柚子酒發(fā)酵條件優(yōu)化

李敏杰，熊 亞*

（1.攀枝花學院 生物與化學工程學院，四川 攀枝花 617000；2.攀枝花市干熱河谷特色生物資源工程技術(shù)中心，四川 攀枝花 617000）

柚子（Citrus maxima）又名文旦、香欒、朱欒、內(nèi)紫等[1]。柚子含多種糖類、有機酸、維生素和各種無機鹽，對人體十分有益[2-3]，可以在常溫條件下放置幾個月都不產(chǎn)生霉爛等變化，因此，人們稱其為“天然水果罐頭”[4]。從《本草綱目》可知，柚子對于化痰止咳、食欲不振、消化不良等均有療效，且長時間吃柚子還可以美容養(yǎng)顏；柚子果肉及皮還含有生物活性物質(zhì)生物苷[5]，可以降低血液黏稠度，減少血栓形成，對腦血管疾病如腦血栓、腦卒等也有較好的預防作用[6-8]。

柚子除了直接吃以外，還可以加工成生鮮面[9]、復合果汁[10]、果醬[11]、果脯[12]、果醋[13]和果酒[14]等，其果皮還可用來生產(chǎn)茶飲料[15]等。近年來，我國的柚子種植發(fā)展十分迅速，鮮果市場逐漸趨于飽和或過飽和狀態(tài)，對其進行深加工尋求新途徑以擴大柚果的產(chǎn)業(yè)鏈已成為亟待解決的問題[16]。

目前關(guān)于柚子釀酒、柚子酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化的報道較少，因此，本研究以柚子為原料，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以酒精度為響應(yīng)值，對柚子酒的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。為柚子酒的大規(guī)模生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

坪山柚：沃爾瑪超市；安琪高活性酵母：湖北宜昌安琪酵母股份有限公司；果膠酶（30萬U/g）：江蘇銳陽生物科技有限公司；亞硫酸、檸檬酸、硝酸鋁、氫氧化鈉、FeSO4·7H2O、水楊酸、碳酸鈉（均為分析純）、雙氧水（30%）：成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2204B型電子天平：上海越平科學儀器有限公司；Q/GHSC型精密pH計：上海森信試驗儀器有限公司；WYT-J型手持式糖度儀：成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司；D2KW-4型電熱恒溫水浴鍋：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；0-40型酒精計：國營河北省武強縣儀表廠；722型可見光分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 柚子酒工藝流程與操作要點

原料預處理：柚子洗凈，去皮、去籽，將去籽柚子果肉放入榨汁機破碎。

酶解：在用榨汁機破碎后的柚子果肉漿中加入50 mg/L SO2以防止雜菌污染，加入40 mg/L果膠酶酶解24 h。

過濾：用滅過菌的三層紗布進行過濾，以除去大顆粒的果肉或粗纖維等。

成分調(diào)整：加入白砂糖調(diào)節(jié)糖度為220 g/L，加入檸檬酸調(diào)節(jié)酸度為4.5 g/L。

發(fā)酵：接入酵母菌0.08%，在一定溫度的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵14 d。

陳釀：在15℃條件下進行陳釀。

澄清過濾：按照0.1 g/100 mL果酒的添加量稱取皂土，將皂土在60℃的水中浸泡4 h，將浸泡后的皂土加入果酒中，澄清1 h，之后用硅藻土進行過濾，即得柚子酒成品。

1.3.2 柚子酒發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

在其他條件不變的情況下，分別考察水∶柚子汁（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3（V/V））、SO2添加量（30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L、70 mg/L）、酵母菌接種量（0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%）、發(fā)酵溫度（20℃、24℃、28℃、32℃、36℃）對柚子酒酒精度的影響。

1.3.3 柚子酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Design-Expert軟件中Box-Benhnken的設(shè)計原理，進行4因素3水平的響應(yīng)面分析，以水∶柚子汁（X1）、SO2添加量（X2）、酵母菌接種量（X3）及發(fā)酵溫度（X4）為自變量，以酒精度（Y）為響應(yīng)值，確定各因素對響應(yīng)值的影響，確定發(fā)酵的最佳條件。響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 柚子酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for pomelo wine fermentation conditions optimization

