錯(cuò)配修復(fù)/微衛(wèi)星不穩(wěn)定性對晚期結(jié)直腸癌化療敏感性及預(yù)后的影響

王麗 毛海燕 童建東 汪竹

[摘要] 目的 探究錯(cuò)配修復(fù)/微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）在晚期結(jié)直腸癌化療敏感性及臨床轉(zhuǎn)歸中的意義。 方法 收集2009年12月～2016年12月在揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科的接受FOLFOX或XELOX一線方案化療的181例晚期結(jié)直腸癌患者的原發(fā)腫瘤組織，采用免疫組化方法檢測腫瘤組織MLH1、PMS2、MSH2、MSH6 4種蛋白的表達(dá)情況，并分為MSI組（18例）和微衛(wèi)星穩(wěn)定組（MSS組，163例），比較兩組在化療敏感性和預(yù)后中的差異。 結(jié)果 除了病變部位外（P < 0.05），其他臨床特征在MSI組及MSS組中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。采用Kaplan-Meier生存曲線對隨訪資料進(jìn)行分析，MSI組和MSS組的患者總體生存時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）?；熋舾行苑矫?，MSI組和MSS組的化療總有效率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），但是MSI組疾病控制率顯著高于MSS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 MSI狀態(tài)與晚期結(jié)直腸癌患者的總生存時(shí)間無關(guān)，與疾病控制率有關(guān)。因此，MSI可以作為評估晚期結(jié)直腸癌患者化療效果的重要指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 錯(cuò)配修復(fù)/微衛(wèi)星不穩(wěn)定性;結(jié)直腸癌;化療敏感性;預(yù)后

[中圖分類號] R735.3? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（b）-0108-05

結(jié)直腸癌是人類常見的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)顯著升高[1]。我國也不例外，結(jié)直腸癌的發(fā)病率增幅遠(yuǎn)超其他消化道惡性腫瘤[2]。目前，結(jié)直腸癌臨床治療主要包括手術(shù)治療、化學(xué)治療及放射治療。其中，手術(shù)治療是最主要的治療手段，但是術(shù)后仍有近一半的患者發(fā)生局部復(fù)發(fā)或者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair，MMR）基因是修復(fù)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)錯(cuò)誤過程中的關(guān)鍵基因，其缺失狀態(tài)稱為dMMR（mismatch repair defective），而無缺失狀態(tài)稱為pMMR（mismatch repair proficient）[3]。MMR缺陷可導(dǎo)致DNA復(fù)制后自我修復(fù)功能喪失，產(chǎn)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI），而沒有位點(diǎn)發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定現(xiàn)象則稱為微衛(wèi)星穩(wěn)定（microsatellite stability，MSS）。目前認(rèn)為，MMR基因主要包括MSH2、MLH1、MSH3、MSH6、PMS1和PMS2，任何一項(xiàng)錯(cuò)配修復(fù)基因表達(dá)缺失都可以導(dǎo)致MSI[4]。由于MSI在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，許多學(xué)者對其臨床意義進(jìn)行相關(guān)研究，但是仍存在較大分歧[5-6]。為此，本研究回顧性分析181例晚期結(jié)直腸癌患者M(jìn)MR/MSI狀態(tài)對患者生存和化療敏感性的影響，進(jìn)一步明確其在判斷預(yù)后及化療效果中的實(shí)際價(jià)值，為其更精準(zhǔn)地應(yīng)用于臨床提供重要理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2009年12月～2016年12月于揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科接受治療的晚期結(jié)直腸癌患者181例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均經(jīng)病理確診為結(jié)直腸癌，且隨訪資料完整;②年齡18～70歲;③影像學(xué)檢查或轉(zhuǎn)移灶活檢明確存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶;④ECOG 0～1分或PS評分>70分;⑤有RECIST實(shí)體瘤療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)中的可測量病灶;⑥至少完成2個(gè)周期FOLFOX或XELOX方案化療，并有療效評估結(jié)果。排除標(biāo)準(zhǔn)：①病理診斷不明確;②存在化療禁忌證;③預(yù)計(jì)生存期 < 3個(gè)月;④患者依從性差;⑤嚴(yán)重心肺器質(zhì)性疾病及造血系統(tǒng)疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者和/或家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 化療方案

FOLFOX方案：奧沙利鉑85 mg/m2靜脈滴注2 h，第1天;亞葉酸鈣200 mg/m2靜脈滴注2 h，第1～2天;5-氟尿嘧啶400 mg/m2靜脈推注，第1～2天，接著給予5-氟尿嘧啶600 mg/m2持續(xù)靜脈注射22 h，第1～2天?；煼桨该?周重復(fù)1次。

