湖北省眼用制劑中抑菌劑的使用及控制*

鄒謹(jǐn)霜，王茜，姜紅，周茜，孫春艷

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430065；2.湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，武漢 430075)

眼用制劑是指直接用于眼部發(fā)揮治療作用的無菌制劑。微生物的污染是眼用制劑生產(chǎn)、貯藏、運(yùn)輸及使用過程中存在的主要問題。《中華人民共和國藥典》2015年版四部眼用制劑項(xiàng)下規(guī)定“多劑量眼用制劑一般應(yīng)加適當(dāng)抑菌劑，盡量選用安全風(fēng)險小的抑菌劑”。抑菌劑是通過干擾微生物有機(jī)體的生長、繁殖和新陳代謝發(fā)揮抑菌作用，在發(fā)揮抑菌效力的同時也會對眼組織細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用，給使用者造成安全風(fēng)險。因此，抑菌劑的合理應(yīng)用和控制是眼用制劑質(zhì)量提升的重要環(huán)節(jié)。筆者在對湖北省內(nèi)眼用制劑生產(chǎn)企業(yè)處方和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)研分析的基礎(chǔ)上，選取不同企業(yè)具有代表性的品種22批，考察樣品中抑菌劑的含量，分析我省眼用制劑中抑菌劑的使用和質(zhì)量控制存在的問題，探討提高抑菌劑安全性和有效性的方法，促進(jìn)眼用制劑質(zhì)量的提升。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters e2695高效液相色譜儀(沃特世科技上海有限公司)，島津GC-2010 PLUS氣相色譜儀(島津公司)，瑞士Mettler XP205電子天平(感量0.01 mg)，瑞士梅特勒Sevencompact pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，Milli-Q Reference超純水儀(默克公司)。

1.2試藥 苯扎溴銨溶液對照品(批號：135051-201401，含量10.90 mg·mL-1)、苯扎氯銨溶液對照品(批號：100549-201102，含量11.10 mg·mL-1)、羥苯甲酯對照品(批號：100278-201103，含量99.6%)、羥苯乙酯對照品(批號：100847-200501，含量100%)、羥苯丙酯對照品(批號：100444-201102，含量99.6%)、硫柳汞鈉對照品(批號：135050-201401，含量94.6%)、三氯叔丁醇對照品(批號：100492-200301，含量100%)，以上均購自中國食品藥品檢定研究院；三乙胺、磷酸為分析純，甲醇為色譜純，超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1調(diào)研及結(jié)果 調(diào)研湖北省內(nèi)近幾年在生產(chǎn)的眼用制劑的處方和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，重點(diǎn)了解處方中抑菌劑的使用種類和使用量，以及現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)對抑菌劑的控制情況。共收集80個處方及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，涉及50個品種。所使用的抑菌劑包括：①羥苯酯類，如羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯等；②季銨鹽類，如苯扎溴銨、苯扎氯銨等；③有機(jī)汞類，如硫柳汞；④三氯叔丁醇和其他醇類，如苯氧乙醇。還有一個使用山梨酸作為抑菌劑。另有2個不含抑菌劑的多劑量眼用制劑，為A企業(yè)的雙氯芬酸鈉滴眼液(5 mL：5 mg)和F企業(yè)的眼膏劑，單劑量使用的滴眼液均不含抑菌劑。

在上述4類抑菌劑中，使用羥苯酯類抑菌劑的最多，占42.6%；其次為硫柳汞類，占29.5%；季銨鹽類抑菌劑占13.1%，三氯叔丁醇和其他醇類占14.8%。從抑菌劑的使用量來看，羥苯酯類抑菌劑為0.15～0.5 mg·mL-1、硫柳汞為0.02～0.2 mg·mL-1、苯扎溴銨為0.2%～0.75%、苯扎氯銨為0.1 mg·mL-1、三氯叔丁醇為3～4 mg·mL-1、苯氧乙醇為0.3%。

