胃蛋白酶結(jié)合柱后在線還原法分析重組人粒細(xì)胞刺激因子的二硫鍵

劉海龍 任偉成 宗利 王英武

摘 要 建立了一種利用胃蛋白酶在酸性條件下酶切，結(jié)合柱后在線還原法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)分析蛋白質(zhì)二硫鍵的方法。在酸性體系中，采用胃蛋白酶水解蛋白質(zhì)，能夠最大限度地維持蛋白質(zhì)二硫鍵的原有構(gòu)象; 柱后在線還原法的應(yīng)用能夠彌補(bǔ)胃蛋白酶酶切位點(diǎn)專一性差、數(shù)據(jù)解析困難等不足。本研究將二者相結(jié)合并成功用于分析重組人粒細(xì)胞刺激因子（rhG-CSF）的二硫鍵和未配對半胱氨酸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用本方法測得經(jīng)N-乙酰馬來酰亞胺烷基化處理的rhG-CSF中二硫鍵配對方式為Cys36-Cys42和Cys64-Cys74，Cys17全部被烷基化試劑結(jié)合，且未檢測到二硫鍵錯配，實(shí)現(xiàn)了二硫鍵的完全定位。不經(jīng)過烷基化處理，采用本方法測得rhG-CSF中Cys36-Cys42、Cys64-Cys74和Cys17的錯配比例分別為9.1%、0%和12.6%; 基于胰凝乳蛋白酶的常規(guī)方法檢測到的二硫鍵錯配比例依次為73.4%、58.1%和97.5%; 采用Glu-C和胰蛋白酶聯(lián)合酶解的常規(guī)方法檢測到的錯配比例依次為40.3%、5.2%和22.3%。與常規(guī)方法相比，本方法檢測到的二硫鍵錯配比例更低，測定結(jié)果能夠更準(zhǔn)確地反映二硫鍵在蛋白分子內(nèi)的實(shí)際存在狀態(tài)。

關(guān)鍵詞 胃蛋白酶; 二硫鍵; 柱后在線還原法; 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng); 重組人粒細(xì)胞刺激因子

1 引 言

二硫鍵是一種常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾類型，在穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)[1，2]、維持構(gòu)象及發(fā)揮生物活性等方面有著非常重要的作用[3～7]。在蛋白質(zhì)藥物中，二硫鍵構(gòu)型也是一個非常關(guān)鍵的質(zhì)量屬性[8]。二硫鍵構(gòu)型分析，有利于深入地了解蛋白質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)[9，10]，對蛋白質(zhì)藥物的研發(fā)和質(zhì)量控制具有重要意義。目前，準(zhǔn)確分析蛋白質(zhì)的二硫鍵組成仍是一個較大的挑戰(zhàn)[11～13]，這是由于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，隨著蛋白質(zhì)分子內(nèi)含有半胱氨酸數(shù)目的增多，其可能存在的二硫鍵配對方式呈指數(shù)級增長，解析難度也相應(yīng)增加。此外，二硫鍵錯配現(xiàn)象的存在也會影響二硫鍵分析[14]。二硫鍵錯配可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯誤折疊、聚合和失活[15～17]，二硫鍵錯配可能源自蛋白質(zhì)本身，也可能源自樣品處理或數(shù)據(jù)采集等過程。因此，為了得到準(zhǔn)確的二硫鍵構(gòu)型及控制蛋白藥物的二硫鍵錯配比例，盡可能降低樣品處理和檢測過程中的二硫鍵錯配是至關(guān)重要的。

