老年心力衰竭患者外周血miR-423-5p表達(dá)水平及與心室重構(gòu)的關(guān)系探討

張洪，薛蕾，王喜歡

心血管疾病是威脅我國(guó)國(guó)民生命健康的最主要的公共衛(wèi)生安全問題，大大增加了社會(huì)的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。大多數(shù)心血管疾病最終都會(huì)演變至心力衰竭（HF），尤其以冠狀動(dòng)脈（冠脈）粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。橹?。HF是由于心肌收縮和/舒張功能障礙，心輸出量無法滿足機(jī)體需求，引發(fā)一系列復(fù)雜的臨床綜合征，是患者致殘甚至死亡的主要原因[1]。HF患者最初表現(xiàn)為左心室?guī)缀涡螤罴敖Y(jié)構(gòu)改變，并伴有心肌細(xì)胞肥大、心肌代償性肥厚，最終發(fā)生心力衰竭[2]。因此心室重構(gòu)是HF發(fā)生和進(jìn)展式演變的主要病理機(jī)制之一，HF必然全程伴隨著心室重構(gòu)[3]。如何準(zhǔn)確判斷心室重構(gòu)進(jìn)程，提供比影像學(xué)更豐富的信息是心血管疾病治療領(lǐng)域一直積極探索的難題。目前臨床上很多用于HF診斷和危險(xiǎn)分層的生化標(biāo)志物的敏感性較低，近幾年隨著醫(yī)療觀念的轉(zhuǎn)變，對(duì)于心血管疾病的治療已逐漸由“重治療”轉(zhuǎn)向“重預(yù)防”[4]，因此尋找敏感的預(yù)警標(biāo)志物，用以篩選HF的高危人群成為當(dāng)代醫(yī)學(xué)關(guān)注的重點(diǎn)。相比之下，對(duì)于已發(fā)生心室重構(gòu)但無HF臨床表現(xiàn)的HF人群盡早給予合理干預(yù)并逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)更具有現(xiàn)實(shí)的臨床價(jià)值。循環(huán)miRNAs因其具有較高的穩(wěn)定性和特異性，且分離、檢測(cè)操作簡(jiǎn)單易行，逐漸凸顯出其在心血管疾病診斷和治療領(lǐng)域的潛力和優(yōu)勢(shì)[5]?？紤]到超聲心動(dòng)圖的費(fèi)用較高，尋找更敏感的miRNAs成為更具吸引力的研究方向。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，與健康人群比較，終末期HF患者外周血miR-423-5p表達(dá)上調(diào)，是否可作為早期HF高危患者的篩查指標(biāo)以及與心室重構(gòu)的關(guān)系是本項(xiàng)研究探討的重點(diǎn)?，F(xiàn)研究報(bào)告如下：

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇2016年2月至2018年4月于南陽(yáng)市第二人民醫(yī)院心內(nèi)科確診并接受治療的老年（≥60歲[6]）HF患者187例，其中男性103例，女性84例，年齡為60～84歲，平均年齡為（68.75±7.32）歲。所有患者均接受心臟超聲、實(shí)驗(yàn)室檢查和選擇性冠狀動(dòng)脈造影（CAG）檢查。根據(jù)美國(guó)心臟學(xué)會(huì)（ACC）/美國(guó)心臟病協(xié)會(huì)（AHA）關(guān)于心衰分期標(biāo)準(zhǔn)[7]，91例為心衰A期（A組），96例為心衰B期（B組）。另外選擇同時(shí)期在我院體檢中心進(jìn)行體格檢查的正常受試者（C組）46例作為對(duì)照組，其中男性26例，女性20例，年齡60～81歲，平均年齡為（70.18±6.54）歲。本項(xiàng)研究已獲得倫理委員會(huì)的審查批準(zhǔn)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)、納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 ACC/AHA心衰分期A期：具有高血壓、糖尿病、高脂血癥等心衰危險(xiǎn)因素，但未出現(xiàn)心室肥大、心功能損傷或心室?guī)缀谓Y(jié)構(gòu)變化；B期：已出現(xiàn)心室肥大、心功能損傷或心室?guī)缀谓Y(jié)構(gòu)變化，但從未表現(xiàn)出心衰的癥狀和體征；C期：出現(xiàn)胸痛或胸部不適等癥狀，經(jīng)心電圖檢查出現(xiàn)缺血性ST-T異常和病理性Q波，經(jīng)心臟超聲檢查出現(xiàn)左室肥大和/或左室?guī)缀螛?gòu)型改變，既往無明確心律失常、心室重構(gòu)、心動(dòng)過速、房室傳導(dǎo)阻滯等心衰指征；D期：難治性心衰。

