實驗動物專業(yè)技術(shù)培訓(xùn)和教學(xué)中強化遺傳質(zhì)量控制意識

李長龍,陳振文

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069)

實驗動物是一類人為控制繁殖方式并具有特殊遺傳組成的動物群體，一般分為同基因型(近交系)和異基因型(封閉群)動物。近交系動物是經(jīng)連續(xù)20代(或以上)的全同胞兄妹交配(或親代與子代交配)培育而成，近交系數(shù)大于99%，基因純合度達98.6%以上。同一品系的動物由于始于共同祖先，具有基因型和表型的一致性，因而主要的生物學(xué)特性相同，個體間近于無差異，對實驗反應(yīng)也趨于一致，因此，只需用少量的動物，即可得到非常規(guī)律的實驗結(jié)果。而封閉群動物則是以非近親交配方式進行繁殖生產(chǎn)的實驗動物種群，要求在不從其外部引入新個體的條件下，至少連續(xù)繁殖4代以上。這使得封閉群動物的遺傳組成具有一定的雜合性和穩(wěn)定性，它類似于人類群體遺傳組成的異質(zhì)性，在人類遺傳研究、藥物篩選和毒性試驗等方面有重要作用。顯而易見，在近交系動物生產(chǎn)和實驗應(yīng)用中就十分重視動物的均一性，而封閉群動物個體間則強調(diào)其多樣性。但在實際工作中，由于多種原因可以導(dǎo)致動物的遺傳基因或基因頻率的改變，使同一品種品系的動物與原始品種品系出現(xiàn)了明顯的遺傳差異，個體間的均一性大大降低。遺傳質(zhì)量問題主要發(fā)生在實驗動物生產(chǎn)過程中，不但影響實驗動物的生產(chǎn)，還對研究結(jié)果的真實性、穩(wěn)定性和重復(fù)性產(chǎn)生極大影響。因此，如何發(fā)現(xiàn)和處理實驗動物遺傳質(zhì)量問題就顯得十分重要。

本課題組前期研究中利用N-甲基亞硝基脲(MNU)誘導(dǎo)4家公司購買的C57BL/6 J小鼠建立胸腺淋巴瘤模型。盡管所用MNU的劑量和給藥方法均參照了多數(shù)國外文獻報道[1]，但4批C57BL/6 J小鼠的實驗結(jié)果卻差異極大，死亡率在3.3%～91.7%不等，胸腺淋巴瘤模型成功率0～56.6%(表1)。應(yīng)用42個微衛(wèi)星位點對上述群體動物進行遺傳檢測發(fā)現(xiàn)動物在群體間和群體內(nèi)均有微衛(wèi)星DNA位點多態(tài)現(xiàn)出現(xiàn)，表明群體存在遺傳質(zhì)量問題[2]。

實驗動物專業(yè)技術(shù)人員和醫(yī)學(xué)生是未來動物實驗的執(zhí)行者、管理者和監(jiān)督者，在培訓(xùn)和教學(xué)過程中強化遺傳質(zhì)量控制的意識非常重要。本文結(jié)合實驗動物管理和應(yīng)用動物進行科學(xué)研究的實際工作經(jīng)驗，就如何發(fā)現(xiàn)、分析和處理實驗動物遺傳質(zhì)量事件，強化相關(guān)人員的實驗動物遺傳質(zhì)量控制意識，保證實驗動物的遺傳質(zhì)量，提高動物實驗的真是性和準確性。

1 動物實驗中實驗動物遺傳質(zhì)量問題的發(fā)現(xiàn)與處理

1.1 動物實驗中常見的實驗動物遺傳質(zhì)量問題

實驗動物遺傳質(zhì)量是影響研究結(jié)果的關(guān)鍵因素之一，但是由于實驗動物遺傳質(zhì)量問題具有滯后性和隱蔽性，加之多數(shù)科研人員對此重視程度不夠或沒有意識到，使得遺傳質(zhì)量對動物實驗結(jié)果產(chǎn)生的影響往往被低估。盡管如此，實驗動物遺傳質(zhì)量問題仍常見于報道之中。學(xué)者認為，實驗動物遺傳組成不同是很多生物學(xué)和醫(yī)藥相關(guān)實驗結(jié)果差異大或無法重復(fù)的主要原因[3]?？茖W(xué)研究中由于應(yīng)用的實驗動物遺傳質(zhì)量不好而出現(xiàn)的常見問題主要表現(xiàn)為動物對同樣的實驗處理反應(yīng)不一致，實驗結(jié)果差異很大，實驗結(jié)果缺乏真實性、無法重復(fù)，甚至出現(xiàn)違背常理現(xiàn)象[4]。