近年來，在二硫鍵定位研究中常采用如下策略： 首先選擇合適的蛋白水解酶水解蛋白質(zhì)，再取出一部分酶解液做還原處理，最后將還原前和還原后的酶解液分別采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（LC-MS/MS）進(jìn)行檢測，通過對比還原前后的肽圖找到差異肽段，確定蛋白質(zhì)二硫鍵的連接方式[18～20]。研究表明，酶的選擇和酶解體系都會影響二硫鍵錯配，當(dāng)其它條件一定時，酶解液pH值越低，二硫鍵錯配程度越低[21]; 常見的蛋白水解酶（如胰蛋白酶、Lys-C酶和胰凝乳蛋白酶）的最適pH值一般為7～9，弱堿性環(huán)境將促進(jìn)二硫鍵的重排[22]，當(dāng)pH≤6時，酶活性下降，不能對蛋白進(jìn)行充分酶解; 嗜熱菌蛋白酶（Thermolysin）能夠在弱酸性條件下水解蛋白質(zhì)，但較容易引起二硫鍵錯配; Glu-C酶的水解位點(diǎn)一般僅限于天冬氨酸和谷氨酸殘基，在水解分子量較大的蛋白質(zhì)時，具有一定的局限性。蛋白質(zhì)分子內(nèi)如存在未配對半胱氨酸，也可引起二硫鍵錯配[23]。對于此類蛋白質(zhì)，通常需要先對半胱氨酸進(jìn)行烷基化處理之后再進(jìn)行酶解，如果未配對半胱氨酸被包裹于分子內(nèi)部，烷基化過程將難以順利進(jìn)行。因此，開發(fā)一種能夠減少二硫鍵錯配的分析方法，對蛋白質(zhì)的二硫鍵研究具有重要意義。

胃蛋白酶是存在于哺乳動物胃液中的一種消化性蛋白酶，在pH 1～5范圍內(nèi)能發(fā)揮較高的活力。胃蛋白酶常見的酶解位點(diǎn)一般為F、L、W、Y、A、E、Q、S 和 T[24]，由于胃蛋白酶的作用位點(diǎn)較多，且對不同作用位點(diǎn)的酶切效率不同，導(dǎo)致酶解片段復(fù)雜程度較高，譜圖難以解析，從而限制了其在蛋白質(zhì)二硫鍵分析領(lǐng)域的應(yīng)用[25]。柱后在線還原法是將還原劑以流動注射的方式與色譜流出端混合，并注入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測的一種方法[26～28]。借助于該方法，含有二硫鍵的肽段從色譜柱流出后、進(jìn)入離子源之前被迅速還原，其還原產(chǎn)物的信號可直接被質(zhì)譜儀捕獲，省去了對含二硫鍵肽段（簡稱二硫肽）的逐個收集、濃縮和還原等繁瑣步驟。在原理上，柱后在線還原法的應(yīng)用可彌補(bǔ)胃蛋白酶的不足，在兼顧低豐度信號的同時，使肽質(zhì)量圖譜的解析難度和實(shí)驗(yàn)成本都大大降低。

分 析 化 學(xué)第47卷

第4期劉海龍等： 胃蛋白酶結(jié)合柱后在線還原法分析重組人粒細(xì)胞刺激因子的二硫鍵

重組人粒細(xì)胞刺激因子（rhG-CSF）是一種由174個氨基酸組成的蛋白質(zhì)（其氨基酸序列見圖1），它包含兩對分子內(nèi)二硫鍵和一個未配對半胱氨酸[29，30]。rhG-CSF分子內(nèi)未配對半胱氨酸與分子穩(wěn)定性密切相關(guān)[23]，也正是它的存在使得rhG-CSF產(chǎn)生二硫鍵錯配的風(fēng)險(xiǎn)大大增高。已有研究表明，在rhG-CSF中存在較高比例的二硫鍵錯配[14]，這可能對rhG-CSF藥物的安全性和有效性造成較大影響。因此，準(zhǔn)確分析rhG-CSF的二硫鍵配對情況在藥品研發(fā)和質(zhì)量控制中顯得尤為重要。本研究以rhG-CSF為研究對象，利用胃蛋白酶酶切結(jié)合柱后在線還原法和LC-MS/MS對其進(jìn)行二硫鍵和未配對半胱氨酸的定位分析，并分別在經(jīng)過NEM烷基化處理和不做烷基化處理的情況下，與基于胰凝乳蛋白酶、Glu-C酶+胰蛋白酶的常規(guī)分析方法進(jìn)行對比，考察二硫鍵錯配情況，并探究在樣品處理過程中二硫鍵錯配的成因及避免（或降低）的方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Exion30AD型超高效液相色譜儀和Triple TOF 6600型高分辨質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司）; 1 mL流動進(jìn)樣針（瑞士Hamilton公司）。

