雙重保留機(jī)理下液相色譜-質(zhì)譜法直接分析18種氨基酸

楊茜 肖炳坤 楊建云 黃榮清

摘 要 采用反相和陽離子交換雙重保留機(jī)理， 無需添加離子對(duì)和衍生化試劑， 建立了18種游離氨基酸的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用直接分析方法。采用高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）系統(tǒng)， 使用OSAKA SODA CAPCELL PAK CR 1∶4 （150 mm × 2.1 mm， 5 μm; SCX∶C18=1∶4）色譜柱， 以0.1%甲酸（A）-乙腈（含0.1%甲酸）（B）-50 mmol/L甲酸銨（C）為流動(dòng)相進(jìn)行三元梯度洗脫， 對(duì)18種氨基酸進(jìn)行分離檢測， 可得到良好的分析結(jié)果。色譜峰面積精密度（RSD）范圍為0.7%～5.9%; 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好（R2=0.993～0.999）; 對(duì)SD大鼠血清和尿液樣品加樣回收率范圍為92.2%～113.6%。本方法流動(dòng)相條件簡單， 靈敏度高， 可用于血清和尿液中游離氨基酸分析， 為生物樣品中氨基酸檢測或其它復(fù)雜基質(zhì)中氨基酸的檢測提供了新的方法和思路。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法; 氨基酸分析; 非衍生化生物樣品; 雙重保留機(jī)理

1 引 言

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)， 是生命活動(dòng)中不可或缺的一類小分子物質(zhì)。對(duì)生物體內(nèi)氨基酸的分析研究， 有助于了解生命過程， 對(duì)于疾病的診斷[1，2]和藥物的研究[3，4]具有重要作用。

氨基酸的分離檢測技術(shù)一直是研究者的關(guān)注點(diǎn)之一， 盡管氨基酸分析方法多種多樣， 但改進(jìn)現(xiàn)有方法， 使其具有更好的專屬性與靈敏度一直是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題[5]?，F(xiàn)有分離方法包括毛細(xì)管電泳法、 氣相色譜法、液相色譜法等， 氨基酸分離后再通過熒光、紫外、蒸發(fā)光散射、質(zhì)譜等檢測器進(jìn)行檢測。其中， 液相色譜是一種常用分離手段。在氨基酸的液相分離中， 由于氨基酸類物質(zhì)含有氨基和羧基兩種官能團(tuán)， 一方面自身極性很強(qiáng)， 難以直接在反相C18色譜柱上得到良好保留， 另一方面紫外吸收弱， 生命體中常見的20種氨基酸中， 除酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸外， 均難以在紫外檢測器（UV）上得到高靈敏響應(yīng)。為了改善氨基酸的保留與檢測問題， 通常使用衍生化試劑在柱前或柱后對(duì)氨基酸進(jìn)行衍生。從最初的茚三酮比色分析[6]方法， 到現(xiàn)階段常用的鄰苯二甲醛（OPA）、氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）、丹磺酰氯（Dansyl-Cl）、6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯（AQC）、異硫氰酸苯酯（PITC）等衍生化試劑， 均能很好地改善氨基酸在液相色譜分析中保留差、吸收弱的缺點(diǎn)， 建立在線或離線的液相色譜分析方法[7～12]。但衍生化試劑的引入， 對(duì)衍生環(huán)境條件及氨基酸結(jié)構(gòu)要求高， 如OPA只對(duì)一級(jí)氨基酸具有衍生作用， Dansyl-Cl、PITC衍生速度慢， 操作方法繁瑣， 相對(duì)重現(xiàn)性較差[13～16]。對(duì)于生物樣品分析， 衍生化試劑的引入會(huì)將原本就復(fù)雜的體系進(jìn)一步復(fù)雜化， 增加解析的難度。