1.2 動物實驗中實驗動物遺傳質(zhì)量問題的處理方法

在動物實驗中出現(xiàn)異?；?qū)嶒灲Y(jié)束后結(jié)果差異較大時，在排除其他影響因素的情況下，應(yīng)考慮是否存在實驗動物遺傳質(zhì)量問題。如果發(fā)現(xiàn)個別動物出現(xiàn)遺傳質(zhì)量問題時，可以考慮淘汰有問題的動物，重新補充新的動物進行實驗。當(dāng)出現(xiàn)有較多動物遺傳質(zhì)量問題時，須淘汰所有動物，從其他生產(chǎn)單位重新購入動物進行實驗?？紤]到樣本和時間因素，最好先從小樣本預(yù)實驗開始，之后再擴大樣本。當(dāng)懷疑實驗動物存在遺傳質(zhì)量問題時，可以活體采取少量組織(尾或血液)提取基因組DNA，用微衛(wèi)星或SNP位點進行檢測，通過分析結(jié)果判定是否存在遺傳質(zhì)量問題而采取相應(yīng)的措施。

表1 不同群體小鼠模型制作結(jié)果比較

1.3 動物實驗中遺傳質(zhì)量控制注意事項

動物實驗前應(yīng)首先了解動物生產(chǎn)供應(yīng)單位情況，選擇管理規(guī)范、注重質(zhì)量、信譽良好并且在同類實驗研究應(yīng)用較多的單位采購。也可以通過向做過同類實驗的同行進行咨詢。了解生產(chǎn)供應(yīng)單位最近一次遺傳檢測時間和結(jié)果，要求生產(chǎn)供應(yīng)單位提供遺傳質(zhì)量檢測報告。動物購入后應(yīng)檢查動物外觀，包括毛色、體型、采食量和飲水量是否一致，不合格動物不能編入實驗組。

2 實驗動物生產(chǎn)中動物遺傳質(zhì)量問題的發(fā)現(xiàn)與處理

2.1 實驗動物生產(chǎn)中常見的動物遺傳質(zhì)量問題表現(xiàn)

實驗動物遺傳質(zhì)量改變有的并不表現(xiàn)出可見的表性特征，需要進行特殊的實驗室檢查才能發(fā)現(xiàn)。但多數(shù)情況下通過細心觀察或多代繁殖后會顯現(xiàn)出可見或可感知的異常變化。一般可觀察到的與遺傳質(zhì)量有關(guān)的變化如下幾個方面，在外部表型特征方面(包括：毛色、眼睛、尾巴、乳頭數(shù)、生殖器、牙齒、耳和四肢等)、繁殖特性(包括：妊娠率、產(chǎn)子數(shù)、胎間隔、離乳率、食仔、拒絕哺乳、死胎或畸形等)、生長發(fā)育特性(包括：初生重、離乳重、體長、尾長等)以及生理生化等指標(biāo)等。對于外部特征沒有顯著變化的遺傳質(zhì)量改變，只能通過定期的遺傳質(zhì)量檢測才能發(fā)現(xiàn)。

2.2 實驗動物生產(chǎn)中遺傳質(zhì)量問題產(chǎn)生的可能原因分析

近交系動物遺傳質(zhì)量問題通常有以下原因。首先，種源問題。目前應(yīng)用的近交系實驗動物品系大多來源于國外，國內(nèi)實驗動物飼養(yǎng)機構(gòu)原則上從國家實驗動物種子中心引種后進行繁育，多數(shù)單位自行保種繁殖。如果種子動物遺傳質(zhì)量出現(xiàn)了問題而未被發(fā)覺，將會導(dǎo)致生產(chǎn)的動物遺傳質(zhì)量出現(xiàn)問題。第二，繁殖方式問題。近交系動物的核心種群必須采用全同胞近親繁殖，在生產(chǎn)群體中則可采用隨機交配的方式進行，但限于繁殖4代之后全部淘汰，不得留種。如果生產(chǎn)群隨機交配超過4個世代，動物遺傳質(zhì)量出現(xiàn)問題的概率將大大增加。第三，遺傳污染。很多近交系動物在外部形態(tài)特征上很難區(qū)分，如果飼養(yǎng)管理稍有疏忽將可能導(dǎo)致不同近交系動物雜交，進而出現(xiàn)遺傳質(zhì)量問題。此外，雜合基因顯現(xiàn)、基因突變、保種時間過長等原因也能引起近交系動物遺傳質(zhì)量問題。

封閉群動物遺傳質(zhì)量問題的原因主要有以下幾個方面。首先，封閉群動物種群規(guī)模過小導(dǎo)致近交系上升過快(每代超過1%)，群體出現(xiàn)近親繁殖而導(dǎo)致近交衰退。第二，繁殖方式不合理。由于繁殖方式不合理(非隨機交配或循環(huán)交配)導(dǎo)致近親繁殖，從而出現(xiàn)動物遺傳質(zhì)量下降。第三，引種不規(guī)范。一般小型嚙齒類動物引種有效規(guī)模不小于25對，如果引種規(guī)模過小則導(dǎo)致近交系數(shù)過快上升，易于出現(xiàn)近親繁殖現(xiàn)象。此外，外部動物種群進入、選種指標(biāo)不完善、選擇壓力過大、生產(chǎn)記錄管理混亂等也是出現(xiàn)遺傳質(zhì)量問題的重要因素。