1.3.4 測定方法

可溶性固形物：用手持折光儀進行測定[17]；pH值：用pH計進行測定；比重：用比重計進行測定[18]；總酸：采用酸堿滴定法[19]；酒精度：采用蒸餾法[20]，用酒精計測量其酒精含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 柚子酒發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 水與柚子汁體積比對柚子酒酒精度的影響

由圖1可知，柚子酒酒精度隨水與柚子汁體積比的變化呈先升高后降低的趨勢，在水∶柚子汁為1∶1（V/V）時，酒精度達到最高值，為13%vol?？赡苁怯捎阼肿又械哪承┪镔|(zhì)的濃度會影響酵母菌的發(fā)酵，當濃度過低時使得發(fā)酵緩慢，而濃度過高時又會抑制酵母菌的生長代謝。因此，選擇水∶柚子汁為1∶1（V/V）。

圖1 水與柚子汁體積比對柚子酒酒精度的影響Fig.1 Effect of water to pomelo juice ratio on the alcohol content of pomelo wine

2.1.2 SO2添加量對柚子酒酒精度的影響

二氧化硫有殺菌、增酸、抗氧化等作用，可以使果酒變得澄清，并且使得果酒中色素和單寧物質(zhì)更容易溶解出來，優(yōu)化果酒的口感和風味。由圖2可知，隨著SO2添加量的增加，酒精度隨之增加，當SO2添加量為60 mg/L時，酒精度達到最大值，為12.0%vol，繼續(xù)增加SO2添加量，酒精度開始降低。因此，選擇SO2添加量60 mg/L。

圖2 SO2添加量對柚子酒酒精度的影響Fig.2 Effect of SO2addition on the alcohol content of pomelo wine

2.1.3 酵母菌接種量對柚子酒酒精度的影響

由圖3可知，隨著酵母菌接種量的增加，酒精度隨之增加，當接種量為0.08%時，酒精度達到最大值，為11.8%vol，當接種量＞0.08%之后，酒精度反而開始降低?？赡苁且驗榻湍妇臃N量較低時，發(fā)酵緩慢，酒精產(chǎn)生速率較低；隨著接種量的增加，發(fā)酵加快，此時酒精度迅速上升，當繼續(xù)增加接種量，酵母菌數(shù)量增加，酒中營養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗，代謝物堆積，不利于酵母菌生長，使發(fā)酵減慢，產(chǎn)酒精的速率減慢，所以隨著酵母菌接種量的增加，反而會出現(xiàn)酒精度降低的情況。因此，選擇酵母接種量為0.08%。

圖3 酵母菌接種量對柚子酒酒精度的影響Fig.3 Effect of yeast inoculum on the alcohol content of pomelo wine

2.1.4 不同發(fā)酵溫度對柚子酒酒精度的影響

由圖4可知，酒精度隨著發(fā)酵溫度的升高而逐漸增加，當發(fā)酵溫度為28℃時，酒精度最高，為11.9%vol；當溫度超過28℃之后，酒精度隨溫度升高開始下降。溫度的高低會影響酵母菌的生理活性，溫度過低，酵母菌生長代謝緩慢，發(fā)酵緩慢，造成發(fā)酵時間的延長；溫度過高，不利于酵母菌的生長，影響發(fā)酵。因此，選擇發(fā)酵溫度為28℃。

圖4 發(fā)酵溫度對柚子酒酒精度的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the alcohol content of pomelo wine

2.2 柚子酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

表2 柚子酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of response surface methodology for pomelo wine fermentation conditions optimization

