史小東,鄭金旭,錢海,楊磊,孫金玲
(1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,江蘇 鎮(zhèn)江212001;2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江212013)
特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種病因不明、進(jìn)展迅速、不可逆、預(yù)后極差的慢性肺疾病。生長(zhǎng)因子及其胞內(nèi)的下游信號(hào)通路等多種因素可以促進(jìn)纖維化的進(jìn)展[1]。IPF過程中肺組織損傷及其生理功能異常的特點(diǎn)是肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),形成遷移能力強(qiáng)的間充質(zhì)類細(xì)胞。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)是可誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的最經(jīng)典生長(zhǎng)因子之一[2]。發(fā)生EMT時(shí)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白等表達(dá)下調(diào),間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)等表達(dá)上調(diào)[3]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員,是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)、增殖和凋亡的信號(hào)途徑之一。近年來相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路異常與肺纖維化發(fā)生有關(guān)[4]。Nistala等[5]研究發(fā)現(xiàn),發(fā)生IPF時(shí)組織細(xì)胞內(nèi)mTOR信號(hào)通路活化,但具體機(jī)制尚不明確。
柴胡皂甙D(saikosaponins D,SSd)是從中藥柴胡中提取分離出來的有效成分,具有抗纖維化、抗炎、抗腫瘤等作用[6-7]。SSd治療肺纖維化小鼠模型可取得與激素類似的療效[8],但具體作用機(jī)制,尤其是否通過相關(guān)信號(hào)通路而阻斷EMT尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過TGF-β1刺激體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞建立EMT模型,并予SSd干預(yù),檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)mTOR、p70S6及EMT發(fā)生時(shí)α-SMA、N-鈣黏蛋白、Ⅰ型膠原蛋白、E-鈣黏蛋白的表達(dá),進(jìn)一步探討SSd經(jīng)mTOR通路對(duì)EMT過程的可能影響。
非小細(xì)胞肺腺癌A549細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。SSd(南京靈寶生物科技公司);重組TGF-β1、p-mTOR、p70S6兔來源多克隆抗體、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白(CST公司);Ⅰ型膠原蛋白、α-SMA(武漢博士德生物工程公司)。
將人肺癌細(xì)胞株A549置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中,于5%CO2、37℃條件下,每2天換1次培養(yǎng)液,0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
將20 mg SSd用780μL DMSO稀釋為終濃度2 mmol/L的濃縮液。實(shí)驗(yàn)使用時(shí)予RPMI 1640工作液稀釋至需要濃度。
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞,分為5組,用胰蛋白酶常規(guī)消化,離心收集細(xì)胞沉淀。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸制成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度至1×104/mL,接種于96孔板中,每孔加入100μL,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)12 h后,改用無血清DMEM培養(yǎng)液,饑餓細(xì)胞12 h。其中4組加入TGF-β1(10 ng/mL)4μL刺激A549細(xì)胞24 h后,再予不同終濃度SSd(0、0.5、1.0、2.0μmol/L)作用24 h。培養(yǎng)結(jié)束后分別每孔加入20μL MTT溶液,置37℃培養(yǎng)箱孵育4 h,棄去培養(yǎng)液。每孔加入100μL DMSO,振蕩20 min,使紫色結(jié)晶物甲臜液溶解充分后在酶聯(lián)免疫儀上490 nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度(D)值。在相同條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,對(duì)照組也以同樣方法進(jìn)行測(cè)定。
1.5.1 細(xì)胞處理及蛋白提取 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞,常規(guī)消化細(xì)胞接種6孔板,以10 ng/ml的TGF-β1刺激24 h,用不同濃度(0.5、1.0、2.0 μmol/L)的SSd溶液作用于細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后,棄培養(yǎng)液,用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞1~2遍,吸干PBS后加入100μL煮沸的2×SDS-上樣緩沖液裂解細(xì)胞,收集細(xì)胞,加入1.5 mL離心管中,干式恒溫器100℃煮沸蛋白5 min,再用超聲儀破碎細(xì)胞10 s,于4℃,12 000×g離心5 min,-20℃冰箱待檢。
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞,常規(guī)消化細(xì)胞接種6孔板,以10 ng/mL的TGF-β1刺激24 h,再用1 μmol/L SSd溶液作用于細(xì)胞8 h、12 h、24 h后,棄培養(yǎng)液,用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞1~2遍,吸干后按上述方法提取蛋白。
