依達(dá)拉奉對缺氧缺血性腦病新生大鼠腦水腫及CD163/HO-1信號通路的影響

韓遵華，段 淼，李清香

(貴州省遵義市第一人民醫(yī)院新生兒科，貴州 遵義 563002)

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是新生兒在圍生期因缺氧而引起的缺氧缺血性腦損傷(hypoxic ischemic brain damage，HIBD)，臨床上常表現(xiàn)為意識障礙、腦水腫、高顱壓、肌張力改變等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[1]。腦水腫、出血是新生兒HIE早期重要的病理變化，也是導(dǎo)致病情進(jìn)展和惡化的重要因素[2]。清道夫受體蛋白CD163/HO-1(heme oxygenase-1)信號通路在血紅蛋白(haemoglobin，Hb)分解代謝中起著關(guān)鍵作用，還具有抗脂質(zhì)過氧化和抗炎作用[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，CD163、HO-1在腦出血所致腦損傷組織中的表達(dá)明顯升高，可促進(jìn)腦水腫吸收，減輕腦組織損害[5]。依達(dá)拉奉是一種自由基清除劑，主要用于治療腦梗塞急性期患者，它可通過清除自由基，避免脂質(zhì)過氧化，抑制腦、血管內(nèi)皮和神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷，進(jìn)而緩解腦缺血引起的腦水腫、腦梗塞[6]。但依達(dá)拉奉是否可用于治療新生兒HIE尚無具體報(bào)道。因此，本研究通過建立新生大鼠HIBD模型，探究依達(dá)拉奉對HIE新生大鼠腦水腫及CD163/HO-1信號通路的影響，以期為依達(dá)拉奉臨床應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級7日齡SD新生大鼠11窩共120只，體重12～16 g，雌雄不限，由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所動物室提供[SCXK (渝) 2012 - 0001]，飼養(yǎng)于SPF級實(shí)驗(yàn)室[SYXK (渝) 2017-0012]。飼養(yǎng)的環(huán)境溫度: (22±2)℃，相對濕度 50% ～ 60%，光照 12 h /12 h 明暗交替，每籠 5 只。實(shí)驗(yàn)過程中按實(shí)驗(yàn)動物使用的 3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

550D數(shù)碼相機(jī)(日本佳能公司),Image J軟件(National Institutes of Health，美國)；GIS-2020數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。依達(dá)拉奉注射液(規(guī)格號：國藥準(zhǔn)字H200502820，購自南京先聲東元制藥有限公司)，Rat Brain Matrix(Zivic Instruments，USA)；2,3,3-三苯基氯化四氮唑(TTC，美國Sigma-Aldrich公司)；NCBI Primer Blast設(shè)計(jì)定量引物序列(由上海生工生物工程有限公司合成)；RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑(寶生物大連公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Beckman Couhe公司)；組織蛋白提取試劑(南京凱基生物公司)；BCA法進(jìn)行蛋白定量(南京建成生物工程研究所)；硝酸纖維素膜(上?；蚬?；β-actin兔抗大鼠IgG溶液(美國Sigma公司)；二抗稀釋液(1∶1000堿磷酶標(biāo)記山羊抗兔IgG溶液，美國Sigma公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物模型建立

根據(jù)Rice等[7]方法建立HIBD模型，將7日齡SD新生大鼠麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺，頸部用75%酒精消毒，于頸部正中切口，游離左側(cè)頸總動脈并在遠(yuǎn)、近心端進(jìn)行雙結(jié)扎，縫合傷口并消毒后放回母鼠旁恢復(fù)2 h。然后將新生大鼠放入的缺氧玻璃艙內(nèi)，缺氧艙浸泡在37℃恒溫水浴中，同時(shí)向艙內(nèi)不斷通入8% O2和92% N2混合氣體，持續(xù)缺氧2 h。最后將新生大鼠放回母鼠處繼續(xù)喂養(yǎng)。假手術(shù)組新生大鼠只游離左側(cè)頸總動脈穿線但不結(jié)扎，縫合傷口后不進(jìn)行缺氧處理。

1.3.2 分組與給藥處理

將術(shù)后的90只HIBD新生大鼠隨機(jī)分為依達(dá)拉奉治療組(即依達(dá)拉奉組)和模型組各45只，另取30只新生大鼠行假手術(shù)作為假手術(shù)組。各組又分為6個(gè)亞組即6 h、12 h、24 h、2 d、3 d、5 d組。將依達(dá)拉奉注射液用生理鹽水(體積比1∶4)稀釋為0.3 mg/mL，依達(dá)拉奉組在術(shù)后立即給予腹腔注射依達(dá)拉奉2 mg/kg，間隔24 h給藥1次，連續(xù)5 d。模型組和假手術(shù)組給予腹腔注射等量生理鹽水。