續(xù)表

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，回歸模型P＜0.000 1，表明模型方程極其顯著，說明試驗方法可靠可行；失擬項P=0.067 8＞0.05，不顯著，說明回歸方程擬合度很好，試驗誤差很小，模型選擇恰當，能較好地反映出發(fā)酵工藝中各個因素和酒精度（Y）之間的真實關(guān)系，可用回歸方程預測最佳的發(fā)酵參數(shù)；模型的回歸決定系數(shù)R2=0.980 6，說明模型擬合程度很好，響應(yīng)值的變化有98.06%來源于所選因素的變化，只有1.94%的變異不能用本模型解釋。一次項X1、X3、X4對Y有極顯著影響（P＜0.01），均為正效應(yīng)；交互項X1X2對Y有極顯著影響（P＜0.01），為正效應(yīng)；二次項X12、X22、X42對Y的影響極顯著（P＜0.01），均為負效應(yīng)；X32對Y影響顯著（P＜0.05）；其余變量的影響均不顯著（P＞0.05）。

經(jīng)回歸擬合后，得到回歸方程：

分別對二次回歸方程的X1、X2、X3、X4求導，得到柚子酒最優(yōu)發(fā)酵條件：水與柚子汁混合比例為1∶1.3386，SO2添加量為60.87mg/L，酵母菌接種量為0.093%，發(fā)酵溫度為28.36℃。在此優(yōu)化條件下，柚子酒酒精度理論值為13.45%vol。

2.2.2 柚子酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化的響應(yīng)面圖

由圖形的陡峭趨勢比較可得出各因素參數(shù)對響應(yīng)值影響的大小以及最優(yōu)參數(shù)，圖形曲面越陡峭，則說明其對響應(yīng)值的影響越大。由圖5可知，當水與柚子汁體積比為1∶1、SO2添加量為60 mg/L時，酒精度最高，且水與柚汁混合比對響應(yīng)值的影響大于SO2添加量；當水與柚子汁體積比為1∶1、酵母菌接種量為0.08%時，酒精度最高，水與柚子汁混合比對響應(yīng)值的影響大于酵母菌接種量；當水與柚子汁體積比為1∶1、發(fā)酵溫度為28℃時，酒精度最高，可看出發(fā)酵溫度對響應(yīng)值的影響大于水與柚子汁體積比；當SO2添加量為60 mg/L、酵母菌接種量為0.08%時，酒精度最高，且SO2添加量對響應(yīng)值的影響大于酵母菌接種量；當SO2添加量為60 mg/L、發(fā)酵溫度為28℃時，酒精度最高，且發(fā)酵溫度對響應(yīng)值的影響大于SO2添加量；酵母菌接種量為0.08%、發(fā)酵溫度為28℃時，酒精度最高，且發(fā)酵溫度對響應(yīng)值的影響大于酵母菌接種量。

圖5 水與柚子汁體積比、SO2添加量、酵母菌接種量、發(fā)酵溫度交互作用對柚子酒酒精度影響的響應(yīng)曲面與等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interactions between water to pomelo juice ratio,SO2addition,yeast inoculum and fermentation temperature on the alcohol content of pomelo wine

2.2.3 驗證試驗

為方便實際操作，修改發(fā)酵條件為水與柚子汁混合比例為1.0∶1.3，SO2添加量60.9 mg/L，酵母菌接種量為0.09%，發(fā)酵溫度為28℃。在上述最佳工藝條件下重復柚子酒發(fā)酵3次，測得的平均酒精度為13.4%vol，與二階模型預測值13.45%vol基本一致，相對誤差很小，可見模型可以較好地預測出實際柚子酒發(fā)酵完成后酒精度的情況，基于響應(yīng)面分析法優(yōu)化柚子酒發(fā)酵工藝條件參數(shù)是可靠的。

3 結(jié)論

本試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以酒精度為響應(yīng)值，進行4因素3水平響應(yīng)面試驗，確定發(fā)酵的最佳條件為水與柚子汁體積比為1.0∶1.3，SO2添加量60.9 mg/L，酵母菌接種量為0.09%，發(fā)酵溫度為28℃，在此優(yōu)化條件下，柚子酒發(fā)酵酒精度為13.4%vol。