南方紅豆杉水提物對(duì)NCI-N87胃癌裸鼠移植瘤凋亡作用及機(jī)制研究

鄒媛媛 王亞坤 裴靜波

[摘要] 目的 探討南方紅豆杉水提物對(duì)HER2陽性人胃癌NCI-N87細(xì)胞裸鼠移植瘤的誘導(dǎo)凋亡作用，并初步探索其作用機(jī)制。 方法 建立荷瘤裸鼠模型，將60只BALB/c裸鼠接種人HER2陽性胃癌NCI-N87細(xì)胞株并隨機(jī)分組給藥及取瘤，TUNEL法檢測(cè)移植瘤細(xì)胞凋亡，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)PI3K、AKT1、mTOR mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 ①中藥低、中、高劑量組均可見到凋亡細(xì)胞，凋亡率同對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;中劑量聯(lián)合組差異性最為顯著（P<0.01）;②紅豆杉各劑量組PI3K mRNA表達(dá)均降低（P<0.05），紅豆杉聯(lián)合赫賽汀后明顯下調(diào)AKT1 mRNA表達(dá)，紅豆杉中、低劑量組mTOR mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.05）。 結(jié)論 ①南方紅豆杉水提物可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡，聯(lián)合西藥曲妥珠單抗后并未增強(qiáng)其誘導(dǎo)作用;②南方紅豆杉水提物可部分下調(diào)PI3K、AKT1、mTOR mRNA表達(dá)水平。

[關(guān)鍵詞] 南方紅豆杉水提物;胃癌;凋亡;PI3K/AKT/mTOR

[中圖分類號(hào)] R730.5 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-9701（2019）08-0033-04

[Abstract] Objective To investigate the apoptosis effect of aqueous extract of Taxus Chinensis Var. Mairei on the transplanted tumor of nude mide with HER2-positive human gastric cancer NCI-N87 cells， and to preliminarily explore its mechanism. Methods A model of tumor-bearing nude mice was established. 60 BALB/c nude mice were inoculated into human HER2-positive gastric cancer NCI-N87 cell line and randomLy grouped for administration and tumor-removing. TUNEL assay was used to detect the apoptosis of transplanted tumor cells. The expression levels of PI3K， AKT1 and mTOR mRNA were detected by real-time fluorescent quantitative PCR. Results ①Apoptotic cells were observed in the low， medium and high dose groups of Chinese medicine， and the apoptosis rate was compared with the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）; the difference in the combined middle dose group was the most significant（P<0.01）; ②The expression of PI3K mRNA in each dose group of Taxus was decreased（P<0.05）. After Taxus combined with Herceptin， the expression of AKT1 mRNA was down-regulated significantly. The expression of mTOR mRNA in the middle and low dose groups of Taxus was significantly decreased （P<0.05）. Conclusion ①The aqueous extract of Taxus Chinensis Var. Mairei can induce apoptosis of gastric cancer cells. Its combination with Western medicine of trastuzumab does not enhance the induction;②The aqueous extract of Taxus chinensis var. mairei can partially down-regulate the expression levels of PI3K， AKT1 and mTOR mRNA.

[Key words] Aqueous extract of taxus Chinensis var. Mairei; Gastric cancer; Apoptosis; PI3K/AKT/mTOR

胃癌是常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率居高不下，最近的國(guó)家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示，胃癌在男性惡性腫瘤中發(fā)病排第2位，女性第5位，預(yù)后相對(duì)差[1，2]。發(fā)表在《柳葉刀》雜志上的全球癌癥生存趨勢(shì)監(jiān)測(cè)計(jì)劃中，中國(guó)胃癌患者的5年生存率雖然從2000～2004年的30.2%提高到2010～2014年的35.9%，卻仍舊只有韓國(guó)的一半[3]。

