Akt抑制劑MK2206對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖凋亡的影響

顏丹萍，馬頻

(湖北省丹江口市第一醫(yī)院藥學(xué)部，丹江口 442700)

絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(protein kinase B，PKB)，又名Akt蛋白[1]，是PI3K/Akt信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)因子，能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖、活化和代謝等諸多生理活動(dòng)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，Akt在諸多腫瘤細(xì)胞中均有過(guò)表達(dá)的情況，且Akt的異常表達(dá)與癌細(xì)胞的異常增生、活化有密切關(guān)系[3]。MK2206作為Akt小分子變構(gòu)抑制劑，能夠抑制不同亞型的Akt因子，抑制肺癌細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞的增殖活化[4]。筆者在MK2206對(duì)其他惡性癌癥研究的基礎(chǔ)上，初步探討其對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞增殖、凋亡的影響，為臨床上治療膀胱癌提供參考。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株 膀胱癌細(xì)胞(T24)由武漢大學(xué)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.2試劑與試藥 MK2206(美國(guó)Selleck生物科技有限公司，貨號(hào)：S1078)；MEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco 公司，貨號(hào)：SH30022.01B)；胎牛血清(四季青公司，貨號(hào)：P30-3302)；胰蛋白酶-EDTA消化液(美國(guó)Gibco公司)；二甲亞砜(DMSO，美國(guó)Signal公司)；聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)配制試劑盒、GAPDH一抗等均購(gòu)自武漢谷歌生物科技有限公司，Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin(均按照1：1000稀釋)兔抗人一抗、羊抗兔二抗均購(gòu)自美國(guó)Cell signaling technology 公司；流式細(xì)胞術(shù)凋亡試劑盒(PE-7AAD，美國(guó)BD公司)；CCK-8 試劑盒(日本同仁研究所)。

1.3儀器 超凈工作臺(tái)(蘇州集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司)；CB150二氧化碳(CO2)細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國(guó)Binder公司)；Victor 31420 Multilable Counter酶標(biāo)儀(美國(guó)Perkin Elme 公司)；Heraeus Fresco 21低溫微量離心機(jī)(德國(guó)Themo 公司)；FACS AriaⅢ流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；Odyssey 雙色紅外激光成像系統(tǒng)(美國(guó) LI-COR 公司)。

1.4細(xì)胞培養(yǎng) 在溫度37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，于含10%胎牛血清，1%雙抗(100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1鏈霉素)的MEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)T24細(xì)胞。待細(xì)胞長(zhǎng)至90%時(shí)，胰酶消化，重懸細(xì)胞。按每2.5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，待生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，棄去舊培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，給予含不同濃度MK2206的1%血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后提取總蛋白。

1.5CCK-8法檢測(cè)不同濃度MK2206對(duì)T24細(xì)胞增殖的影響 收集T24細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，按照每孔1.5×104個(gè)細(xì)胞接種至96孔板中。待細(xì)胞達(dá)生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，棄去舊培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，加入含不同濃度的MK2206的1%血清培養(yǎng)液(終濃度分別為0，1，5，10，20 μmol·L-1)[5]，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24，48，72 h后，每孔加10 μL CCK-8，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30～60 min，酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定各孔吸光度(A)值。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.6Western blotting法測(cè)定MK2206對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的影響 MK2206作用24 h后將各組培養(yǎng)皿置于冰上，加入PIPA裂解液收集細(xì)胞，于4 ℃下12 000×g離心25 min，取上清液，BCA法測(cè)蛋白濃度，其余的加入loading buffer在100 ℃變性5～10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

按SDS- PAGE凝膠配制試劑盒配制10%分離膠和5%濃縮膠，取每組蛋白50 μg上樣，電泳1.5 h，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上電轉(zhuǎn)1.5 h。5%BSA封閉2 h，TBST洗滌，兔抗人一抗(Akt、p-Akt、GSK-3β、β-catenin、GAPDH)稀釋液中4 ℃孵育過(guò)夜。洗滌，PVDF膜至羊抗兔二抗中，室溫?fù)u床上孵育1.5 h，洗滌，利用Odyssey成像系統(tǒng)掃膜分析，檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)目的蛋白與內(nèi)參條帶的灰度值，計(jì)算二者比值。