rhG-CSF原液（純度>97%，濃度為11 mg/mL）來源于大腸桿菌發(fā)酵，采用KTAavant系統(tǒng)（美國GE公司）純化。NaOH（純度96%）、檸檬酸（純度99.5%）和HCl（36%～38%，w/V）購自北京化工廠; 二硫蘇糖醇（DTT，美國Promega公司）; N-乙基馬來酰亞胺（NEM）、乙腈（質(zhì)譜級）和鹽酸胍（6 mol/L溶液）購自美國ThermoFisher公司; 胃蛋白酶（Pepsin）、三羥甲基氨基甲烷（Tris，純度>99%）、三（2-羧乙基）膦（TCEP，純度≥98%）和氨水（質(zhì)量分?jǐn)?shù)28%）購自Sigma-Aldrich公司; 胰蛋白酶（Trypsin）、Glu-C蛋白內(nèi)切酶和胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）均為測序級，購自瑞士羅氏公司; 三氟乙酸（質(zhì)譜級）購自日本和光純藥工業(yè)株式會社; 超濾離心管（MWCO 3 kDa）購自德國賽多利斯公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水，采用Milli-Q純水系統(tǒng)（德國默克公司）制備。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 rhG-CSF的烷基化 使用超濾離心管（MWCO 3 kDa）將rhG-CSF溶液置換為含3 mol/L鹽酸胍的50 mmol/L檸檬酸緩沖液（pH=5.0），將rhG-CSF終濃度控制為1 mg/mL。按體積比50∶1（蛋白∶NEM溶液）加入0.1 mol/L NEM溶液，25℃孵育4 h。

2.2.2 rhG-CSF的胃蛋白酶酶解 將經(jīng)過NEM烷基化處理和未經(jīng)烷基化處理的rhG-CSF樣品使用0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（以NaOH調(diào)至pH=3.0）進(jìn)行緩沖液置換，并將蛋白終濃度控制為1 mg/mL。按照質(zhì)量比40：1（蛋白：酶）加入胃蛋白酶，混勻后置于37℃水浴中孵育16 h，取出后置于4℃終止反應(yīng)。將酶解液取出一部分進(jìn)行還原處理，以1 mol/L TCEP為還原劑，按照體積比100∶1（酶解液∶還原劑）將還原劑加入酶解液中，混勻后，室溫孵育30 min。

2.2.3 rhG-CSF的常規(guī)酶解 將經(jīng)過NEM烷基化處理和未經(jīng)烷基化處理的rhG-CSF樣品使用0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）進(jìn)行緩沖液置換，并將蛋白終濃度控制為1 mg/mL，等量分裝。分別向兩支烷基化處理的rhG-CSF中加入胰凝乳蛋白酶和Glu-C酶，蛋白質(zhì)和酶的質(zhì)量比為40∶1。將上述混合液置于37℃水浴中孵育16 h，取出后置于4℃終止反應(yīng); Glu-C酶酶解樣品按質(zhì)量比40∶1（蛋白∶酶）補(bǔ)加胰蛋白酶，37℃繼續(xù)孵育16 h后取出，置于4℃終止反應(yīng)。未經(jīng)烷基化的rhG-CSF酶解樣品按照上述步驟同步處理。各酶解樣品均取出一部分進(jìn)行還原處理： 使用1 mol/L DTT作為還原劑，按體積比100∶1（酶解液∶還原劑）加入酶解液中，混勻后室溫孵育30 min。

2.3 液相色譜與質(zhì)譜測定參數(shù)

2.3.1 LC-MS/MS檢測

將還原處理的酶解液和未經(jīng)還原處理的酶解液均采用LC-MS/MS進(jìn)行檢測。選用Waters peptide BEH C18 色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司）進(jìn)行色譜分離，柱溫為50℃，進(jìn)樣體積30 μL，流動相A為0.05% TFA-超純水，流動相B為0.05% TFA-乙腈，流速0.2 mL/min。梯度洗脫程序： 0～80 min，0～37% B; 80～90 min，37%～46.5% B; 90～95 min，90% B。質(zhì)譜儀在正離子模式下運(yùn)行，一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜采集范圍分別為m/z 300～2000和m/z 50～2200。 GS1和GS2均設(shè)定為50，CUR為35，離子源溫度550℃，噴霧電壓5500 V。