1.2.2 納入標(biāo)準(zhǔn)①符合ACC/AHA心衰分期A期或B期的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②C組受試者：經(jīng)常規(guī)體格檢查證實(shí)無心血管危險(xiǎn)因素、且無心臟結(jié)構(gòu)改變。以上受試對(duì)象年齡≥60歲，受試者或家屬簽署知情同意書。

1.2.3 排除標(biāo)準(zhǔn)①不符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)的患者；②受試前3個(gè)月出現(xiàn)嚴(yán)重的意識(shí)障礙、高血壓危象、心衰急性失代償臨床表現(xiàn)者；③合并先天性心臟病、心肌炎、風(fēng)濕性心臟病、免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、急慢性嚴(yán)重感染、肝腎功能損傷、惡性腫瘤、嚴(yán)重出血傾向者；④既往接受冠脈搭橋術(shù)或冠脈支架植入術(shù)者。

1.3 研究方法

1.3.1 血液樣本采集所有受試者禁食12 h后，次日清晨，取肘靜脈血，加入枸櫞酸鈉抗凝，4 ℃ 3000rpm離心10 min，分離血漿，于-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)室生化指標(biāo)檢查采用DXC800全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)Beckman公司）進(jìn)行檢血常規(guī)測(cè)。嚴(yán)格按照儀器操作手冊(cè)進(jìn)行操作，所有檢測(cè)在2 h內(nèi)完成。包括糖化血紅蛋白（HbAlc）、空腹血糖（FPG）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）等生化指標(biāo)。

1.3.3 qRT-PCR法檢測(cè)外周血miR-423-5p①提取外周血總RNA。采用凝膠電泳檢測(cè)RNA分子量；采用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。②RNA逆轉(zhuǎn)錄：根據(jù)Taqman? MicroRNA reverse transcription kit和Taqman? MicroRNA assay kit試劑盒（日本Takara公司）說明書操作進(jìn)行。將cDNA保存至-20 ℃保存?zhèn)溆?。③?shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）：按照三步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以組織cDNA為模板，以β-actin作為內(nèi)參，將20 μl反應(yīng)體系置于37 ℃恒溫水浴60 min，85 ℃ 5 s，加入去離子水至100 μl，各反應(yīng)孔取2 ul進(jìn)行PCR。冰浴中配制20 μl PCR反應(yīng)體系，95 ℃ 30 s預(yù)變性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)45次。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的資料設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供。PCR結(jié)果判斷：根據(jù)使用說明調(diào)整基線，將閾值設(shè)定在熒光值對(duì)數(shù)圖的線性部分，從軟件中讀取Ct值。