2 結(jié)果

2.1CCK-8法檢測(cè)不同濃度MK2206對(duì)T24存活率的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MK2206能夠顯著抑制T24細(xì)胞的增殖活力，且呈濃度-時(shí)間依賴性，見圖1。該抑制劑處理時(shí)間在24，48，72 h時(shí)的半數(shù)抑制濃度(IC50)值分別為14.11，3.21，0.76 μmol·L-1。且相同處理時(shí)間下，在0～20 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，隨著MK2206濃度的增加，抑制效果明顯增加(P<0.05)，而當(dāng)達(dá)到最大濃度20 μmol·L-1時(shí)，處理時(shí)間不是抑制T24細(xì)胞增殖的主要因素。

與對(duì)照組(未給藥組)比較，*1P<0.05，*2P<0.01

圖1 MK2206對(duì)T24細(xì)胞的增殖影響

Compared with control group (without drug treatment)，*1P<0.05，*2P<0.01

Fig.1EffectofMK2206ontheproliferationofT24cells

2.2MK2206對(duì)T24細(xì)胞凋亡的影響 不同濃度(0，1，5，10 μmol·L-1)MK2206作用T24細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果見圖2，可見不同濃度的MK2206的細(xì)胞總凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)與對(duì)照組(未給藥組)的(3.94±1.00)%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。由圖2可知，隨著給藥濃度的增加，晚期凋亡細(xì)胞顯著增加(P<0.01)，其晚期凋亡率分別為(1.89±0.46)%，(4.77±0.84)%，(5.33±0.93)%和(30.97±1.32)%。

2.3MK2206對(duì)Akt因子的抑制作用 Western blotting法結(jié)果顯示，采用0～10 μmol·L-1的MK2206處理T24細(xì)胞24 h后，Akt因子所在的信號(hào)通路被抑制，Akt總蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異，而給藥組的p-Akt(ser347)蛋白的表達(dá)與對(duì)照組比較，顯著降低(P<0.01)，見圖3。

2.4MK2206對(duì)T24細(xì)胞GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路的影響 Western blotting法檢測(cè)不同濃度MK2206作用T24細(xì)胞24 h后，GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況。結(jié)果見圖4。與對(duì)照組比較，GSK-3β總蛋白的表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)，而p-GSK-3β的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。當(dāng)MK2206濃度為1 μmol·L-1時(shí)，β-catenin的表達(dá)量(0.53±0.04)，與對(duì)照組(0.56±0.06)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而當(dāng)濃度為5～10 μmol·L-1時(shí)，其表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)果見圖4。

3 討論

膀胱癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，多數(shù)為尿路上皮癌[6]。近年來(lái)對(duì)膀胱癌發(fā)病機(jī)制的研究不斷增多和深入。PI3K/Akt信號(hào)通路是目前研究較多的一條重要的細(xì)胞凋亡通路，該通路對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等進(jìn)程具有重要的調(diào)控作用[7]。Akt因子是一種具有高度靈活的胞質(zhì)蛋白[8]，在生長(zhǎng)因子的刺激下，PI3K能夠使PIP2發(fā)生磷酸化并轉(zhuǎn)化為PIP3，而PIP3可以與Akt發(fā)生結(jié)合，進(jìn)而募集Akt由胞質(zhì)向胞膜轉(zhuǎn)移，從而使Thr308和Ser347位蛋白發(fā)生磷酸化，形成活化的Akt因子[9-10]，而活化的Akt因子又進(jìn)一步促進(jìn)糖原合成黑蛋白-GSK-3β發(fā)生磷酸化[11]，形成活化的GSK-3β并與之前結(jié)合的β-catenin發(fā)生解離，β-catenin呈游離狀態(tài)在胞質(zhì)內(nèi)不斷聚集凝結(jié)增多，部分由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移入核從而調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程，誘導(dǎo)一些炎癥反應(yīng)的發(fā)生[12]。