2.3.2 柱后在線還原法結(jié)合LC-MS/MS檢測 rhG-CSF的酶解產(chǎn)物須另采用柱后在線還原法結(jié)合LC-MS/MS進(jìn)行檢測。在線還原劑為含有0.2 mol/L DTT的9%氨水溶液，流速5 μL/min。柱后在線還原裝置的構(gòu)建方法如下： 將流動注射針、液相色譜紫外檢測器的流出端和離子源以三通相連（圖2），離子源和三通之間的流路體積控制在25～50 μL之間，目的是在減少色譜峰的擴(kuò)散作用同時保證還原反應(yīng)的順利進(jìn)行。其它色譜和質(zhì)譜條件同2.3.1節(jié)。

2.4 LC-MS/MS數(shù)據(jù)分析

rhG-CSF的胃蛋白酶酶解樣品經(jīng)LC-MS/MS 采集所得原始數(shù)據(jù)文件（. wiff 和. wiff. scan文件）后，采用PEAKS軟件（版本號8.5，美國ThermoFisher公司）進(jìn)行肽段分析，根據(jù)圖1在軟件中輸入rhG-CSF的氨基酸序列，選擇搜庫模式并設(shè)置參數(shù)為胃蛋白酶酶切、分子量誤差20 ppm、Spider檢索。rhG-CSF的胰凝乳蛋白酶酶切和 Glu-C+胰蛋白酶酶切所得原始數(shù)據(jù)分別采用BioPharmaView軟件（版本號2.0，美國AB Sciex公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，輸入rhG-CSF的氨基酸序列和所有可能形成的二硫鍵配對方式（包括自身錯配），選擇Peptide Mapping模式，并在“Digest Agent”選項(xiàng)中選擇對應(yīng)的酶，最多漏切位點(diǎn)數(shù)目設(shè)為4個。

3 結(jié)果與討論

3.1? rhG-CSF的二硫鍵定位和未配對半胱氨酸分析

由于胃蛋白酶的酶切位點(diǎn)較多，且表現(xiàn)在各個酶切位點(diǎn)的活力各不相同，導(dǎo)致經(jīng)常有不完全酶解的情況出現(xiàn)，使酶切肽圖過于復(fù)雜而難以解析。應(yīng)用柱后在線還原法，可在一次進(jìn)樣中采集到所有二硫肽還原產(chǎn)物的信號，將其與不采用柱后在線還原法所獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，在每個二硫肽所對應(yīng)的保留時間處找到其還原產(chǎn)物，采用數(shù)據(jù)分析軟件對還原產(chǎn)物的一級、二級質(zhì)譜進(jìn)行解析，推測出蛋白質(zhì)二硫鍵連接方式。

經(jīng)NEM烷基化處理的rhG-CSF胃蛋白酶酶解肽圖中，有8個色譜峰在還原后發(fā)生變化，色譜峰的保留時間分別為30.8、35.3、40.1、67.9、70.7、72.1、73.8 和75.8 min，依次命名Peak 1～Peak 8（圖3）。