50個品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，僅有20%對抑菌劑進(jìn)行控制，且有些處方使用的抑菌劑與藥典所控制的抑菌劑不相同。如在《中華人民共和國藥典》2015年版中，雙氯芬酸鈉滴眼液控制苯扎氯銨，鹽酸環(huán)丙沙星滴眼液控制苯扎溴銨和羥苯乙酯，而我省產(chǎn)品中均使用的硫柳汞；諾氟沙星滴眼液控制羥苯甲酯和丙酯，而我省產(chǎn)品中為三氯叔丁醇；氧氟沙星滴眼液控制苯扎溴銨，我省產(chǎn)品中的抑菌劑為羥苯甲酯和羥苯丙酯，這些品種的注冊標(biāo)準(zhǔn)中也未對抑菌劑進(jìn)行控制。

從調(diào)研結(jié)果來看，絕大多數(shù)品種標(biāo)準(zhǔn)中對抑菌劑缺乏有效地控制。為進(jìn)一步了解我省眼用制劑中抑菌劑實(shí)際使用情況，選取了省內(nèi)眼用制劑生產(chǎn)量較大的5家企業(yè)的16個品種22批產(chǎn)品，分別對其中可能存在的抑菌劑進(jìn)行考察分析。

2.2抑菌劑考察 分別采用反相高效液相色譜檢測季銨鹽類、羥苯酯類、硫柳汞抑菌劑，采用氣相色譜法檢測三氯叔丁醇及其他醇酚類抑菌劑，可檢出三大類8種抑菌劑，具體方法如下。

2.2.1色譜條件 ①季銨鹽類和羥苯酯類抑菌劑。色譜柱：Zorbax XDB C18(250 mm ×4.6 mm，5.0 μm)；流動相：以1%三乙胺溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至5.0)為流動相A，以甲醇為流動相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：214 nm。待測抑菌劑與相鄰色譜峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定。

表1 季銨鹽類和羥苯酯類抑菌劑梯度洗脫

Tab.1Gradientelutionprogramofquaternaryammoniumsaltsandhydroxyphenylesterbacteriostatic%

時間/min 流動相A 流動相B0505025050171090241090255050335050

②硫柳汞抑菌劑。色譜柱：Zorbax XDB C18(250 mm ×4.6 mm，5.0 μm)；流動相：以1%三乙胺溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0)為流動相A，甲醇為流動相B，按表2進(jìn)行梯度洗脫；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：222 nm；柱溫：40 ℃。硫柳汞峰與相鄰色譜峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定。

表2 硫柳汞抑菌劑梯度洗脫

Tab.2Gradientelutionprogramofthimerosalbacteriostaticagent%

時間/min 流動相A 流動相B050502505017109020109020.15050275050

③三氯叔丁醇及其他醇酚類抑菌劑。色譜柱：Agilent HP-20M(25 m×0.320 mm，0.30 μm)；檢測器：氫火焰離子化檢測器;氮?dú)饬魉伲?.5 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度：200 ℃；檢測器溫度：250 ℃；程序升溫：起始溫度為60 ℃，保持10 min，以每分鐘 20 ℃的速度升溫至150 ℃，保持3 min，繼續(xù)以50 ℃·min-1的速度升溫至230 ℃，保持2 min。待測抑菌劑與相鄰色譜峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定。

2.2.2供試品溶液及對照品溶液的制備 ①季銨鹽類和羥苯酯類抑菌劑。供試品溶液的制備：精密量取供試品5 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。眼用凝膠劑為精密稱取供試品5 g至10 mL量瓶中，加水2 mL充分振搖使均勻分散，用甲醇定容，充分振搖后過濾即得。

混合對照品溶液的制備：精密稱取苯扎氯銨對照品約11 mg，用50%甲醇溶解并稀釋成0.055 mg·mL-1的溶液作為苯扎氯銨對照品溶液儲備液。精密稱取羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯對照品約10，16，10，10 mg，分別用50%甲醇溶解并稀釋成約含羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯1，1.6，0.5，0.5 mg·mL-1的溶液，作為對照品溶液儲備液。精密量取各對照品溶液儲備液1 mL于同一個10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成與供試品溶液中抑菌劑濃度相當(dāng)?shù)娜芤海鳛榛旌蠈φ掌啡芤骸?/p>