XELOX方案：奧沙利鉑130 mg/m2靜脈滴注2 h，第1天;卡培他濱850～1000 mg/m2口服每天2次，第1～14天?；煼桨该?周重復(fù)1次。

1.3 化療療效判斷

根據(jù)RECIST實(shí)體瘤療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)判斷完全緩解（complete remission，CR），部分緩解（partial remission，PR），穩(wěn)定（stable disease，SD），進(jìn)展（progressive disease，PD），CR+PR定義為為治療有效，CR+PR+SD定義為疾病控制?？偵鏁r(shí)間（overall survival，OS）定義為從確診為晚期結(jié)直腸癌至任何原因?qū)е碌乃劳龅臅r(shí)間。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑和實(shí)驗(yàn)儀器? 小鼠抗人MLH-1單克隆抗體（生產(chǎn)批號：18386503）、兔抗人MSH-2單克隆抗體（生產(chǎn)批號：18660703）、兔抗人MSH-6單克隆抗體（生產(chǎn)批號：18680403）、兔抗人PMS-2單克隆抗體（生產(chǎn)批號：18610203）及二步法通用試劑盒（小鼠/兔超敏聚合物法檢測系統(tǒng)）（生產(chǎn)批號：110167D12）均購自中國中杉金橋生物技術(shù)有限公司，組織包埋機(jī)及石蠟切片機(jī)購自美國賽默飛世爾科技有限公司，全自動(dòng)組織脫水機(jī)購自英國珊頓公司，染片機(jī)、漂片機(jī)及免疫組化觀察顯微鏡購自法國萊卡公司。

1.4.2免疫組織化學(xué)方法? 腫瘤組織依次經(jīng)過甲醛固定、洗滌與脫水、透明、浸蠟、包埋及切片。厚度為4～5 μm的切片經(jīng)梯度酒精脫水、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶及血清封閉。切片經(jīng)PBS水洗3次，按工作濃度滴加一抗后4°C孵育過夜。PBS水洗切片3次;按工作濃度滴加二抗，室溫孵育50 min。切片置于PBS（pH 7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌后滴加二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液，蘇木精復(fù)染3 min，梯度酒精脫水和中性樹膠封片。

結(jié)果判讀：所有閱片均由兩名具有豐富臨床經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師完成。染色結(jié)果判讀依據(jù)如下：隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行觀察，根據(jù)染色強(qiáng)度和染色面積進(jìn)行評分。染色強(qiáng)度分為：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。染色面積分為：0分為陰性，1分為陽性細(xì)胞≤10%，2分為>10%～50%，3分為>50%～75%，4分為>75%。將上述兩者相乘的結(jié)果作為最終的評定標(biāo)準(zhǔn)：0分為陰性表達(dá)，1～3分為弱陽性表達(dá)，4～7分為中度陽性表達(dá)，8～12分為強(qiáng)陽性表達(dá)。4種蛋白中任意一種表達(dá)為陰性則定義為MSI狀態(tài)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier生存模型構(gòu)建生存曲線，兩組生存曲線比較則采用時(shí)序檢驗(yàn)（Log-rank test）。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般臨床特征

本研究共納入181例晚期結(jié)直腸癌患者，其中男96例，女85例;<60歲76例，≥60歲105例;腫瘤低分化者68例，中高度分化者113例;病變部位在右半（包括升結(jié)腸、橫結(jié)腸、肝曲）者86例;左半（包括直腸、乙狀結(jié)腸、降結(jié)腸、脾曲）者95例;單發(fā)轉(zhuǎn)移者11例，多發(fā)轉(zhuǎn)移者170例。除了病變部位外，其他臨床特征在MSI組和MSS組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 兩組錯(cuò)配修復(fù)蛋白的表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示在181例晚期結(jié)直腸癌患者的原發(fā)腫瘤組織中，18例（9.9%）判定為dMMR，即MSI;163例（90.1%）判定為dMMR，即MSS。

2.3 MSI對晚期結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響

Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，MSI組和MSS組患者的總生存時(shí)間分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

2.4 患者化療效果的分析

所有晚期結(jié)直腸癌患者接受FOLFOX或XELOX方案化療。MSI組中，2例部分緩解，10例穩(wěn)定，6例進(jìn)展，化療總有效率為11.1%，疾病控制率為66.7%;MSS組中，14例部分緩解，54例穩(wěn)定，95例進(jìn)展，化療總有效率為8.6%，疾病控制率為41.7%，兩組總有效率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但MSI組疾病控制率顯著高于MSS組。此外，本研究中沒有患者出現(xiàn)完全緩解。MSI組和MSS組的化療總有效率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），但是MSI組疾病控制率顯著高于MSS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

3 討論

微衛(wèi)星又稱短串聯(lián)重復(fù)（short tandem repeat，STR）序列，是DNA基因組中小于10個(gè)核苷酸的簡單重復(fù)序列，其隨機(jī)分布于人類基因組的編碼區(qū)和非編碼區(qū)，其中位于編碼區(qū)的微衛(wèi)星容易出現(xiàn)復(fù)制滑脫[7-8]。正常生理?xiàng)l件下，DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)并糾正微衛(wèi)星序列復(fù)制產(chǎn)生的錯(cuò)誤，進(jìn)而維持整個(gè)基因組的穩(wěn)定;而當(dāng)出現(xiàn)基因突變或缺失時(shí)，DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)不能正常修復(fù)DNA復(fù)制過程中滑動(dòng)鏈與互補(bǔ)堿基出現(xiàn)的錯(cuò)配，導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)重復(fù)堿基的插入或缺失，進(jìn)而引起MSI[9]。