未還原的rhG-CSF的胃蛋白酶酶解肽圖中，Peak 1～Peak 8對應(yīng)肽段的分子量分別為1806.87、1788.85、1771.82、2831.45、2380.22、2616.36、2944.54和2550.32 Da。經(jīng)柱后在線還原處理的質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示： 保留時間為30.8 min的色譜峰1還原后產(chǎn)生分子量為690.36和1118.57 Da 的兩個肽段，分別對應(yīng)氨基酸序號為32～37和38～46，其二級質(zhì)譜信號與理論值匹配良好（圖4A和圖4B）。保留時間為35.3 min的色譜峰2還原后僅產(chǎn)生一個分子量為1790.86 Da的肽段，比原肽段增加2 Da。鑒定結(jié)果顯示此肽段的氨基酸序號為32～46，其二級質(zhì)譜信號與理論值匹配良好（圖4C），該肽段包含2個半胱氨酸，它們互相結(jié)合形成二硫鍵。保留時間為40.1 min 的色譜峰3還原后產(chǎn)生一個分子量為1773.83 Da的肽段，分子量比35.3 min的色譜峰小17 Da，經(jīng)鑒定該肽段氨基酸序號為32～46，第32位谷氨酰胺發(fā)生了焦谷氨酸化，其二級質(zhì)譜信號與理論值匹配度較高（圖4D）。上述3個色譜峰所包含的二硫鍵均為Cys36-Cys42。

Peak 4～Peak 8經(jīng)在線還原后分別產(chǎn)生分子量為2833.46、2382.24、2618.38、2946.56和2552.33 Da的肽段，PEAKS軟件鑒定結(jié)果顯示，上述肽段對應(yīng)氨基酸序號分別為50～77、 56～78、 50～75、 50～78 和54～78，其二級質(zhì)譜分別對應(yīng)圖5A～5E。肽段的氨基酸序列和b/y離子匹配情況標(biāo)記在相應(yīng)的質(zhì)譜圖中，5個肽段的二級碎片與各自理論值均匹配良好。由氨基酸序列可知，Peak 4～Peak 8所對應(yīng)的5個肽段均含有Cys64和Cys74，且還原后肽段分子量均增加2 Da，因此可推斷Cys64和Cys74結(jié)合形成鏈內(nèi)二硫鍵。

經(jīng)過烷基化處理，rhG-CSF中未配對半胱氨酸的側(cè)鏈巰基與NEM結(jié)合。利用PEAKS軟件分析上述樣品的胃蛋白酶酶解肽圖數(shù)據(jù)，找到被NEM修飾的肽段，從而確定未配對半胱氨酸的位置。結(jié)果表明，保留時間為31.7和34.6 min的兩個色譜峰（分子量分別為857.46和729.40 Da）被鑒定為被NEM修飾的肽段，對應(yīng)氨基酸序號分別為15～20和15～19，對應(yīng)的二級質(zhì)譜圖分別見圖6A和圖6B，二級碎片離子與理論值匹配良好（肽段氨基酸序列和b/y離子匹配情況均標(biāo)注在圖中），這兩個肽段中被NEM修飾的位點(diǎn)均為第17位半胱氨酸。第19位谷氨酸存在不完全酶解現(xiàn)象，但不影響對結(jié)果的判定。根據(jù)上述結(jié)果可以確定，在rhG-CSF中第17位半胱氨酸為未配對半胱氨酸。

綜上可知，經(jīng)烷基化處理的rhG-CSF二硫鍵配對方式為Cys36-Cys42、 Cys64-Cys74，Cys17與NEM結(jié)合，與文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致。此外，在rhG-CSF分子中未發(fā)現(xiàn)天然的二硫鍵錯配信號。

3.2 rhG-CSF在不同酶和酶解條件下的二硫鍵錯配研究

在rhG-CSF的二硫鍵鑒定中，為了考察不同前處理?xiàng)l件（包括是否做烷基化處理、酶和酶切條件的選擇）對鑒定結(jié)果的影響，選擇胰凝乳蛋白酶和Glu-C酶+胰蛋白酶在pH 8.0的Tris-HCl體系下分別酶切，用LC-MS/MS對酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測，借助BioPharmaView軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。此外，利用胃蛋白酶

對于經(jīng)過NEM烷基化處理的rhG-CSF，在pH 8.0的Tris-HCl緩沖液體系下用胰凝乳蛋白酶和用Glu-C+胰蛋白酶組合分別水解rhG-CSF，均檢測到了不同程度的二硫鍵錯配（表1），而在胃蛋白酶酶切樣品中則未檢測到二硫鍵錯配，說明當(dāng)分子內(nèi)不存在未配對半胱氨酸時，使用胃蛋白酶在pH 3.0緩沖液中酶解，能夠極大地抑制二硫鍵間的交換作用。而對比Glu-C+胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶切結(jié)果，未能檢測到Cys17的錯配， 說明烷基化反應(yīng)較為徹底; Cys36-Cys42和Cys64-Cys74均檢測到一定比例的錯配，但均<3%，表明當(dāng)溶液中不存在未配對半胱氨酸時，在pH 8.0 Tris-HCl 緩沖液中二硫鍵交換作用也會發(fā)生，但比較微弱。