MK2206是Akt因子的一種口服變構(gòu)蛋白激酶抑制劑，其可以抑制Akt因子的3種亞型，即Akt1、Akt2和Akt3[13]。臨床研究發(fā)現(xiàn)在晚期實(shí)體腫瘤患者采用MK2206單一藥物治療過(guò)程中，患者具有較好的藥物耐受性[14]，細(xì)胞藥理實(shí)驗(yàn)表明，MK2206對(duì)肺癌NCI-H460細(xì)胞和卵巢癌A2780系細(xì)胞具有不同程度的抑制增殖、促進(jìn)凋亡的作用[15]。MATSUZAKI等[16]研究發(fā)現(xiàn)MK2206聯(lián)合氯奎寧對(duì)子宮內(nèi)膜移位細(xì)胞的增殖和再生有抑制作用，且抑制效果優(yōu)于單獨(dú)用藥。MK2206可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，從而引起細(xì)胞凋亡[17]。WU等[18]研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力受PI3K/Akt信號(hào)調(diào)控的GSK-3β/β-catenin的活性的影響。本實(shí)驗(yàn)研究表明，MK2206在濃度為1 μmol·L-1以上時(shí)，可有效抑制T24細(xì)胞Akt(Ser473)磷酸化，這為探索MK2206對(duì)T24細(xì)胞的Akt下游通路GSK-3β/β-catenin的影響奠定了基礎(chǔ)。

A.對(duì)照組(未給藥組)細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率；B.當(dāng)MK2206給藥濃度為1 μmol·L-1時(shí)，24 h時(shí)的早期凋亡率和晚期凋亡率；C.當(dāng)給藥濃度為5 μmol·L-1時(shí)，T24細(xì)胞24 h后的早期凋亡率和晚期凋亡率；D.當(dāng)給藥濃度為10 μmol·L-1時(shí)，24 h后T24細(xì)胞的早期凋亡率(右上)和晚期凋亡率(右下)。

圖2 MK2206對(duì)T24細(xì)胞凋亡影響

A.early apoptosis and late apoptosis for control group (without drug treatment);B.early apoptosis and late apoptosis of T24 cells treated by 1 μmol·L-1MK2206 for 24 h;C.early apoptosis and late apoptosis of T24 cells treated by 5 μmol·L-1MK2206 for 24 h;D.early apoptosis and late apoptosis of T24 cells treated by 10 μmol·L-1MK2206 for 24 h.Up right is early apoptosis and low right is late apoptosis

Fig.2EffectofMK2206ontheapoptosisofT24cells

A.Western blotting法檢測(cè)不同濃度MK2206對(duì)Akt/p-Akt蛋白表達(dá)影響條帶圖，GAPDH為內(nèi)參蛋白；B.Akt/p-Akt蛋白表達(dá)水平的數(shù)據(jù)柱形圖。與對(duì)照組(未給藥組)比較，*1P<0.01

圖3 MK2206對(duì)T24細(xì)胞Akt/p-Akt蛋白表達(dá)影響

A.Effect of MK2206 at different concentration on Akt/p-Akt protein expression detected by Western blotting using GAPDH as internal reference；B.The data bar chart for the expression level of Akt/ p-Akt protein.Compared with control group (without drug treatment),*1P<0.01

Fig.3EffectofMK2206ontheproteinexpressionofAkt/p-AktinT24cells

本研究采用Western blotting法檢測(cè)了不同濃度MK2206 對(duì)T24細(xì)胞因子Akt下游通路蛋白GSK-3β/β-catenin的表達(dá)水平是否產(chǎn)生影響，結(jié)果表明MK2206通過(guò)抑制Akt因子磷酸化，進(jìn)而降低GSK-3β的磷酸化和β-catenin蛋白表達(dá)水平，抑制了膀胱癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡。本研究為膀胱癌的藥物治療提供了一定的藥理研究基礎(chǔ)。

A.Western blotting法檢測(cè)不同濃度MK2206對(duì)GSK-3β/β-catenin蛋白表達(dá)影響條帶圖，GAPDH為內(nèi)參蛋白；B.GSK-3β/β-catenin蛋白表達(dá)水平的數(shù)據(jù)柱形圖。與對(duì)照組(未給藥組)比較，*1P<0.05，*2P<0.01

圖4 MK2206對(duì)T24細(xì)胞GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路的影響

A.Effect of MK2206 at different concentration on GSK-3β/β-catenin protein expression detected by Western blotting GAPDH as internal reference；B.The data bar chart for the expression level of GSK-3β/β-catenin protein expression detected protein.Compared with control group (without drug treatment),*1P<0.05，*2P<0.01

Fig.4EffectofMK2206onGSK-3β/β-cateninsignalpathwayinT24cells