1.3.3 腦組織標(biāo)本的處理

各組新生大鼠在術(shù)后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)斷頭取出腦組織，用10%多聚甲醛在室溫下固定24 h，沿左側(cè)腦組織視交叉處冠切，做成石蠟包塊，連續(xù)冠狀切片，進(jìn)行相關(guān)檢測。另取每組新生大鼠左側(cè)腦組織于液氮中凍存，待標(biāo)本集齊后進(jìn)行后續(xù)qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 2,3,5-三苯基四氮唑一水合物(TTC)染色

造模后24 h，各組隨機(jī)取4只新生大鼠斷頭取出腦組織，浸泡在4℃ 0.15 mol/L PBS中5 min，采用Rat Brain Matrix沿大腦冠狀面進(jìn)行切片，切片厚2 mm；將切片浸泡在含2%TTC的0.15 mol/L PBS中，室溫孵育30 min；用4℃ PBC沖洗兩遍后，于4℃ 10%福爾馬林緩沖液中避光固定。照相后，用Image J 1.8.0軟件測量梗死面積。紅色為正常腦組織，白色為梗死區(qū)腦組織。統(tǒng)計(jì)參數(shù)用梗死面積占同側(cè)腦半球總面積百分比來表示。

1.3.5 腦組織含水量測定

用干濕比重法[8]進(jìn)行測定，每組新生大鼠在術(shù)后時(shí)間點(diǎn)處死，斷頭開顱后迅速將腦組織取出，用電子天平稱腦組織濕重(精確到0.1 mg)。然后置于100℃恒溫烘箱中24 h左右，待質(zhì)量恒定后稱腦組織干重。按Elliot公式，腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。腦水腫程度用腦含水量來表示。

1.3.6 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

以β-actin作為內(nèi)參基因，用NCBI Primer Blast設(shè)計(jì)定量引物序列，引物序列如下：

CD163：上游引物(5′ to 3′)：AGCATGGAAG CGGTCTCTGTGATT，下游引物(5′ to 3′)：AGCTG ACTCATTCCCACGACAAGA。HO-1：上游引物(5′ to 3′)：A CCGCCTTCCTGCTCAACAT，下游引物(5′ to 3′)：GGGCGTCTCTGCAGAGGTAG。β-actin：上游引物(5′ to 3′)：TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT，下游引物(5′ to 3′)：CACGATGGAGGGGCCGGA CTCATC。

取出每組液氮凍存的腦組織，利用Trizol法提取RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并用紫外分光光度計(jì)檢測其純度及濃度。取1 μg總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑合成cDNA。合成cDNA第一鏈后，取5 μL cDNA(稀釋20倍)為模板，加入10 μL 2×SYBR Green qPCR Super Mix、0.5 μL GAPDH(或CD163、HO-1)上下游引物、4.0 μL ddH2O至20 μL，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上擴(kuò)增。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30 s；擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)95℃ 5 s，60℃ 35 s。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。采用2-ΔΔCT法分析qRT-PCR結(jié)果，ΔCT=CT目的基因- CT內(nèi)參基因，ΔΔCT=ΔCT目的基因- ΔCT內(nèi)參基因。

1.3.7 Western blot分析

取每組大鼠腦組織充分研磨，用組織蛋白提取試劑常規(guī)提取蛋白。每組取4 μL蛋白樣品，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，調(diào)節(jié)好蛋白濃度；將蛋白樣品與等體積2× SDS緩沖液混合后加熱變性；接著通過SDS-PAGE電泳分離上清液；把分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上；將膜洗滌后在5%牛血清蛋白溶液中室溫封閉1 h；洗滌后將膜置于一抗稀釋液(1∶100的CD163、HO-1、β-actin兔抗大鼠IgG溶液中，4℃孵育過夜；次晨將膜快速清洗后，轉(zhuǎn)移到二抗稀釋液中，在室溫下孵育2 h；清洗后用新配制的顯色液進(jìn)行顯色，待出現(xiàn)清晰的條帶后終止；最后使用GIS-2020數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)掃描并分析蛋白雜交條帶。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 SD新生大鼠模型行為觀察

術(shù)前所有SD新生大鼠生物學(xué)行為正常。術(shù)后模型組和依達(dá)拉奉組新生大鼠在低氧艙中10～15 min后開始出現(xiàn)煩躁不安；缺氧30 min后呼吸頻率加快，不能站穩(wěn)，翻滾，逐漸出現(xiàn)全身震顫，不能翻身，夾尾左旋；1 h后出現(xiàn)嗜睡，不愛活動，精神萎靡，少數(shù)出現(xiàn)抽搐情況，均未死亡，呈現(xiàn)先興奮后抑制行為。假手術(shù)組新生大鼠的行為無明顯異常。造模后置于正常環(huán)境，發(fā)現(xiàn)模型組新生大鼠癥狀逐漸加重，2～3 d時(shí)最為嚴(yán)重，6～7 d時(shí)癥狀減輕；依達(dá)拉奉治療后癥狀也加重，2 d時(shí)最為嚴(yán)重，但較模型組明顯減輕，3 d內(nèi)癥狀改善。