資料表明，有12%～35%胃癌患者HER2基因表達(dá)陽性[4，5]，在胃癌的發(fā)生中，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide-3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號(hào)通路的異常激活起著重要的作用[6]，可受HER2調(diào)控，PI3K-AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路異常激活后，可發(fā)生腫瘤疾病，并與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)[7，8]?，F(xiàn)代研究表明，紅豆杉可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，能激活T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，可以促進(jìn)白介素1、2，TNF-α，干擾素等的合成，以及調(diào)節(jié)抗體和補(bǔ)體而明顯改善免疫功能[9]。南方紅豆杉作為中藥飲片在臨床上已廣泛運(yùn)用，有效并且安全，療效明確。根據(jù)前期南方紅豆杉水提物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用的研究[10]，現(xiàn)將體外實(shí)驗(yàn)延伸到體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，通過建立人胃癌HER2陽性裸鼠移植瘤模型，進(jìn)一步研究南方紅豆杉水提物對(duì)HER2陽性胃癌移植瘤的誘導(dǎo)凋亡作用，并探索其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

南方紅豆杉，規(guī)格8 g/包，購置于本院中藥房，由寧波泰康紅豆杉生物工程有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：100513。80 g南方紅豆杉浸泡過夜，水煎3次后，將藥液混勻經(jīng)真空抽濾器過濾，電磁爐上濃縮至100 mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至40 mL，真空干燥箱中干燥，按100%濃度計(jì)算得率。曲妥珠單抗（Trastuzumab，赫賽汀，Herceptin），規(guī)格440 mg/瓶，上海羅氏制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：N3586，貯存于2℃～8℃冰箱中。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株

BALB/c裸鼠60只，4～6周齡，體重18～20 g/只。由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)批號(hào)：SCXK（滬）2013-0016，在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心特定病原體（SPF）條件下飼養(yǎng)。人NCI-N87胃癌細(xì)胞株購自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞研究所。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) ?用含有10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2飽和濕度條件培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，1～2 d更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后，加2 mL 0.25%胰酶-EDTA消化，置于培養(yǎng)箱10～15 min，待細(xì)胞全部脫落加培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞懸液移至離心管，800 rpm離心5 min，棄上清液，重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液中按1：2比例進(jìn)行傳代，每3～5天傳代一次。

1.3.2 建立模型、分組給藥 ?根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》計(jì)算[11]，裸鼠南方紅豆杉低、中、高劑量分別為：成人劑量的5倍：0.520 g/（kg·d），成人劑量的10倍：1.040 g/（kg·d），成人劑量的20倍：2.080 g/（kg·d），灌胃，共給藥3周;用傳統(tǒng)方法煎成湯劑，配制成藥液，使生藥含量分別為52 mg/mL、104 mg/mL、208 mg/mL。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)及參考文獻(xiàn)[11]，赫賽汀組首劑按40 mg/kg腹腔注射給藥，每7天一次，后兩次按20 mg/kg給藥，共給藥3次。細(xì)胞株取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的接種于動(dòng)物左側(cè)腋窩下，第7天隨機(jī)分組，60只BALB/c裸鼠分為空白組、紅豆杉高劑量組、紅豆杉中劑量組、紅豆杉低劑量組、西藥聯(lián)合紅豆杉中劑量組，西藥單藥組，共6組，每組10只。分組后即開始給藥，每次3 mL中藥濃縮液，空白組予同等體積的生理鹽水，共給藥3周，第28天取瘤。

1.4 TUNEL法檢測(cè)

各組移植瘤組織4%多聚甲醛常規(guī)固定、石蠟包埋、切片，按照表格比例配置TUNEL檢測(cè)液，每組切片滴加適量的TUNEL檢測(cè)液使其完全覆蓋，濕盒避光孵育60 min，將切片置于PBS或HBSS溶液中室溫浸洗2次，每次5 min，吸干切片上多余的水分，避免干片，滴加0.05 μg/μL的DAPI溶液，室溫濕盒避光孵育10 min，將切片置于PBS或HBSS溶液室溫浸洗3次，每次5 min，用抗熒光猝滅封片劑封片，染色結(jié)束后熒光顯微鏡下采集圖像拍片，激發(fā)波長(zhǎng)范圍450～500 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍515～565 nm。