1.3.4 心臟超聲相關(guān)指標(biāo)患者在靜息狀態(tài)下，由超聲專業(yè)人員采用iE33超聲心動(dòng)圖儀（荷蘭Philips公司）進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查，包括左室舒張末徑（LVEDD）、舒張末室間隔厚度（IVSD）、舒張末左室后壁厚度（PWD）。左室質(zhì)量（LVM）=1.04×[（LVEDD+IVSD+PWD）3-LVEDD3]-14；左室質(zhì)量指數(shù)（LVMI）=LVM/體表面積；左室相對(duì)室壁厚度（RWT）=（IVSD+PWD）/LVEDD。根據(jù)2013年歐洲高血壓指南[8]推薦關(guān)于左室肥厚的標(biāo)準(zhǔn)，LVMI≥124 g/m2（男），LVMI≥110 g/m2（女）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本資料采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。所有變量均進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)，正態(tài)變量以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)。對(duì)連續(xù)變量采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)；采用多元Logistic回歸模型分析心室重構(gòu)的影響因素。采用受試者工作特征（ROC）曲線確定miR-423-5p對(duì)前心衰患者的篩選價(jià)值，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象一般臨床資料比較三組受試者年齡、體質(zhì)指數(shù)、吸煙史和飲酒史基本一致，未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。另外，除了NYHA心功能分級(jí)以外，A組和B組患者一般臨床資料基本一致，未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），具有可比性。由于分組原因，A組患者NYHA心功能分級(jí)Ⅱ級(jí)比例高于B組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

2.2 研究對(duì)象外周血miR-423-5p水平比較A組、B組和C組三組受試者外周血miR-423-5p相對(duì)表達(dá)量分別為（1.22±0.19）、（1.86±0.24）、（0.47±0.12），其中C組受試者外周血miR-423-5p相對(duì)表達(dá)量明顯低于A組和B組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)B組患者外周血miR-423-5p相對(duì)表達(dá)量明顯高于A組患者，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。

2.3 ROC曲線分析miR-423-5p對(duì)心室重構(gòu)的診斷價(jià)值為進(jìn)一步分析miR-423-5p是否可用于從無癥狀人群中篩選出心衰B期患者，筆者采用ROC曲線分析，在B組和C組共142例中評(píng)價(jià)miR-423-5p對(duì)心衰B期患者的診斷效能。經(jīng)ROC曲線分析，曲線下的面積為0.721（95%CI：0.634～0.797），截?cái)嘀禐?.27。提示外周血miR-423-5p水平于篩選心衰B期患者有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

2.4 HF患者血液生化指標(biāo)和心功能指標(biāo)比較比較A組和B組患者血液生化指標(biāo)和心功能指標(biāo)，結(jié)果顯示，兩組患者FPG、2hPG、HbAlc、TC、TG、HDL-C、LDL-C水平基本一致，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。但是B組患者LVEDD、IVSD、PWD、LVMI和RWT心功能指標(biāo)明顯高于A組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表1 三組受試者的一般臨床資料分析

圖1 研究對(duì)象外周血miR-423-5p相對(duì)表達(dá)量柱狀圖（與A組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05）

圖2 miR-423-5p篩選前心衰患者的ROC曲線圖

2.4 多元Logistic回歸分析影響LVMI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素以心室重構(gòu)（1表示心衰B期，0表示心衰A期）作為因變量，采用多元Logistic回歸分析表1和表2中A組和B組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的變量，包括NYHA心功能分級(jí)、LVEDD、IVSD、PWD、LVMI、RWT等心功能指標(biāo)以及miR-423-5p水平，結(jié)果顯示，NYHA心功能分級(jí)、LVEDD、IVSD、PWD、LVMI、RWT等心功能指標(biāo)以及miR-423-5p水平和心室重構(gòu)關(guān)系密切（P＜0.05）（表3）。

