液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定食醋中生物胺含量

魏泉增，湯 雅，李偉民

（1.許昌學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 許昌 461000；2.河南省食品安全生物標(biāo)識(shí)快檢技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 許昌 461000）

食醋是我國(guó)重要的調(diào)味品，有兩千多年的悠久歷史。釀造的地理環(huán)境、原料與工藝的差異，生產(chǎn)出具有不同風(fēng)味的食醋。釀造食醋的原料有大米、小麥、高粱、小米、麩皮、含糖分的果類(lèi)等[1]。在微生物氨基酸脫羧酶作用下將氨基酸脫羧生成生物胺，通過(guò)氨基化和轉(zhuǎn)胺作用也能使醛和酮轉(zhuǎn)化為生物胺[2]。適量生物胺可促進(jìn)人體的正常生理活動(dòng)，但生物胺的濃度超過(guò)一定的限度會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生嚴(yán)重的危害[3-4]，損傷人體的神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)。因此，建立快速簡(jiǎn)便地檢測(cè)食醋中生物胺含量的方法，對(duì)保證食醋食用安全具有重要意義。

由于生物胺分子中缺少發(fā)色基團(tuán)，無(wú)紫外吸收、也無(wú)熒光及電化學(xué)活性，因此，分離及測(cè)定各類(lèi)生物胺的含量存在一定的困難。目前，檢測(cè)生物胺的方法主要為衍生化-高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）[5-7]法。也有用生物傳感器法[8]、毛細(xì)管電泳法[9]、薄層色譜法[10]等測(cè)定食品中生物胺。唐晗等[11]利用化學(xué)發(fā)光傳感器檢測(cè)食品中生物胺含量。劉方震[12]利用毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測(cè)尿樣、醬油等樣品中的生物胺，分離速度快、效能高并且消耗樣品量極少，但選擇性差。李燕君[13]改良了傳統(tǒng)的薄層色譜檢測(cè)方法并成功定性、定量檢測(cè)黃酒中生物胺的含量。黃祖新[14]采用高效液相色譜法檢測(cè)了福建紅曲醋中各生物胺含量。瞿鳳梅等[15]采用丹磺酰氯衍生化結(jié)合HPLC的方法檢測(cè)泡菜中的生物胺含量。HPLC方法是常用的檢測(cè)方法，但需要進(jìn)行柱前或柱后衍生，具有反應(yīng)條件苛刻、衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定及前處理耗時(shí)較長(zhǎng)等不足。本研究采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法測(cè)定食醋中多種生物胺的含量，為食醋企業(yè)提供可靠數(shù)據(jù)，以期控制食醋生產(chǎn)過(guò)程中生物胺的產(chǎn)生，保證食醋的安全。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食醋樣品均購(gòu)買(mǎi)于許昌市時(shí)代廣場(chǎng)，樣品1，老陳醋（山西）；樣品2，黑米醋（廣東）；樣品3，老陳醋（山西）；樣品4，老陳醋（江蘇）；樣品5，香醋（上海）；樣品6，老陳醋（山西）；樣品7，香醋（江蘇）；樣品8，香醋（江蘇）。

精胺、亞精胺、酪胺、組胺二鹽酸鹽、腐胺、尸胺、色胺：阿拉丁公司；甲酸、乙腈（均為色譜純）：美國(guó)西格瑪公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 6460型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀、Agilent 1290型液相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司；Mili-Q型超純水儀：密理博公司；ME104T/02電子天平：梅特勒-托利多集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 生物胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制

7種生物胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液制備：分別稱取色胺3.4 mg、酪胺2.6mg、組胺二鹽酸鹽3.4mg、精胺5.1mg、亞精胺4.6mg、腐胺1.8 mg、尸胺1.7 mg于10 mL的容量瓶中，定容，配成340 mg/L（色胺）、260 mg/L（酪胺）、205 mg/L（組胺）、510 mg/L（精胺）、460 mg/L（亞精胺）、180 mg/L（腐胺）、170 mg/L（尸胺）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。使用超純水將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按1∶2的稀釋度稀釋成系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品的前處理