1.5 Real-time PCR檢測(cè)

取適量保存在液氮中的移植瘤組織50 mg放入2 mL EP管中進(jìn)行組織總RNA的提取和純化，再吸取1 μL抽提的RNA進(jìn)行RNA濃度測(cè)定，若OD260/OD280為1.8～2.2之間，證明RNA純度好。引物設(shè)計(jì)及合成由上海生工公司合成。PI3K（p110α）mRNA上游引物序列為：5-ACACCACGGTTTGGACTATGG-3，下游引物序列為：5-GGCTACAGTAGTGG-GCTTGG-3，AKT1 mRNA上游引物為：5-ATGAACGACGTAGCCATTGTG-3，下游引物為：5-TTGTAGCCAATA-AAGGTGCCAT-3，mTOR mRNA上游引物為：5-ACCGGCACACATTTGAAGAAG-3，下游引物為：5-CTCGTTGAGGATCAGCAAGG-3。各組裸鼠移植瘤組織總RNA的提取和cDNA的合成按試劑說明書操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3遍，采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用（x±s）表示，各組間差異用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TUNEL法檢測(cè)移植瘤凋亡程度

Herceptin及南方紅豆杉水提物各組對(duì)移植瘤均有誘導(dǎo)凋亡作用（表1、圖1、封三圖2）。與對(duì)照組比較，紅豆杉各組及西藥組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中中劑量組作用最強(qiáng)，較低、高劑量組作用均更顯著（P<0.01），并未呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系;紅豆杉中劑量組與西藥組比較，差異不顯著（P>0.05）;紅豆杉中劑量聯(lián)合西藥組與西藥組及紅豆杉各單藥組相比，差異不顯著（P>0.05），紅豆杉低劑量、高劑量組及聯(lián)合組間差異不顯著（P>0.05）。

2.2 Real-time PCR檢測(cè)PI3K、AKT1、mTOR基因表達(dá)

結(jié)果顯示（表2、封三圖3）：與對(duì)照組相比，各治療組PI3K mRNA表達(dá)降低（P<0.05），紅豆杉中劑量組及赫賽汀組PI3K mRNA表達(dá)極顯著降低（P<0.01）;紅豆杉單藥組AKT1 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，紅豆杉中劑量組AKT1 mRNA表達(dá)較紅豆杉高、低劑量組顯著降低（P<0.05），紅豆杉聯(lián)合赫賽汀組AKT1 mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.05）;紅豆杉中劑量組mTOR mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.05），紅豆杉聯(lián)合赫賽汀組mTOR mRNA表達(dá)極顯著降低（P<0.01）。與赫賽汀組相比，紅豆杉聯(lián)合赫賽汀組各基因表達(dá)差異不顯著（P>0.05）。