3 討論

心力衰竭是由心肌損傷引起的一系列血流動(dòng)力學(xué)障礙綜合征，尤其是慢性心力衰竭是心肌梗死、心肌炎等大多數(shù)心血管疾病的終末期表現(xiàn)，患者預(yù)后較差，增加了醫(yī)療負(fù)擔(dān)。隨著我國(guó)老齡化進(jìn)程的加快，加之環(huán)境因素的影響和生活工作壓力的增大，冠心病的發(fā)病率逐年增加，其慢性并發(fā)癥也逐漸成為威脅人類健康的主要原因之一[9]。心力衰竭是心血管疾病的終末階段，是導(dǎo)致冠心病患者心源性猝死的最直接原因。根據(jù)ACC/AHA心衰指南，可將心衰患者分為4期，包括只有心血管疾病危險(xiǎn)因素而未出現(xiàn)心室重構(gòu)的A期患者，已發(fā)生心室重構(gòu)而未出現(xiàn)心衰癥狀的B期患者，已出現(xiàn)心衰癥狀和體征的C期患者以及難治性終末期心衰患者即D期患者[10]。該分期反映了心衰演變過程，相較于紐約心臟協(xié)會(huì)（NYHA）關(guān)于心功能的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于識(shí)別心衰高危患者更具有臨床價(jià)值。

表2 兩組患者血糖和血脂比較（±s）

表2 兩組患者血糖和血脂比較（±s）

注：FPG：空腹血糖；2 hPG：2 h血糖；HbAlc：糖化血紅蛋白；TC：總膽固醇；TG：三酰甘油；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；LVEDD：左室舒張末徑；IVSD：舒張末室間隔厚度；PWD：舒張末左室后壁厚度；LVMI：左室質(zhì)量指數(shù)；RWT：左室相對(duì)室壁厚度

項(xiàng)目 A組（n=9 1） B組（n=9 6） t值 P值F P G（m m o l/L） 6.7 3±1.1 8 6.9 2±1.2 7 1.0 5 8 0.2 9 1 2 h P G（m m o l/L） 8.4 8±1.7 4 8.6 3±1.4 9 0.6 3 4 0.5 2 7 H b A l c（%） 6.5 8±0.9 4 6.6 7±0.7 9 0.7 1 0 0.4 7 9 T C（m m o l/L） 4.8 1±0.5 7 4.8 6±0.7 3 0.5 2 0 0.6 0 4 T G（m m o l/L） 1.5 4±0.2 3 1.5 6±0.1 9 0.6 5 0 0.5 1 7 H D L-C（m m o l/L） 2.2 7±0.7 5 2.3 0±0.6 8 0.2 8 7 0.7 7 5 L D L-C（m m o l/L） 3.3 9±0.2 8 3.3 1±0.3 4 1.7 5 1 0.0 8 2 L V E D D（m m） 4 8.7 2±6.9 8 5 4.8 3±7.5 2 5.7 5 0 0.0 0 0 I V S D（c m） 0.9 9±0.1 1 1.1 3±0.1 5 7.2 4 6 0.0 0 0 P W D（c m） 0.8 7±0.1 0 1.0 5±0.1 3 1 0.5 7 2 0.0 0 0 L V M I（g/m 2） 9 7.8 2±1 9.8 6 1 4 7.2 6±2 1.3 7 1 6.3 6 5 0.0 0 0 R W T 0.4 0±0.0 3 0.5 2±0.0 5 1 9.7 6 7 0.0 0 0

表3 多元Logistic回歸分析miR-423-5p及其它因素與心室重構(gòu)的關(guān)系

目前臨床上主要依靠心臟彩色多普勒超聲檢查作為心室重構(gòu)最主要的診斷手段，但是由于心室重構(gòu)早期表現(xiàn)并不明顯，采用心臟彩超進(jìn)行人群隨訪效價(jià)比低且受心臟瓣膜返流等因素影響，易導(dǎo)致漏診[11]，因此，尋找敏感、便捷、快速的血清學(xué)檢測(cè)指標(biāo)對(duì)于心室重構(gòu)的早期診斷具有重要的臨床意義。自十年前，有學(xué)者提出循環(huán)血中miRNAs檢測(cè)可用于癌癥的診斷和預(yù)后評(píng)估以來，越來越多的專家開始關(guān)注miRNAs作為心血管疾病診斷分子的可能[12]。miRNAs是存在于真核細(xì)胞內(nèi)的小分子非編碼RNA，與人類1/3以上的基因調(diào)控都密切相關(guān)[13]。但是醫(yī)學(xué)界關(guān)于miRNAs的研究剛剛起步，大多數(shù)的miRNAs尚處于未知領(lǐng)域。本項(xiàng)研究的分組設(shè)計(jì)參考了ACC/AHA分期標(biāo)準(zhǔn)，旨在分析新發(fā)現(xiàn)的miR-423-5p在心衰早期階段的血清水平以及變化趨勢(shì)，并探討是否可作為篩選心衰高?；颊叩妮o助指標(biāo)。所以本項(xiàng)研究并未探討C期和D期HF患者。