對不經(jīng)過烷基化處理的rhG-CSF，分析結(jié)果顯示其在3種酶切體系中均發(fā)生了一定程度的二硫鍵錯配（表1），其中胃蛋白酶酶切所得二硫鍵錯配比例最低，Glu-C+胰蛋白酶次之，胰凝乳蛋白酶酶切的錯配比例最高。主要的二硫肽及含有未配對半胱氨酸肽段的鑒定結(jié)果（包括錯配形式）見表2。

含有Cys17的肽段也能夠相互結(jié)合形成二硫鍵，這是一種“自身錯配”形式。由表1中括號部分可知，胃蛋白酶酶切所得自身錯配的比例為6.5%，遠(yuǎn)低于胰凝乳蛋白酶和Glu-C+胰蛋白酶酶切所得的自身錯配比例（依次為24.1%和21.0%），上述差異可能與酶切體系的pH值有關(guān)，胃蛋白酶酶切的酸性體系能夠顯著抑制自身錯配的產(chǎn)生。

4 結(jié) 論

建立了一種基于胃蛋白酶和柱后在線還原法分析蛋白質(zhì)二硫鍵的方法，并實(shí)現(xiàn)了rhG-CSF二硫鍵的定位分析。胃蛋白酶具有較多的酶切位點(diǎn)，且適用于酸性條件，能夠有效減少水解過程中產(chǎn)生的二硫鍵錯配; 采用柱后在線還原法，可省去對二硫肽的收集、濃縮和還原等步驟，能夠在二硫肽所對應(yīng)的保留時間處直接獲得還原產(chǎn)物，且避免漏掉色譜保留能力較弱的還原產(chǎn)物; 二者結(jié)合使用，樣品處理過程中產(chǎn)生的二硫鍵錯配顯著減少，同時樣品處理和數(shù)據(jù)分析的工作量降低。通過與常規(guī)二硫鍵定位方法的對比發(fā)現(xiàn)，未配對半胱氨酸、酶解體系、含半胱氨酸酶切肽段的大小和構(gòu)型等因素共同影響二硫鍵錯配的產(chǎn)生，而胃蛋白酶對rhG-CSF的酶切更傾向于產(chǎn)生含二硫鍵的環(huán)形肽段，降低被溶液中自由巰基攻擊的風(fēng)險(xiǎn)，從而更準(zhǔn)確地反映二硫鍵在蛋白分子內(nèi)的真實(shí)存在狀態(tài)。胃蛋白酶作為一種消化道蛋白酶，理論上適用范圍較廣，但仍需嘗試更多不同類型的蛋白質(zhì)加以驗(yàn)證。使用胃蛋白酶酶切結(jié)合柱后在線還原法分析蛋白質(zhì)的二硫鍵，可為研究者提供新的方法和思路。

References

1 Zhao L， Almaraz R T， Xiang F， Hedrick J L， Franz A H. J. Am. Soc. Mass Spectrom.， 2009， 20（9）： 1603-1616

2 Wypych J， Li M， Guo A， Zhang Z， Martinez T， Allen M J， Fodor S， Kelner D N， Flynn G C， Liu Y D， Bondarenko P V， Ricci M S， Dillon T M， Balland A. J. Biol. Chem.， 2008， 283（23）： 16194-16205