近年來， 質(zhì)譜技術(shù)的高速發(fā)展在一定程度上滿足了氨基酸高靈敏檢測的需求。氨基酸容易離子化， 在電噴霧源（ESI）正離子模式下能夠得到很好的響應(yīng)[17]， 同時(shí)由于質(zhì)譜檢測的信號(hào)為質(zhì)荷比（m/z）， 即使未能達(dá)到基線分離的情況， 也可通過不同質(zhì)荷比進(jìn)行定量分析[18]， 因此在氨基酸的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）分析中， 氨基酸在色譜柱上的保留成為關(guān)鍵。目前， 氨基酸的LC-MS分析方法多通過衍生化或添加離子對(duì)試劑改善其保留行為， 如在流動(dòng)相中添加七氟丁酸、九氟戊酸等揮發(fā)性離子對(duì)試劑[19]， 但該類物質(zhì)的加入又會(huì)在一定程度上影響質(zhì)譜離子源的離子化[20]。為了改善氨基酸在LC-MS上的保留問題， 諸多新機(jī)理的色譜柱被應(yīng)用， 如使用石墨化碳（Hypercarb）柱可將氨基酸由酸性至堿性順序洗脫[21，22]; 使用親水性相互作用（HILIC）柱可將極性氨基酸良好保留[23]等。雙重機(jī)理色譜同樣也可作為氨基酸分析的全新分離保留手段[24]， Choi等[25]利用固定相中嵌入親水性和陽離子交換配體的混合型柱對(duì)尿液中的氨基酸進(jìn)行了分析。本研究引入陽離子交換和反相作用雙重機(jī)理， 通過陽離子交換作用對(duì)氨基酸的氨基部分進(jìn)行保留， 同時(shí)通過反相作用對(duì)疏水性差異進(jìn)行識(shí)別， 增強(qiáng)分離能力。最終在LC-MS上僅使用甲酸-乙腈-甲酸銨的簡單分析體系， 無需衍生化和添加離子對(duì)試劑， 實(shí)現(xiàn)了18種氨基酸的高靈敏定量分析， 并采用此方法測定了SD大鼠血清和尿液中的氨基酸含量。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Nanospace 高效液相色譜儀系統(tǒng)， 配備脫氣機(jī)， 二元高壓泵， 高壓單泵， 高精度自動(dòng)進(jìn)樣器NASCA， 柱溫箱（日本Osaka Soda公司）; QTRAP 5500 三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國SCIEX公司）; ML204/02萬分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）; Fungilab超聲波儀（西班牙Fungilab公司）; Centrifuge H-501FR離心機(jī)（日本Kokusan公司）; Milli-Q UltrapUre Ion-Ex-TM超純水機(jī)（美國Millipore公司）。

乙腈、甲酸、甲酸銨（色譜純， 北京百靈威公司）; 18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品：甘氨酸（批號(hào)140689-201605）、丙氨酸（批號(hào)140680-201604）、脯氨酸（批號(hào)140677-201507）、纈氨酸（批號(hào)140681-200401）、蘇氨酸（批號(hào)140682-201302）、亮氨酸（批號(hào)140687-201503）、異亮氨酸（批號(hào)140683-201302）、組氨酸（批號(hào)140693-201803）、苯丙氨酸（批號(hào)140676-201706）、精氨酸（批號(hào)140685-201003）、酪氨酸（批號(hào)140609-201513）購于中國藥品生物制品檢定所; 絲氨酸（批號(hào)20121017）天冬氨酸（批號(hào)20130717）、天冬酰胺（批號(hào)20130308）、賴氨酸（批號(hào)20131104）、谷氨酸（批號(hào)20130717）、甲硫氨酸（批號(hào)20130702）和色氨酸（批號(hào)20130418）購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q系統(tǒng)制備的超純水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 色譜條件 采用CAPCELL PAK CR 1∶4（150 mm×2.1 mm， 5 μm）色譜柱（日本Osaka Soda公司）， 流動(dòng)相為0.1%甲酸（A）-乙腈（含0.1%甲酸）（B）-50 mmol/L甲酸銨（C）， 采用梯度洗脫： 0～3.0 min， 100% A， 0.2 mL/min; 3.0～10.0 min， 100%～30% A， 0%～70% B， 0.2～0.3 mL/min; 10.0～15.0 min， 0%～100% C， 0.3 mL/min; 15.0～20.0 min， 100% C， 0.3 mL/min; 20.0～20.1 min， 0%～100% A， 0.3 mL/min; 20.1～30.0 min， 100% A， 0.3 mL/min。柱溫35℃， 進(jìn)樣量2 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 Turbo-V電噴霧離子源， 采用正離子模式檢測， 噴霧電壓5500 V， 離子源溫度400℃， 噴霧氣體（GAS1）20 psi， 干燥氣體（GAS2）20 psi， 氣簾氣（Curtain GAS）20 psi。采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式， 入口電壓（EP）10 V， 碰撞室出口電壓（CXP）10 V， 各個(gè)物質(zhì)母離子、子離子、去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE）等參數(shù)見表1。

