)揮著重要作用，而對大鼠鈉欲的啟動沒有影響。

機體鈉欲增強導致的鈉鹽攝入過多是誘發(fā)鹽敏感高血壓的重要因素之一。長期高鹽飲食可以升高腦脊液內(nèi)鈉濃度和導致下丘腦室旁核(paraventricular nucleus, PVN)內(nèi)的炎癥反應，從而激活PVN內(nèi)的交感神經(jīng)節(jié)前神經(jīng)元，引起血壓升高[15]。另外，中樞高滲鹽刺激也可引起PVN內(nèi)GABA分泌，通過GABA受體產(chǎn)生升壓反應[16]。因此臨床上限制患者鈉鹽攝入是預防和治療鹽敏感高血壓的重要措施之一，然而限鹽導致的鈉欲增強是患者遵醫(yī)囑依從性差的主要原因之一。因而在臨床上可通過一些藥物抑制CeA對鈉欲行為表達的調(diào)控作用，進而降低患者的攝鈉行為，從而提高鹽敏感高血壓的治療效果。本研究為提高臨床鹽敏感高血壓患者限鹽攝入的遵醫(yī)依從性提供了新的思路和實驗依據(jù)。