精密稱取苯扎溴銨對照品約10 mg，用50%甲醇溶液溶解并稀釋成0.005 mg·mL-1的溶液，作為苯扎溴銨對照品溶液。

精密量取混合對照品溶液、苯扎溴銨對照品溶液和供試品溶液20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

②硫柳汞抑菌劑(避光操作)。將已有的供試品作為供試品溶液。對照品溶液的制備：精密稱取硫柳汞鈉對照品12.47 mg，加水溶解并稀釋制成約含硫柳汞0.24，0.024，0.12，0.012 mg·mL-1的溶液。避光儲存，10 h內(nèi)使用。

精密量取上述對照品溶液與供試品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

③三氯叔丁醇及其他醇酚類抑菌劑 供試品溶液的制備：精密量取供試品溶液5 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。對照品溶液的制備：精密稱取三氯叔丁醇對照品8.52 mg置于20 mL量瓶中，加90%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成與供試品溶液中抑菌劑濃度相當(dāng)?shù)膶φ掌啡芤骸?/p>

精密量取對照品溶液和供試品溶液各1 μL，分別注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

2.3結(jié)果 按“2.1和2.2”項(xiàng)方法，對5個生產(chǎn)企業(yè)22批眼用制劑中3個種類共25個抑菌劑進(jìn)行含量測定，典型色譜圖見圖1～3，測定結(jié)果(以標(biāo)示量計(jì))見表3。結(jié)果顯示，抑菌劑的含量為標(biāo)示量33.0%～117.0%，在80%～120%范圍內(nèi)的有13批，低于80%的有9批，占40.9%。抑菌劑含量低于標(biāo)示量80%的樣品中，有2批為羥苯甲酯、2批羥苯丙酯、2批為硫柳汞、3批為苯扎溴銨。在考察的眼用制劑中僅企業(yè)B的鹽酸羥芐唑滴眼液使用三氯叔丁醇為抑菌劑，其他根據(jù)抑菌劑品種分類，比較處方量及實(shí)測量，結(jié)果見圖4，5。

A.混合對照品色譜圖；B.苯扎溴銨對照品色譜圖；1.羥苯甲酯；2.羥苯乙酯；3.羥苯丙酯；4.羥苯丁酯；5，6.苯扎氯銨；7.苯扎溴銨

圖1 季銨鹽類和羥苯酯類抑菌劑典型色譜圖

A.chromatogram of mixed control；B.chromatogram of benzalkonium bromide reference;1.hydroxybenzyl ester；2.hydroxyphenyl ethyl ester；3.hydroxyphenylpropyl ester ;4.hydroxyphenyl butyl ketone；5, 6.benzalkonium chloride;7.benzalkonium bromide

Fig.1Typicalchromatogramofquaternaryammoniumsaltsandhydroxyphenylesterbacteriostaticagents

1.硫柳汞

Fig.2Typicalchromatogramofthimerosalbacteriostat

1.甲醇；2.三氯叔丁醇

Fig.3Typicalchromatogramofchlorobutanolbacteriostaticagent

3 討論

3.1標(biāo)準(zhǔn)控制問題 2015年版《中華人民共和國藥典》對于眼用制劑中抑菌劑在通則項(xiàng)下有要求，很多品種在各論項(xiàng)下沒有控制，有些各論有控制的品種與我省產(chǎn)品中的防腐劑不一致。我院曾對125批省內(nèi)眼用制劑進(jìn)行了考察，按照法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)抑菌劑不符合規(guī)定的情況。但按照通則檢測分析，有40.9%低于處方量的80%。此現(xiàn)象應(yīng)引起標(biāo)準(zhǔn)制定者和產(chǎn)品生產(chǎn)者的關(guān)注，建議從標(biāo)準(zhǔn)制定和執(zhí)行上逐步解決。