3 Wu J， Watson J T. Protein Sci.， 1997， 6（2）： 391-398

4 Yano H， Kuroda S， Buchanan B B. Proteomics， 2002， 2（9）： 1090-1096

5 Gorman J J， Wallis T P， Pitt J J. Mass Spectrom. Rev.，? 2002， 21（3）： 183-216

6 Pace C N， Grimsley G R， Thomson J A， Barnett B J. J. Biol. Chem.，? 1988， 263（24）： 11820-11825

7 Klúver E， Schulz-Maronde S， Scheid S， Meyer B， Forssmann W G， Adermann K. Biochemistry， 2005， 44（28）： 9804-9816

8 Resemann A， Liu-Shin L， Tremintind G， Malhotra A， Fung A， Wang F， Ratnaswamy G， Suckau D. MABS， 2018， 10（8）： 1200-1213

9 LIU Zhong-Hua， LIANG Song-Ping. Chem. J. Chinese Universities， 2003， 24（10）： 1815-1819

劉中華， 梁宋平. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)， 2003， 24（10）： 1815-1819

10 Roy D， Lakshminarayanan M. Biopolymers， 2016， 106（2）： 196-209

11 Marques J R F， Da Fonseca R R， Drury B， Melo A. J. Theor. Biol.，? 2010， 267（3）： 388-395

12 Gallegos-Perez J L， Rangel-Ordonez L， Bowman S R， Ngowe C O， Watson J T. Anal. Biochem.，? 2005， 346（2）： 311-319

13 Wefing S， Schnaible V， Hoffmann D. Anal. Chem.，? 2006， 78（4）： 1235-1241

14 Mo J， Tymiak A A， Chen G. Rapid Commun. Mass Spectrom.，? 2013， 27（9）： 940-946

15 Dangoria N S， Delay M L， Kingsbury D J， Mear J P， Uchanskaziegler B， Ziegler A， Colbert R A. J. Biol. Chem.，? 2002， 277（26）： 23459-23468

16 Niwa J， Yamada S， Ishigaki S， Sone J， Takahashi M， Katsuno M， Tanaka F， Doyu M， Sobue G. J. Biol. Chem.，? 2007， 282（38）： 28087-28095

17 Wang L， Deng H X， Grisotti G， Zhai H， Siddique T， Roos R P. Hum. Mol. Genet.， 2016， 18（9）： 1642-1651

18 Morris H R， Pucci P. Biochem. Biophys. Res. Commun.， 1985， 126（3）： 1122-1128

19 Robb R J， Kutny R M， Panico M， Morris H R. Chowdhry V. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1984， 81（20）： 6486-6490

20 Lu S， Fan S B， Yang B， Li Y X， Meng J M， Wu L， Li P， Zhang K， Zhang M J， Fu Y. Nat. Methods， 2015， 12（4）： 329-336

21 Sung W C， Chang C W， Huang S Y， Wei T Y， Huang Y L， Lin Y H， Chen H M， Chen S F. Biochim. Biophys. Acta， 2016， 1864（9）： 1188-1194

22 Liu-Shin L P， Fung A，Malhotra A， Ratnaswamy G. MABS， 2018， 10（8）： 1190-1199

23 Ishikawa M， Iijima H， Satake-Ishikawa R， Tsumura H， Iwamatsu A， Kadoya T， Shimada Y， Fukamachi H， Kobayashi K， Matsuki S， Asano K. Cell Struct. Funct.，? 1992， 17（1）： 61-65

24 Schmelzer C E， Schps R， Ulbrich-Hofmann R， Neubert R H， Raith K. J. Chromatogr. A ， 2004， 1055（1-2）： 87-92

25 Liu F， Van Breukelen B， Heck A J. Mol. Cell. Proteomics， 2014， 13（10）： 2776-2786

26 Li X， Xu W， Paporello B， Richardson D， Liu H. Anal. Biochem.，? 2013， 439（2）： 184-186

27 Liu H， Lei Q P， Washabaugh M. Anal. Chem.，? 2016， 88（10）： 5080-5087

28 Li X， Wang F， Xu W， May K， Richardson D， Liu H. Anal. Biochem.，? 2013， 436（2）： 93-100

29 Schneider A， Kuhn H G， Schbitz W R. Cell Cycle， 2005， 4（12）： 1753-1757

30 Basu S， Dunn A， Ward A. Int. J. Mol. Med.， 2002， 10（1）： 3-10