2.3 實驗動物生產(chǎn)中動物遺傳質(zhì)量問題的處理方法

當(dāng)僅有個別動出現(xiàn)遺傳質(zhì)量問題時，對無培育和應(yīng)用價值的異常動物進行淘汰。如果出現(xiàn)遺傳質(zhì)量問題的動物具有培育和應(yīng)用價值，如有某種疾病表型，則應(yīng)找到同窩(最好有相同表型)動物或親代進行繁殖，觀察其是否具有遺傳性，固定其表型，進而建立新的模型動物種群。當(dāng)多數(shù)動物出現(xiàn)遺傳質(zhì)量問題時，則應(yīng)首先對有問題的動物進行抽樣檢測。針對近交系群體主要進行一致性檢測，明確遺傳質(zhì)量問題。對個別動物出現(xiàn)多態(tài)性差異，應(yīng)對其親代動物進行檢測，確認后淘汰這一支的所有動物。較多動物出現(xiàn)不均勻的改變時，淘汰種群，重新引種。對于封閉群動物主要進行均勻性檢測以確定群體內(nèi)是否處于平衡狀態(tài)，與原群體是否存在差異。如有較大差異，查找原因，是否有新的動物引入，是否種群過小。對問題較多的種群要進行淘汰，重新引種并封閉繁育4代以上。

2.4 實驗動物生產(chǎn)中控制動物遺傳質(zhì)量應(yīng)注意事項

遺傳質(zhì)量控制貫穿于實驗動物生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)，引種、繁育、保種和生產(chǎn)中均應(yīng)嚴格控制。首先，要從國家正規(guī)的實驗動物種子中心引種，種用動物要具有明確的品種品系背景資料、遺傳組成、遺傳檢測報告及主要生物學(xué)特性等。第二，飼養(yǎng)人員要經(jīng)過嚴格的標(biāo)準化管理和操作培訓(xùn)，考核合格后方可以上崗；飼養(yǎng)人員要善于及時發(fā)現(xiàn)問題、分析問題并解決問題。第三，生產(chǎn)過程嚴格生產(chǎn)記錄制度，保證生產(chǎn)記錄完整，包括品系名稱、繁殖代數(shù)(系譜)、繁殖方式、繁殖狀況、生長發(fā)育狀況、異常發(fā)生情況等。第四，根據(jù)不同品種品系動物的遺傳

特征定期進行遺傳檢測，其中近交系動物應(yīng)保持遺傳均質(zhì)性和基因單態(tài)性，封閉群動物應(yīng)保持遺傳異質(zhì)性和基因多態(tài)性并保證近交系數(shù)每代上升不超過1%。第四，動物生產(chǎn)單位應(yīng)建立規(guī)范的活體保種和冷凍保種體系，防止種源發(fā)生遺傳質(zhì)量事故。

3 結(jié)語

實驗動物遺傳質(zhì)量是保障實驗動物生產(chǎn)和動物實驗結(jié)果可靠性的重要因素，但在實際工作中由于動物遺傳質(zhì)量問題產(chǎn)生的效果延遲和難于發(fā)現(xiàn)等原因，使實驗動物的遺傳質(zhì)量問題長期存在。另外，實驗動物生產(chǎn)管理者和實驗動物使用者每當(dāng)談到實驗動物的質(zhì)量時，更多地重視實驗動物的微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)質(zhì)量，往往忽略遺傳質(zhì)量問題。實際上遺傳質(zhì)量與微生物質(zhì)量一樣都會對實驗動物產(chǎn)生重要影響，遺傳質(zhì)量控制某種程度上甚至比微生物質(zhì)量控制更重要。實驗動物遺傳質(zhì)量問題不但導(dǎo)致動物生產(chǎn)群體的質(zhì)量下降，而且也是動物實驗結(jié)果無法重復(fù)的重要原因[5]。實驗動物專業(yè)技術(shù)人員培訓(xùn)和實驗動物教學(xué)過程中培養(yǎng)學(xué)生實驗動物遺傳質(zhì)量控制的意識是十分必要的。在培訓(xùn)和教學(xué)過程中通過理論和實例的講解，強化對實驗動物遺傳質(zhì)量控制重要性的認識，培養(yǎng)他們善于發(fā)現(xiàn)實驗動物遺傳質(zhì)量問題，找出問題的根源，提出解決問題的辦法。