1.5.2 蛋白質(zhì)印跡 根據(jù)上述分離蛋白分子質(zhì)量的大小,配制相應(yīng)濃度的分離膠及濃縮膠。加樣后,濃縮膠以70 V恒壓積聚蛋白,再以120 V電壓在分離膠中分離蛋白。電泳結(jié)束后將PVDF膜貼于目標(biāo)蛋白對(duì)應(yīng)大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物上,轉(zhuǎn)膜條件為恒流350 mA、4℃、2 h,轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用含5%BSA的封閉緩沖液室溫封閉1 h。按說明書要求稀釋抗體并室溫孵育一抗mTOR、p70S6、α-SMA、N-鈣黏蛋白、Ⅰ型膠原蛋白、E-鈣黏蛋白抗體及內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白(1∶1 000)4 h,然后用TBST洗滌膜3次。用TBST按1∶5 000的比例稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,置搖床室溫孵育1 h,快速洗膜3次。最后在膜表面加入曝光液后于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中掃描條帶。
應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
MTT結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,TGF-β1(10 ng/mL)刺激A549細(xì)胞24 h后,細(xì)胞的增殖能力顯著上升(t=0.000 214,P<0.05)。與TGF-β1刺激組比較,TGF-β1+SSd組細(xì)胞增殖能力明顯降低,且隨著SSd劑量的增加,抑制效果逐漸增強(qiáng)(F =67.33,P<0.05)。見圖1。
圖1 不同濃度SSd對(duì)TGF-β1作用下A549細(xì)胞增殖能力的影響
蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示,不同濃度SSd溶液(0.5,1.0,2.0μmol/L)作用后,TGF-β1(10 ng/mL)刺激的A549細(xì)胞E-鈣黏蛋白明顯升高(F=53.7,P<0.05),N-鈣黏蛋白(F=90.22,P<0.05)、α-SMA(F=154.01,P<0.05)、Ⅰ型膠原蛋白(F=29.88,P<0.05)表達(dá)水平明顯下降。表明SSd可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞發(fā)生EMT,且呈濃度依賴性。見圖2。
同時(shí)TGF-β1作用后A549細(xì)胞p70S6蛋白、pmTOR表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.05),表明TGF-β1促進(jìn)A549細(xì)胞EMT發(fā)生同時(shí)磷酸化激活mTOR。經(jīng)不同濃度SSd(0.5,1.0,2.0μmol/L)作用后,TGF-β1刺激的A549細(xì)胞p70S6(F=101.44,P<0.05)、pmTOR蛋白(F=13.84,P<0.05)的表達(dá)隨SSd濃度的增加而逐漸降低。見圖2。
圖2 不同濃度SSd抑制TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)
A549細(xì)胞經(jīng)TGF-β1(10 ng/mL)刺激24 h發(fā)生EMT,選擇1μmol/L的SSd作用8,12,24 h后,p70S6(F=24.47,P<0.05)、mTOR(F=24.00,P<0.05)蛋白的表達(dá)隨時(shí)間變化逐漸降低,表明mTOR磷酸化及其下游信號(hào)通路的激活受到抑制;間質(zhì)化指標(biāo)α-SMA(F=19.72,P<0.05)、Ⅰ型膠原蛋白(F=49.53,P<0.05)表達(dá)顯著下降,表明SSd同時(shí)逆轉(zhuǎn)了EMT過程(圖3)。
圖3 SSd作用不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)
人肺腺癌A549細(xì)胞屬上皮來源細(xì)胞,具有穩(wěn)定的肺泡上皮細(xì)胞的特征,廣泛用于體外Ⅱ型肺上皮細(xì)胞藥物代謝的模型。IPF病理特點(diǎn)是Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞增生,肌纖維母細(xì)胞聚集及肺組織結(jié)構(gòu)重塑。目前認(rèn)為,IPF是起源于肺泡上皮反復(fù)發(fā)生微小損傷的異常修復(fù)。在損傷修復(fù)時(shí)肺泡上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞異常激活產(chǎn)生多種生長(zhǎng)因子和趨化因子誘導(dǎo)固有成纖維細(xì)胞增生,趨化循環(huán)纖維細(xì)胞到肺臟損傷部位,刺激EMT和成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞[9]。肌成纖維細(xì)胞增生分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM),導(dǎo)致纖維瘢痕形成、肺結(jié)構(gòu)破壞、肺功能喪失,促進(jìn)IPF的進(jìn)展。在此過程中伴有TGF-β1、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素如IL-8、IL-31、IL-32等多種細(xì)胞因子的異常增多,以及TGF-β1/Smads、Wnt/β-catenin等信號(hào)通路的異常激活[10]。關(guān)于mTOR信號(hào)通路的相關(guān)研究主要集中在腫瘤領(lǐng)域,mTOR信號(hào)通路異常也參與EMT過程[11]。有研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路能調(diào)控Snail轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[12]。另有研究表明,TGF-β1通過激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)SPC-A1細(xì)胞EMT,從而促進(jìn)Snail進(jìn)入細(xì)胞核[13]。
阻斷EMT過程是預(yù)防、治療IPF的方法之一。IPF的治療除了肺移植外,目前尚缺乏令人滿意的治療藥物。雖然抗纖維化新藥吡啡尼酮已經(jīng)上市應(yīng)用[14],但治療作用及效果還需大規(guī)模及長(zhǎng)時(shí)間的臨床觀察,且費(fèi)用昂貴。SSd有較強(qiáng)的抗炎、抑制血管生成、抗氧化、抗腫瘤、抗纖維化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用,且毒副作用小、安全性高。
本研究用TGF-β1刺激A549細(xì)胞建立EMT模型,其α-SMA表達(dá)增加、p-mTOR表達(dá)增強(qiáng),且其下游p70S6蛋白水平也升高。表明A549細(xì)胞經(jīng)TGFβ1刺激發(fā)生EMT,同時(shí)細(xì)胞內(nèi)mTOR信號(hào)通路活化。此外,不同濃度SSd處理后TGF-β1刺激的A549細(xì)胞p70S6蛋白表達(dá)水平降低,間質(zhì)細(xì)胞特征性指標(biāo)α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白、N-鈣黏蛋白也降低,上皮細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)E-鈣黏蛋白則升高,呈明顯劑量—時(shí)間依賴關(guān)系。由此可見,SSd可抑制TGFβ1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞發(fā)生EMT,其機(jī)制可能是抑制了mTOR通路的活化,使ECM表達(dá)減少。本研究結(jié)果為阻止IPF形成,阻斷EMT過程提供了新靶點(diǎn),也為SSd用于臨床肺纖維化治療提供了理論依據(jù)。