2.2.3 樣品制備? （1）混合對(duì)照品溶液的制備 分別稱取甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、賴氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品， 精密稱定后， 酪氨酸和天冬氨酸使用0.1% （V/V）氨水溶解， 苯丙氨酸使用50% （V/V）乙腈溶解， 其余氨基酸均使用超純水溶解， 制成對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別移取適量對(duì)照品儲(chǔ)備液， 加流動(dòng)相A稀釋成混合對(duì)照品溶液（甘氨酸3.08 μg/mL、丙氨酸0.5 μg/mL、絲氨酸0.6 μg/mL、脯氨酸0.1 μg/mL、纈氨酸0.15 μg/mL、蘇氨酸0.8 μg/mL、亮氨酸0.145 μg/mL、異亮氨酸0.145 μg/mL、天冬氨酸0.115 μg/mL、天冬酰胺0.9 μg/mL、賴氨酸0.2 μg/mL、谷氨酸0.7 μg/mL、甲硫氨酸0.550 μg/mL、組氨酸0.275 μg/mL、苯丙氨酸0.140 μg/mL、精氨酸0.7 μg/mL、酪氨酸0.2 μg/mL、色氨酸0.375 μg/mL）， 搖勻， 備用。（2）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠6只， 飼養(yǎng)室光照12 h， 黑暗12 h， 模擬正常環(huán)境， 室溫（25±2）℃， 相對(duì)濕度35%～45%。適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后， 常規(guī)飼料飼養(yǎng)一周， 自由飲水， 置于代謝籠中收集12 h尿液后， 第二日腹主動(dòng)脈取血， 12000 r/min離心后獲得血清。（3）血清樣品前處理 取血清50 μL， 加入200 μL超純水， 振蕩30 s后超聲10 min， 取50 μL， 加入200 μL乙腈沉淀蛋白， 再次振蕩并超聲， 12000 r/min離心15 min， 上清液過0.22 μm濾膜， 用流動(dòng)相A稀釋10倍， 待上樣分析。（4）尿液樣品前處理 取200 μL尿液， 12000 r/min離心5 min， 取50 μL上清液， 加入200 μL超純水， 振蕩30 s后超聲10 min。取50 μL， 加入200 μL乙腈沉淀蛋白， 再次振蕩并超聲， 12000 r/min離心15 min， 上清液過0.22 μm濾膜， 使用流動(dòng)相A稀釋10倍， 待上樣分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 保留模式的選擇

為了實(shí)現(xiàn)氨基酸類物質(zhì)在液相色譜柱上的良好保留， 考察了不同機(jī)理色譜柱的保留能力。首先使用反相模式C18色譜柱（CAPCELL PAK C18 MGIII 150 mm × 2.1 mm， 5 μm）進(jìn)行分析， 3 min內(nèi)以0.1%甲酸進(jìn)行反相保留， 在隨后的12min逐漸添加有機(jī)相乙腈至80%比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸以外的氨基酸保留時(shí)間均不足2min， 出峰均在死時(shí)間附近， 因此使用反相色譜柱在不衍生、不添加離子對(duì)試劑的情況下， 無法將大多數(shù)氨基酸良好保留。

氨基酸為兩性化合物， 通過調(diào)整pH值可使其帶正電荷或負(fù)電荷， 因此可使用離子交換模式進(jìn)行保留。本研究考察了直接使用陽離子交換型SCX（CAPCELL PAK SCX 150 mm×2.1 mm， 5 μm）色譜柱進(jìn)行分析的效果。在陽離子交換機(jī)理下， 反相機(jī)理中無法保留的甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、谷氨酸得到保留， 但出峰時(shí)間均較為接近， 堿性氨基酸（組氨酸、精氨酸和色氨酸）由于保留過強(qiáng)， 在50 mmol/L甲酸銨緩沖鹽條件下無法洗脫。因此， 考慮將反相和陽離子交換機(jī)理相結(jié)合， 通過一定的陽離子交換作用實(shí)現(xiàn)氨基酸的保留， 同時(shí)在反相機(jī)理的參與下也更有利于氨基酸分離與洗脫。色譜柱選擇混合填料型（混合比SCX∶C18=1∶4）的CAPCELL PAK CR 1∶4（150 mm×2.1 mm， 5 μm）與鍵合型（硅膠球孔內(nèi)鍵合反相和陰離子交換特性的固定相， 硅膠球間鍵合陽離子交換的固定相）Acclaim Trinity P1（100 mm×3.0? mm， 5 μm）兩種同時(shí)具有離子交換與反相作用的色譜柱進(jìn)行比較分析。在離子交換和反相雙重機(jī)理作用下， CR或P1色譜柱對(duì)極性氨基酸的保留時(shí)間均延長至3 min以上， 雙重機(jī)理CR色譜柱和反相C18色譜柱的保留時(shí)間對(duì)比見表2， 在雙重機(jī)理模式作用下， C18色譜柱無法保留的天冬酰胺、天冬氨酸、絲氨酸等氨基酸均獲得了良好保留， 實(shí)現(xiàn)了氨基酸的非衍生化法直接保留。由于P1色譜柱對(duì)精氨酸、組氨酸和苯丙氨酸峰型拖尾， 峰寬超過2 min， 最終選擇CR色譜柱進(jìn)行了分析方法建立。