3.2工藝控制問題 22批樣品中，未發(fā)現(xiàn)含量高于處方量120%的產(chǎn)品，含量偏低的較多，有的含量甚至低至33.3%，這可能與企業(yè)的投料隨意、生產(chǎn)工藝不合理、包裝材料選擇不合理有關(guān)。自《中華人民共和國藥典》2010年版開始，要求眼用制劑按無菌制劑管理，企業(yè)更關(guān)注制劑生產(chǎn)中無菌的要求，可能忽略了有的抑菌劑如硫柳汞在高溫下易降解的特點(diǎn)。由于缺乏深入的包材相容性的研究，可能存在包裝材料對抑菌劑有吸附的現(xiàn)象。張莉等[1]對65批鹽酸左氧氟沙星滴眼液抑菌劑的包材相容性進(jìn)行考察，結(jié)果顯示不同材質(zhì)、不同來源的鹽酸左氧氟沙星滴眼液包裝材料對三氯叔丁醇存在不同的吸附作用。也有的品種在選擇包裝材料時僅注意了對主要成分的影響，忽視了有的抑菌劑如硫柳汞遇光不穩(wěn)定的特點(diǎn)。因此，建議企業(yè)除了嚴(yán)格按照處方投料外，更加關(guān)注滅菌工藝和包裝材料對產(chǎn)品質(zhì)量的影響。

3.3處方合理性問題 抑菌劑的含量會影響抑菌劑的抑菌效力[2-5]，《中華人民共和國藥典》2015年版(四部) 正式收載“1121抑菌效力檢查法”，主要“用于指導(dǎo)生產(chǎn)企業(yè)在研發(fā)階段制劑中抑菌劑濃度的確定”[6]，在所調(diào)研的55個產(chǎn)品中，有33個抗菌藥物品種，由于抗菌藥物自身具有抑菌作用，因此，建議企業(yè)加強(qiáng)對眼用制劑抑菌效力的考察，對于抗菌藥物品種的眼用制劑是否需要添加抑菌劑更需要引起重視，降低安全風(fēng)險。

表3 湖北省22批眼用制劑中抑菌劑的含量測定結(jié)果

Tab.3Contentdeterminationofbacteriostaticagentsin22batchesofophthalmicpreparationsinHubeiprovince

企業(yè)編號與品種名稱與批號抑菌劑處方量實(shí)測量(mg·mL-1)含量/%企業(yè)A 氧氟沙星滴眼液(160801)羥苯甲酯0.2300.17475.7羥苯丙酯0.1150.03833.0 氧氟沙星滴眼液(160803)羥苯甲酯0.2300.18178.7羥苯丙酯0.1150.04034.8企業(yè)B 阿昔洛韋滴眼液(161101)苯扎溴銨0.1000.07474.0 利巴韋林滴眼液(161102)苯扎溴銨0.1000.07474.0 鹽酸林可霉素滴眼液(161203)硫柳汞鈉0.2000.17386.5 阿昔洛韋滴眼液(170305)苯扎溴銨0.1000.07878.0 珍珠明目滴眼液(170530)羥苯乙酯0.5000.46993.8 氯霉素滴眼液(160907)羥苯甲酯0.2000.19296.0羥苯丙酯0.1000.09292.0 芐達(dá)賴氨酸滴眼液(161001)苯扎溴銨0.1000.08989.0 更昔洛韋滴眼液(161104)苯扎氯銨0.1200.11797.5 芐達(dá)賴氨酸滴眼液(161109)苯扎氯銨0.1200.10184.2 馬來酸噻嗎洛爾滴眼液(170402)羥苯乙酯0.3000.27290.7 鹽酸左氧氟沙星眼用凝膠(170707)羥苯甲酯0.4000.38496.0硫柳汞鈉0.0200.00945.0企業(yè)C 利巴韋林滴眼液(1609043)三氯叔丁醇4.0003.55989.0 鹽酸羥芐唑滴眼液(17050404)硫柳汞鈉0.0200.01785.0 復(fù)方硫酸鋅霉素滴眼(17060106)羥苯乙酯0.3000.304101.3 鹽酸林可霉素滴眼液(18010401)硫柳汞鈉0.0200.01785.0 阿昔洛韋滴眼液(18010403)硫柳汞鈉0.0200.01785.0 滴眼用利福平(18030304)硫柳汞鈉0.0300.02893.3企業(yè)D 依諾沙星滴眼液(20170101)硫柳汞鈉0.1500.12583.3 鹽酸洛美沙星滴眼液(20180301)硫柳汞鈉0.1500.07952.7企業(yè)E 更昔洛韋眼用凝膠(170304)苯扎溴銨0.0470.055117.0