3 討論

HER2屬于表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）家族，是一種原癌基因，其在組織中基因擴(kuò)增及過度表達(dá)與細(xì)胞的癌變及多種惡性腫瘤的預(yù)后關(guān)系密切。其中曲妥珠單抗（Trastuzumab，商品名Herceptin）是重組的人源化抗HER2的單克隆抗體，能與人HER2胞外受體結(jié)合，抑制HER2參與的信號(hào)傳導(dǎo)[12，13]，起抑制腫瘤的作用。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路激活可受HER2調(diào)控，HER2能活化PI3K，PI3K進(jìn)一步催化4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol4，5-bisphosphate，PIP2）轉(zhuǎn)化生成3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3，4，5-triphosphate，PIP3），轉(zhuǎn)移AKT到達(dá)細(xì)胞膜內(nèi)面，在PDK1和mTORC2作用下激活A(yù)KT，其是PI3K/AKT通路的主要節(jié)點(diǎn)，主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞抗凋亡[14]?；罨腁KT進(jìn)一步激活下游因子，如mTOR，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、凋亡和新生血管生成。AKT的三個(gè)亞型有80%以上的氨基酸序列同源性，相似的結(jié)構(gòu)，存在共同結(jié)構(gòu)特征于三個(gè)不同的功能區(qū)域，三個(gè)亞型均參與下游底物的活化[15]，其中AKT1促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖并在，并在腫瘤的發(fā)生、細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖過程中起重要作用。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的阻斷，可以通過抑制此信號(hào)通路上的各個(gè)靶點(diǎn)，例如siRNA靶向阻斷I型PI3K，從而阻斷PI3K信號(hào)通路，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡[16-18]，還可以通過阻斷AKT通路的激活，進(jìn)一步抑制其下游信號(hào)靶點(diǎn)激活從而導(dǎo)致信號(hào)通路的阻斷，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[19，20]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各治療組均存在細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象，赫賽汀單藥組也有誘導(dǎo)凋亡作用，紅豆杉水提物的抑瘤作用可以通過誘導(dǎo)凋亡發(fā)生，但隨著紅豆杉劑量的增加，并未出現(xiàn)相關(guān)濃度依賴性，即隨著藥物濃度的增高其凋亡發(fā)生情況并未增多，可以發(fā)現(xiàn)中劑量單藥組效果最好，而中劑量聯(lián)合西藥組效果并未優(yōu)于紅豆杉單藥組，也未優(yōu)于西藥組，為何這樣的一個(gè)結(jié)果？是否因藥物不同組合后，或采用不同的給藥方式后，腫瘤的發(fā)生作用有不同的改變，進(jìn)而抗瘤機(jī)制也隨之發(fā)生了相應(yīng)改變;或者在加入西藥靶向藥物曲妥珠單抗后，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)被阻滯于特定時(shí)期，曲妥珠單抗可上調(diào)細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑p27kip蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1期停滯[21]。而中藥能誘導(dǎo)凋亡作用的信號(hào)通路被抑制或者阻滯，相關(guān)靶點(diǎn)不能被激活，從而誘導(dǎo)凋亡作用下降。曲妥珠單抗可以有多途徑抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，南方紅豆杉作為中藥在運(yùn)用于腫瘤治療過程中是否影響腫瘤微環(huán)境發(fā)生改變，加入曲妥珠單抗后其介導(dǎo)免疫應(yīng)答、抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、改善細(xì)胞膜通透性及阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路等[22，23]均影響其抑瘤作用，從而產(chǎn)生這樣的結(jié)果，具體的深入機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)還從基因角度對(duì)其誘導(dǎo)凋亡機(jī)制進(jìn)行了初步探索，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同劑量組能部分下調(diào)PI3K、pAKT、mTOR基因表達(dá)，且中劑量組下調(diào)程度較其它治療組明顯，高、低劑量組及聯(lián)合組下調(diào)pAKT程度相當(dāng)，值得注意的是紅豆杉聯(lián)合赫賽汀后較紅豆杉單藥組下調(diào)各靶點(diǎn)的表達(dá)并未顯著增強(qiáng)，這些差異提示雖然部分抑制了此信號(hào)通路的激活，HER2陽性胃癌仍可以通過其他信號(hào)通路起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用。當(dāng)然我們也不能排除實(shí)驗(yàn)本身因素，NCI-N87細(xì)胞出現(xiàn)的耐藥性，我們沒有進(jìn)一步檢測(cè)，這也是課題組進(jìn)一步研究的方向，靶向藥物固然效果優(yōu)勢(shì)明顯，但不可否認(rèn)臨床上大部分接受曲妥珠單抗治療有效的患者往往1年內(nèi)產(chǎn)生耐藥[5]。

綜上所述，南方紅豆杉水提物可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡，其中劑量組誘導(dǎo)作用較強(qiáng)，與西藥組相當(dāng);南方紅豆杉水提物可以通過阻斷PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，抑制該信號(hào)通路相關(guān)靶點(diǎn)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;另外，通過實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)存在除PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路外其他旁路或下游通路等從而抑制HER2陽性胃癌發(fā)展的機(jī)制。

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