3.2 流動(dòng)相的選擇和梯度條件優(yōu)化

在雙重保留機(jī)理色譜柱上， 對(duì)于反相疏水作用使用乙腈（B）為洗脫溶劑， 對(duì)于離子交換作用使用甲酸銨（C）作為洗脫溶劑， 在三元梯度條件下進(jìn)行方法建立?？疾旒姿徜@濃度在10、25和50 mmol/L時(shí)的洗脫效果， 結(jié)果表明， 使用10和25 mmol/L甲酸銨， 無法將組氨酸和精氨酸洗脫， 因此最終選擇使用50 mmol/L甲酸銨作為洗脫溶劑。x3.3 回收率及提取條件優(yōu)化

對(duì)血清和尿液樣品添加標(biāo)準(zhǔn)品后（添加濃度： 甘氨酸3.0 μg/mL、丙氨酸50.0 μg/mL、絲氨酸60.0 μg/mL、 脯氨酸10.0 μg/mL、纈氨酸15.0 μg/mL、蘇氨酸80.0 μg/mL、亮氨酸14.5 μg/mL、異亮氨酸14.5 μg/mL、天冬氨酸11.5 μg/mL、天冬酰胺9.0 μg/mL、賴氨酸20.0 μg/mL、谷氨酸7.0 μg/mL、甲硫氨酸5.5 μg/mL、組氨酸27.5 μg/mL、苯丙氨酸14.0 μg/mL、精氨酸70.0 μg/mL、酪氨酸20.0 μg/mL、色氨酸37.5 μg/mL）， 按照2.2.3節(jié)方法進(jìn)行前處理， 血清樣品加樣回收率為92.2%～113.6%; 尿液樣品加樣回收率為95.2%～109.3%。

在加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)， 若直接使用乙腈沉淀血清和尿液中的蛋白， 會(huì)導(dǎo)致溶解度低的氨基酸回收率較差， 如谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸用此方法的回收率約為80%。為了避免前處理過程中可能的氨基酸損失， 優(yōu)化了前處理方案， 采取先加4倍量水到血清（尿液）中進(jìn)行稀釋并提取氨基酸后， 再加入乙腈沉淀蛋白。通過改善前處理方法， 血清的加標(biāo)回收率由76.1%～96.9%上升至92.2%～113.6%， 尿液加標(biāo)回收率由75.5%～101.6%上升至95.2%～109.3%。

3.4 線性范圍、定量限和精密度

4 結(jié) 論

使用反相和離子交換雙重機(jī)理型色譜柱， 在不衍生化、不添加離子對(duì)試劑的簡單條件下， 實(shí)現(xiàn)了18種氨基酸的LC-MS/MS分離和定量測定。本方法操作簡單， 靈敏度高， 雖然目前尚未將同分異構(gòu)體氨基酸良好分離（如亮氨酸和異亮氨酸）， 但此方法為生物樣品中氨基酸檢測或其它復(fù)雜基質(zhì)中游離氨基酸的檢測提供了新的方法和思路。

References

1 Piraud M， Ruet S， Boyer S， Acquaviva C， Clerc-Renaud P， Cheillan D， Vianey-Saban C. Methods Mol. Biol.， 2011， 708： 25-53

2 Kiriyama Y， Nochi H. Scientifica （Cairo）， 2016， ID6494621

3 Adriana I， Maxime L， Diana L V， Dana C， Marie-Anne L， Bruno O V， Maria A M. Drug Discov. Today， 2017， 22（2）： 366-376

4 Zimmerman E S， Heibeck T H， Gill A， Li X F， Murray C J， Madlansacay M R， Cuong Tran， Nathan T U， Yin G， Rivers P J， Yam A Y， Wang W D， Steiner A R， Bajad S U， Penta K， Yang W， Hallam T J. Bioconjugate Chem.， 2014， 25： 351-361

5 Hannelore K， Katja D， Wolfram G， Peter J O. Anal. Bioanal. Chem.， 2009， 393（2）： 445-452

6 LIU Chang-Jiao， YANG Yue-Yue， WANG Ni， YU Ping. China Food Additives， 2018， （1）： 189-195劉長姣， 楊越越， 王 妮， 余 平. 中國食品添加劑， 2018， （1）： 189-195