美國食品藥品管理局(FDA)對不同抑菌劑的最大用量規(guī)定[7]：羥苯甲酯為0.05%，羥苯乙酯為0.05%，羥苯丙酯為0.01%，硫柳汞為0.004%～0.01%，苯扎氯銨為0.25%～0.2%，三氯叔丁醇為0.2%～0.55%，山梨酸為0.1%。在本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)有的抑菌劑在不同企業(yè)同一品種中的添加量相差較大，如硫柳汞在不同企業(yè)間相隔近10倍，D企業(yè)產(chǎn)品的抑菌劑添加量超出上述限值。抑菌劑的選擇是否合理、添加量是否合理均需要通過抑菌效力測試來確認(rèn)。

A.羥苯甲酯；B.羥苯乙酯；C.羥苯丙酯；D.苯扎氯銨；E.苯扎溴銨

A.hydroxybenzyl ester；B.hydroxyphenyl ethyl ester；C.hydroxyphenyl propyl ester ；D.benzalkonium chloride;E.benzalkonium bromide

Fig.4Comparisonofprescriptionandactualmeasurementofquaternaryammoniumsaltsandhydroxyphenylesterbacteriostaticagentsintheproductsfromvariousenterprises

圖5 硫柳汞抑菌劑在各企業(yè)產(chǎn)品中處方量與實(shí)測量比較

Fig.5Comparisonofprescriptionandactualmeasurementofthiomersalbacteriostaticagentintheproductsfromvariousenterprises

為減少對眼睛的刺激，一般產(chǎn)品的pH值以6～8為佳。研究顯示[8]，不同眼用制劑抑菌劑最佳pH值范圍：羥苯酯類為3～9.5(抑菌劑效力隨pH值升高而降低)、硫柳汞為7～8、山梨酸為pH值<6.5(pH值為4.5時效力最強(qiáng))、三氯叔丁醇為<5.5、苯扎氯銨為4～10(防腐效力隨pH值升高而增強(qiáng))。有1個企業(yè)的磺胺醋酰鈉滴眼液使用的抑菌劑為山梨酸，該產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的pH值范圍為8～9，其合理性仍需斟酌。因此，建議根據(jù)主藥、處方中其他成分及抑菌劑的理化性質(zhì)，加強(qiáng)對抑菌劑的種類、用量、抑菌效力及安全性的研究，合理選擇抑菌劑。

3.4說明書問題 藥品說明書是藥品安全性、有效性的重要科學(xué)依據(jù)，用以指導(dǎo)安全、合理用藥。眼用制劑在重復(fù)開啟使用的過程中，極易影響其物理、化學(xué)及微生物穩(wěn)定性，進(jìn)而影響安全性及有效性[9]。在這22批眼用制劑的說明書中，均只標(biāo)注了適宜的貯藏條件及未開封的有效期限，未對開啟后的使用期限作出說明，建議企業(yè)對開啟后的眼用制劑，在不同貯藏條件、不同時段進(jìn)行微生物研究，并在說明書中標(biāo)注開啟后的使用期限。在22批眼用制劑僅5批的說明書中標(biāo)注了所含抑菌劑的種類及用量，由于抑菌劑與眼用制劑中的成分也存在配伍禁忌，建議在眼用制劑的說明書上標(biāo)注抑菌劑的種類及含量，以便指導(dǎo)醫(yī)生與患者合理用藥，保障臨床用藥安全。