miR-208作為急性心肌梗死的標(biāo)志物研究

楊寧 蔡素麗 楊淑霞 姚慧 劉宏生

急性心肌梗死（AMI）是常見的心血管急性病。2002年到2014年我國急性心肌梗死死亡率總體上升，從2005年開始呈快速上升趨勢，帶來巨大的人員傷亡[1]。傳統(tǒng)的AMI診斷標(biāo)志物為心肌肌鈣蛋白（cardiac troponins，cTns），目前廣泛應(yīng)用于臨床中，可以縮短診斷急性心肌梗死（AMI）的時(shí)間[2]。但cTns敏感性不高，cTns在肺栓塞、腎衰竭中都被發(fā)現(xiàn)濃度上升[3-4]，所以發(fā)現(xiàn)新的AMI分子標(biāo)記物是防治AMI的重要環(huán)節(jié)。miRNA是長度為18-25個(gè)核苷酸的小RNA分子，被證實(shí)在發(fā)育、腫瘤和心血管疾病等發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。miR-208是一種心肌組織特異表達(dá)的miRNA，可從死亡的心肌細(xì)胞中逃逸到血液，有相關(guān)報(bào)道m(xù)iR-208可作為AMI的診斷指標(biāo)，然而各研究存在分歧[6]。本研究針對本院53例AMI患者進(jìn)行血漿miR-208濃度變化追蹤并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床倫理委員會批準(zhǔn)，對從2015年4—12月在本科被診斷為AMI，并留院觀察的患者53例（AMI組）及健康對照38例（對照組）的血漿miR-208水平進(jìn)行定量分析。診斷為AMI基于以下標(biāo)準(zhǔn)的組合：缺血癥狀和cTnI或CK-MB水平上升；胸部疼痛持續(xù)30分鐘，心電圖顯示病理性Q波或ST-波段上升或下降。健康對照入選標(biāo)準(zhǔn)為沒有任何心電圖、心肌酶指標(biāo)、胸部CT異常，沒有肝腎病，檢測期間沒有服用任何藥物。所有患者及健康對照均簽署書面同意?；颊叩哪挲g為（62.8±10.6）歲，健康對照為（62.3±9.2）歲。AMI組中男性占比為68.2%，對照組男性占比也調(diào)整為68.2%。本研究納入對象的年齡、性別因素，兩組人群比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

AMI患者癥狀出現(xiàn)2小時(shí)內(nèi)，對患者采血，1 000 rpm離心4分鐘；用試劑盒提取總RNA；測量A260/280評價(jià)總RNA質(zhì)量。用 TaqMan?microRNA RT-PCR 試劑盒 （Applied Biosystems）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照試劑盒說明操作。引物和探針購自Applied Biosystems。使用線蟲microRNA cel-miR-39做內(nèi)參，PCR條件：95℃，10分鐘；95℃ 15秒，60℃ 60秒 40個(gè)循環(huán)。血漿miR-208的表達(dá)量以Cq數(shù)顯示，根據(jù)文獻(xiàn)[7]，采用相對Cq法（ΔCq）用于分析miR-208表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示。兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

AMI組血漿miR-208的中位值為1.24；對照組血漿miR-208的中位值為0.14。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析AMI組血漿miR-208高于對照組（P=0.013）。

采用受試者工作特征曲線分析（Receiver operating characteristic curve，簡稱ROC分析）確定miR-208對于AMI的診斷價(jià)值（圖 1），miR-208的曲線下面積（Area under curve，簡稱AUC）為0.780。在最佳的截?cái)嘀堤?，敏感性?8%，特異性為68%。

圖1 miR-208表達(dá)特異性和敏感性曲線

3 討論

AMI是冠狀動脈急性閉塞血流中斷所引起的局部心肌的缺血性壞死。在AMI早期，破損的心肌細(xì)胞已經(jīng)開始向血液釋放細(xì)胞內(nèi)容物，包括cTnT等蛋白和miRNA等小RNA分子。這些生物分子具備可成為AMI早期診斷靶分子的潛能。

傳統(tǒng)的疾病包括AMI的診斷靶分子多為蛋白質(zhì)，但蛋白質(zhì)的半壽期短、構(gòu)象穩(wěn)定性低、針對疾病特異性不高，這些局限讓臨床和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)專家致力尋求新的一類診斷分子[8]。miRNA是近年來被發(fā)現(xiàn)的一種在細(xì)胞內(nèi)起著調(diào)控關(guān)鍵生理活動的小分子，起著類似調(diào)節(jié)蛋白的作用，且某些miRNA具有組織特異性。和蛋白相比，miRNA半壽期長、構(gòu)象簡單穩(wěn)定，特別是高靈敏性的RNA定量分析方法的成熟，讓miRNA成為一種理想的診斷分子候選者。因此，目前在多種疾病領(lǐng)域包括AMI，篩選miRNA作為診斷分子是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

miR-208參與心肌細(xì)胞重要的信號通路，在嚙齒類動物模型心臟中過表達(dá)miR-208，可以導(dǎo)致心肌肥大；用Anti-miR-208降低miRNA-208表達(dá)水平則可以改善心肌功能[9-10]。多個(gè)課題組[11-12]（包括本課題組）的研究表明血漿miR-208水平的上升和心血管疾病相關(guān)。在之前的研究我們發(fā)現(xiàn)，在冠心病患者中miR-208的水平（中位值：1.57）顯著高于對照組（0.12）。表明miR-208作為早期診斷心血管疾病的具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。作為心肌特異表達(dá)的miRNA，被發(fā)現(xiàn)在AMI患者的血漿中miR-208水平急劇上升，并隨著介入治療后迅速下降[13-14]，表明miR-208水平在AMI患者中血液中隨癥狀發(fā)作而變動劇烈，可用于AMI的實(shí)時(shí)監(jiān)測。miR-208是否可作為AMI早期診斷的指標(biāo)，雖然有多個(gè)研究做了人群研究，表明miR-208具有成為AMI早期診斷的潛力，但數(shù)據(jù)仍存在一定的不一致性，miR-208在有的研究中敏感性為90%，特異性為96%，是非常理想的分子診斷標(biāo)志物[15]；在有的研究則不令人滿意，敏感性為65%，特異性為80%。在我們的研究中，miR-208在AMI的檢測中，敏感性為88%，特異性為68%。數(shù)據(jù)的不一致，可能是檢測方法以及取樣時(shí)間的不同導(dǎo)致。

綜上，miR-208是一種很有應(yīng)用前途的AMI診斷分子，這點(diǎn)已被多個(gè)研究證明。但是，miR-208能盡快走向臨床，需要更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。特別是各實(shí)驗(yàn)室對血漿中miRNA的提取、反轉(zhuǎn)錄和PCR方法以及內(nèi)參選擇的統(tǒng)一，才能得到一個(gè)具有指導(dǎo)意義的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

表1 AMI組和對照組一般資料對比