7 SU Jian-Kun， WANG Xue， LU Jian-Qiu， QIAO Yan-Jiang， GAO Xiao-Yan. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae， 2012， 18（15）： 135-138蘇建坤， 王 雪， 盧建秋， 喬延江， 高曉燕. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2012， 18（15）： 135-138

8 LU Ming， SUN Dai-Ni， WANG Yang， SHAO Hong. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis， 2010， 30（12）： 2323-2327陸 明， 孫黛妮， 汪 楊， 邵 泓. 藥物分析雜志， 2010， 30（12）： 2323-2327

9 HE Xin-Rui， WU Zhong-Yong， YE Ying-Li， GAO Xu-Dong， CHEN Shi-En， MA Zhong-Ren. Journal of Instrumental Analysis， 2016， 35（7）： 922-928赫欣睿， 武中庸，? 葉永麗，? 高旭東，? 陳士恩，? 馬忠仁. 分析測試學(xué)報(bào)， 2016， 35（7）： 922-928

10 WANG Yuan， WANG Hai-Long， JIN Gao-Wa， ZHANG Fei-Fang， YANG Bing-Cheng， LIANG Xin-Miao. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Materia-World Science and Technology， 2014， 16（6）： 1347-1352汪 媛， 王海龍， 金高娃， 章飛芳， 楊丙成， 梁鑫淼. 世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化， 2014， 16（6）： 1347-1352

11 DING Ya-Yun， XIE Meng-Xia， DENG Zhi-Wei. Journal of Beijing Normal University（Natural Science）， 2001， 37（4）： 526-529丁雅韻， 謝孟峽， 鄧志威. 北京師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2001， 37 （4）： 526-529

12 WANG Wei-Hao， YANG Bin. Chinese Pharmaceutical Journal， 2017， 52（5）： 372-376王維皓， 楊 濱. 中國藥學(xué)雜志， 2017， 52（5）： 372-376

13 Tapuhi Y， Schich D E， Lindner W. Anal. Biochem.， 1981， （115） ： 123-129

14 Ni J J， Li X， Li W， Wu L J. Biomed. Chromatogr.， 2016， 30（11）： 1796-1806

15 Muramoto K， Kamiya H， Kawauchi K. Anal. Biochem.， 1984， 141： 446-450

16 Zhang G H， Jin W W， Fan P， Feng X N， Bai Y， Tao T， Yu L J. Int. J. Mass Spectrom.， 2015， 392： 1-6

17 ZHANG Jie，GE Yong-Hui， YANG Hui， ZHU Wen-Jing， ZHANG Xiang-Min， GENG Zhao-Liang. Tobacco Science & Technology， 2017， 50（11）： 58-65張 婕， 葛永輝， 楊 慧， 朱文靜， 章向敏， 耿召良. 煙草科技， 2017， 50（11）： 58-65

18 Krumpochov P， Bruyneel B， Molenaar D， Koukou A， Wuhrer M， Niessen W M. A， Giera M. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2015， 114： 398-407

19 LI Peng-Fei， TAO Pei-Pei， ZHANG Xu-De， AN Zhuo-Ling， ZHANG Qian， LI Yue， HAO Qian-Qian， LIU Li-Hong. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（9）： 1347-1352李鵬飛， 陶蓓蓓， 張緒得， 安卓玲， 張 茜， 李 悅， 郝倩倩， 劉麗宏. 分析化學(xué)， 2013， 41（9）： 1347-1352

20 Waterval W A H， Scheijen J L J M. Ortmans-Ploemen M M J C， Habets-vander Poel C D， Bierau J. Clin. Chim. Acta，2009， 407： 36-42

21 Lea A， Ngb A， Kwanb A， Cusmano-Ozoga K， Cowana T M. J. Chromatogr. B，2014， 944： 166-174

22 HUANG Xin， LI Shuai-Ping， ZHANG Yong， LIU Shu-Ying. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， 44（11）： 1652-1658黃 鑫， 李帥坪， 張 勇， 劉淑瑩. 分析化學(xué)， 2016， 44（11）： 1652-1658

23 LI Tai-Feng， XUE Wei， LI Min， SHI Ai-Xin， LI Ke-Xin. Chinese Journal of New Drugs， 2015， 24（14）： 1659-1664李泰鋒， 薛 薇， 李 敏， 史愛欣， 李可欣. 中國新藥雜志， 2015， 24（14）： 1659-1664

24 Vilches A P， Norstrm S H， Bylund D. J. Sep. Sci.， 2017， 40（7）： 1482-1492

25 Choi M S， Rehman S U， Kima I S， Park H J， Song M Y， Yoo H H. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2017， 145： 52-58