準(zhǔn)確量取1mL各品牌的食醋樣品，超純水定容至10mL，0.45 μm濾膜過(guò)濾，直接進(jìn)樣分析。

1.3.3 色譜條件與質(zhì)譜條件

色譜條件：Agilent XDB-C3（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，柱溫30℃，進(jìn)樣量5μL，流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.1%的甲酸乙腈溶液；0～5 min時(shí)，5%～20%的B溶液；流速為0.3mL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（electrosprayionization，ESI），正離子掃描；干燥氣為氮?dú)猓∟2），干燥氣溫度為300℃，干燥氣流量為8 L/min；霧化氣壓力為30 psi，鞘氣溫度為300℃，鞘氣流量為11 L/min；毛細(xì)管電壓為4000 V（正離子模式）；錐孔電壓為500V（正離子模式）；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（multiple reaction monitoring，MRM）。

取生物胺標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行子離子優(yōu)化。母離子為M+1，毛細(xì)管出口電壓50～150 V，步長(zhǎng)為5 V，碰撞能量5～50 V，步長(zhǎng)為4 V，加速電壓為4 V。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

定性分析：在相同的色譜和質(zhì)譜條件下，對(duì)照7種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品定性離子，以及出峰時(shí)間，對(duì)樣品中各生物胺進(jìn)行定性分析。

定量分析：通過(guò)不同生物胺定量離子的峰面積，根據(jù)7種生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計(jì)算食醋樣品中各生物胺的含量。

試驗(yàn)結(jié)果采用Minitable（17.0版）計(jì)算平均值與相關(guān)性分析[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的選擇結(jié)果

生物胺是一類(lèi)具有生物活性的小分子堿類(lèi)化合物，極性較大，因此，實(shí)驗(yàn)中選用C3柱，以此實(shí)現(xiàn)7種生物胺的分離和檢測(cè)。優(yōu)化后的子離子見(jiàn)表1，加速電壓為4V。其中，豐度最大為定量離子，豐度次大為定性離子。5min內(nèi)7種生物胺全部岀峰（見(jiàn)圖1）。生物胺色譜出峰順序?yàn)閬喚?、腐胺、尸胺、組胺、精胺、酪胺、色胺，出峰時(shí)間分別為0.959min、0.996 min、1.004 min、1.012 min、1.098 min、1.892 min、4.064 min。

圖17 種生物胺dMRM色譜圖Fig.1 Chromatogram of dMRM for 7 kinds of biogenic amines

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、檢出限和定量限

按照各標(biāo)準(zhǔn)品峰面積（y）對(duì)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)。以信噪比（S/N）=3作為檢出限，信噪比（S/N）=10作為定量限，7種生物胺的最低檢出限見(jiàn)表2。各生物胺線性回歸方程在0.50～20 mg/L范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)R2均≥0.990，符合測(cè)定的要求。結(jié)果表明，該方法對(duì)生物胺靈敏度高，可以滿足樣品測(cè)定的要求。

表2 生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限Table 2 Regression equations of the standard curve,correlation coefficients,linearity range and limits of detection of biogenic amines

2.3 方法的回收率

方法的回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可看出，7種生物胺的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在0.31%～3.29%，表明具有良好的重復(fù)性，7種生物胺的回收率也均在91.1%～102.17%。可見(jiàn)該方法回收率高，可用于檢測(cè)食醋中生物胺的含量。

表3 生物胺的加標(biāo)回收率結(jié)果Table 3 Results of recovery rate of biogenic amines

2.4 8種食醋樣品中生物胺的測(cè)定

不同品牌食醋中的生物胺含量見(jiàn)表4。

表4 食醋中的生物胺含量Table 4 Contents of biogenic amines in vinegar samples mg/L

生物胺的種類(lèi)和含量因食醋的品種和制作方法的不同而有所差別，由表4可知，本研究的每一個(gè)樣品中至少含有4種生物胺，所有樣品中均未檢出色胺，表明在酸性條件不利于色胺的形成。少部分食醋樣品中未檢出組胺和酪胺。