目前主要利用兩種方法檢測MSI：一是通過聚合酶鏈反應(yīng)檢測樣本中微衛(wèi)星位點(diǎn)序列，并與正常DNA序列進(jìn)行比對分析，進(jìn)而判別MSI狀態(tài);二是通過免疫組織化學(xué)法（immunohistochemistry，IHC）檢測樣本中錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)情況。既往結(jié)直腸癌相關(guān)研究將錯(cuò)配修復(fù)缺陷定義為錯(cuò)配修復(fù)蛋白缺失，即MSI-H，而錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)完整定義為MSI-L或MSS[10-11]。IHC檢測法相比于聚合酶鏈反應(yīng)有著易操作、成本低等優(yōu)勢，且能夠靶向識別特定蛋白缺失，因而在臨床上普遍用于檢測結(jié)直腸癌組織MSI[12]。本研究也采用了該方法檢測晚期結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中MSI狀態(tài)。

目前，MLH-1和MSH-2為早期發(fā)現(xiàn)的錯(cuò)配修復(fù)蛋白，在結(jié)直腸癌中研究較為透徹[13-17]。此外，MLH1蛋白可以與PMS2或MSH2蛋白相形成二聚體，進(jìn)而參與調(diào)控核酸內(nèi)切酶活性。類似的，MSH2蛋白可與MSH6蛋白形成復(fù)合蛋白進(jìn)而參與調(diào)控錯(cuò)配修復(fù)[18-19]。本研究中檢測晚期結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中四種代表性錯(cuò)配修復(fù)蛋白（MLH-1、MSH-2、MSH6以及PMS2）的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有18例（9.9%）患者存在MSI。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)MSI狀態(tài)與腫瘤位置顯著相關(guān)，而與其他臨床病理參數(shù)（如年齡、性別、病理類型以及腫瘤組織分化程度）無關(guān)（P > 0.05）。上述發(fā)現(xiàn)與國內(nèi)學(xué)者李政[20]研究一致，他們發(fā)現(xiàn)基因編碼差異以及蛋白表達(dá)水平不同可能與結(jié)直腸癌的發(fā)病位置存在關(guān)聯(lián)。在預(yù)后分析中，本研究發(fā)現(xiàn)MSI狀態(tài)與晚期結(jié)直腸癌患者的總體生存無顯著相關(guān)性。Des Guetz等[21]通過Meta分析也得出了MSI對晚期結(jié)直腸癌患者總生存時(shí)間及化療反應(yīng)無影響的結(jié)論。國內(nèi)學(xué)者吳雨辰等[22]在其最新研究中也驗(yàn)證了上述結(jié)論。最后，本研究在分析MSI狀態(tài)對一線化療方案（FOLFOX或XELOX）治療效果的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)其與化療總有效率無關(guān)（P > 0.05），但MSI組疾病控制率顯著高于MSS組（P < 0.05），提示MSI患者較MSS患者在接受一線化療后存在較低的腫瘤進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)。

盡管本研究初步明確了MSI對晚期結(jié)直腸癌患者預(yù)后及化療效果的影響，但仍存在一定的局限性。首先，研究結(jié)果來自于單中心臨床隊(duì)列，具有一定的選擇偏倚;其次，本研究主要關(guān)注于MLH-1、MSH-2、MSH6以及PMS2 4種蛋白，而其他錯(cuò)配修復(fù)蛋白（如MSH3和PMS1）是否在晚期結(jié)直癌患者中具有一定的臨床意義尚未清楚。再次，由于MSI患者在總體患者中所占比例較低（18例），導(dǎo)致研究樣本量較小，因而MSI在晚期結(jié)直腸癌中的臨床預(yù)后價(jià)值仍需進(jìn)一步在多中心大樣本的臨床研究中得以驗(yàn)證。最后，本研究僅限于檢測錯(cuò)配修復(fù)蛋白在臨床樣本中的表達(dá)水平，后續(xù)我們將進(jìn)行體內(nèi)體外功能研究，進(jìn)一步闡明相關(guān)分子機(jī)制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MSI與晚期結(jié)直腸癌化療敏感性密切相關(guān)，盡管這樣的結(jié)果還有待在大樣本人群中進(jìn)行驗(yàn)證。除此之外，聯(lián)合環(huán)境相關(guān)的因素，例如飲食因素與MSI在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展是否存在協(xié)同作用值得深入研究。隨著相關(guān)研究的深入，MSI有望成為臨床重要的診斷及預(yù)后指標(biāo)，幫助廣大結(jié)直腸癌患者改善預(yù)后，最終提高結(jié)直癌的總體生存率。

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（收稿日期：2018-07-16? 本文編輯：蘇? ?暢）