目前，眾多學(xué)者認(rèn)為血清標(biāo)志物對(duì)于篩查心衰患者所提供的信息以及指導(dǎo)早期干預(yù)價(jià)值有限[14]，因此從篩查無心衰癥狀的B期患者入手，以降低C期患者的發(fā)生率具有重要的現(xiàn)實(shí)價(jià)值。本項(xiàng)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于A組和C組受試者，B組患者外周血miR-423-5p水平最高，說明，隨著HF的演變和進(jìn)展，miR-423-5p水平逐漸升高，可能參與心室重構(gòu)過程。最初由Nabialek發(fā)現(xiàn)miR-423-5p與急性心肌梗死有關(guān)[15]；隨后，Tijsen證實(shí)心衰患者循環(huán)血中miR-423-5p顯著高于健康人群，提示miR-423-5p可作為心力衰竭診斷的標(biāo)志分子[16]。而且也有基礎(chǔ)研究顯示高壓誘導(dǎo)的心力衰竭大鼠外周血miR-423-5p表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，且推測(cè)miR-423-5p可能來源于受損的心肌細(xì)胞[17]，但是具體的作用機(jī)制仍然后續(xù)需要深入研究，因此miR-423-5p是否能夠反映心室重構(gòu)狀態(tài)未見相關(guān)研究。

為了進(jìn)一步探討miR-423-5p與心室重構(gòu)的關(guān)系，因此選擇A期和B期患者作為研究對(duì)象，并且經(jīng)Spearman相關(guān)性分析證實(shí)miR-423-5p與LVEDD、IVSD、PWD、LVMI和RWT呈正相關(guān)性，并且經(jīng)多元線性回歸分析顯示，miR-423-5p可能是心室重構(gòu)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。雖然證實(shí)miR-423-5p可作為篩選前心衰患者的標(biāo)志分子，但是本項(xiàng)研究仍然存在一定的局限性，醫(yī)師納入樣本量有限，未進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層分析，二是采取橫斷面研究設(shè)計(jì)，無法反應(yīng)外周血中miR-423-5p的動(dòng)態(tài)變化，因此，盡管得出的結(jié)論證實(shí)miR-423-5p與心室重構(gòu)有關(guān)，但是無法得出因果結(jié)論。miR-423-5p水平升高可能是由于心室重構(gòu)引起的，也可能是引起心室重構(gòu)的重要原因，因此尚需后續(xù)進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，外周血miR-423-5p水平可反應(yīng)心力衰竭早期動(dòng)態(tài)演變過程，可作為從社區(qū)老年人群篩查心力衰竭高危患者的輔助指標(biāo)，在心血管疾病的二級(jí)預(yù)防中具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。此外，miR-423-5p與心室重構(gòu)呈獨(dú)立、顯著的正相關(guān)性，可作為老年慢性心力衰竭患者發(fā)生心室重構(gòu)的診斷因子。但我們納入的樣本有限，且本項(xiàng)研究屬于橫斷面研究設(shè)計(jì)，不能反映miR-423-5p在心力衰竭不同進(jìn)展階段的動(dòng)態(tài)變化，因此需要大樣本前瞻性研究以進(jìn)一步證實(shí)miR-423-5p在心力衰竭患者心室重構(gòu)過程中的重要作用。