食醋中不同生物胺的含量見(jiàn)圖2。由圖2可知，8種樣品中亞精胺的平均含量高于其他生物胺的平均含量，除色胺外，組胺的平均含量最低。精胺、亞精胺、腐胺和尸胺是食醋中主要的生物胺，所有樣品中都能檢出上述4種生物胺，組胺、酪胺和色胺的檢出率分別為75%、87.5%和0%。已知7種生物胺毒性最強(qiáng)的是組胺[17]，而食醋中組胺的含量并不高，表明食醋的低pH抑制了組胺的形成。

圖2 食醋中不同生物胺含量Fig.2 Contents of different biogenic amines in vinegar samples

不同種類(lèi)食醋樣品中生物胺含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，陳醋、米醋和香醋3類(lèi)食醋樣品中6種生物胺的含量有明顯差別。香醋中6種生物胺含量均高于陳醋和米醋，陳醋次之，米醋各生物胺含量最低。3類(lèi)食醋中總生物胺含量的變化也較大，其中陳醋中總生物胺含量為77.58 mg/L，米醋總生物胺含量為13.48 mg/L，香醋的總生物胺含量為150.87 mg/L，這可能是與3類(lèi)食醋的生產(chǎn)工藝和微生物種類(lèi)不同有關(guān)。

圖3 不同種類(lèi)食醋樣品中生物胺含量Fig.3 Contents of biogenic amines in different kinds of vinegar samples

2.5 樣品中生物胺含量的相關(guān)性分析

為尋找生物胺相互之間的關(guān)系，采用Minitable軟件對(duì)食醋中不同種類(lèi)生物胺含量之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，組胺除了與酪胺顯著相關(guān)外（P＜0.01），與其他5種生物胺之間均沒(méi)有顯著相關(guān)性（P＞0.01）；腐胺與尸胺之間具有顯著相關(guān)性（P＜0.01），與其他5種生物胺也均沒(méi)有顯著相關(guān)性（P＞0.01）。其他生物胺之間沒(méi)有顯著的相關(guān)性（P＞0.01）。原因可能是不同釀造工藝中產(chǎn)生的游離氨基酸含量不同，各底物濃度之間沒(méi)有相關(guān)性；產(chǎn)脫羧酶具有多種底物[18-19]，如一些乳桿菌（Lactobacilli）發(fā)酵可生成組胺、酪胺，這就造成了酪胺和組胺具有一定的相關(guān)性，而腸桿菌科（Enterobacteriaceae）微生物則有同時(shí)生成腐胺和尸胺的能力[20]。一些外界因素也會(huì)影響組胺的形成，此外，溫度也會(huì)影響生成生物胺各個(gè)不同的組分，如合成組氨酸脫羧酶的最適溫度為30℃，產(chǎn)生組胺的嗜溫細(xì)菌生存所需要的溫度須高于14℃，低溫冷藏不利于組胺的形成。

表5 生物胺各組分之間的相關(guān)性Table 5 Correlation between components of the biogenic amines mg/L

3 結(jié)論

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）測(cè)定8種食醋品牌中7種生物胺含量，所有樣品中均檢出精胺、亞精胺、腐胺和尸胺，酪胺和組胺存在于大多數(shù)食醋中，部分樣品中未檢出，此外，食醋樣品中均未檢出色胺。結(jié)果表明，食醋中所含生物胺的種類(lèi)及含量因食醋的品種而異，除色胺外，其他6種生物胺總量的范圍為47.88～244.58mg/L，亞精胺，腐胺和酪胺的含量較高。組胺與酪胺，腐胺與尸胺含量具有顯著的相關(guān)性。