2.2 SD新生大鼠腦組織形態(tài)觀察

TTC染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，造模后24 h模型組新生大鼠大腦左半球皮層、海馬、紋狀體等區(qū)域出現(xiàn)水腫、顏色蒼白，左半球體積比右半球稍大，而依達(dá)拉奉治療后腦組織損傷程度顯著降低。結(jié)果見圖1A。經(jīng)定量分析發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組和依達(dá)拉奉組新生大鼠大腦左半球梗死面積均顯著增加(P<0.05)。與模型組相比，依達(dá)拉奉治療后腦梗死面積顯著減小(P<0.05)。結(jié)果見圖1B。

2.3 SD新生大鼠腦組織含水量變化

術(shù)后6 h，與假手術(shù)組相比，模型組、依達(dá)拉奉組新生大鼠腦組織含水量均明顯升高(P<0.05)，2 d時(shí)腦含水量最高。依達(dá)拉奉治療后新生大鼠腦組織含水量明顯低于模型組(P<0.05)。結(jié)果見表1。

2.4 SD新生大鼠腦組織CD163、HO-1 mRNA表達(dá)水平

qRT-PCR結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組、依達(dá)拉奉組新生大鼠腦組織CD163、HO-1 mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，在24 h時(shí)，CD163 mRNA表達(dá)水平達(dá)到最高隨后趨于平穩(wěn)，而HO-1 mRNA表達(dá)水平達(dá)到最高時(shí)逐漸下降。但依達(dá)拉奉治療后新生大鼠CD163、HO-1 mRNA表達(dá)水平顯著高于模型組(P<0.05)。結(jié)果見圖2。

注：A：各組典型腦梗死圖片。B：各組腦組織梗死面積。與假手術(shù)組相比，*P<0.05；與模型相比，#P<0.05。圖1 造模后24 h各組SD新生大鼠腦梗死情況(n=4)Note. A，Typical pictures of brain infarct in each group.B, Brain infart area of each group. Compared with the sham operation group,*P<0.05. Compared with model group,#P<0.05.Figure 1 Infarct size of each group of neonatal rats at 24 h after model establishment

表1 各組SD新生大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量變化

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

Note. Compared with the sham operation group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05.

注：A：CD163 mRNA表達(dá)變化。B：HO-1 mRNA表達(dá)變化。與假手術(shù)組相比，*P<0.05；與模型相比，#P<0.05。以β-actin作為內(nèi)參基因。圖2 各組新生大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦組織CD163、HO-1 mRNA表達(dá)變化(n=6)Note. A，The expressing of CD163 mRNA.B，The expressing of HO-1 mRNA.Compared with the sham operation group,*P<0.05. Compared with the model group, #P<0.05.Figure 2 Changes of the expression of CD163 and HO-1 mRNA in each group of the neonatal rats at different time points

2.5 SD新生大鼠腦組織CD163、HO-1蛋白表達(dá)水平

Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組、依達(dá)拉奉組新生大鼠腦組織CD163、HO-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，依達(dá)拉奉治療后，新生大鼠CD163、HO-1蛋白表達(dá)水平顯著高于模型組(P<0.05)，與qRT-PCR結(jié)果一致。結(jié)果見圖3。

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05。與模型組相比，#P<0.05。圖3 各組新生大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦組織CD163、HO-1蛋白表達(dá)變化(n=6)Note. Compared with the sham operation group,*P<0.05. Compared with the model group, #P<0.05.Figure 3 Changes of the expression of CD163 and HO-1 proteins in each group of the neonatal rats at different time points

3 討論

新生兒HIE是圍生期的常見病，其發(fā)病率僅次于新生兒黃疸和肺炎，易造成新生兒死亡，且幸存兒常伴有智力低下、腦癱、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[8-11]。研究發(fā)現(xiàn)腦組織缺氧缺血后，花生四烯酸被環(huán)加氧酶、脂氧化酶氧化是引起腦損傷的初步反應(yīng)，進(jìn)一步導(dǎo)致氧自由基、一氧化氮、炎癥因子等產(chǎn)生增加，胞膜脂質(zhì)被過度氧化，膜上離子泵遭到破壞，鈉離子、鈣離子、水分子等進(jìn)入胞內(nèi)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞水腫、凋亡以及壞死[12-13]。新生兒HIE目前尚無既安全又有效的治療手段，因此根據(jù)其發(fā)病機(jī)理尋找新的治療藥物尤為重要。

依達(dá)拉奉是臨床常用的腦保護(hù)劑，其在治療急性腦梗死、腦出血及其相關(guān)疾病具有很好的療效，它可通過清除自由基防止脂質(zhì)過氧化；保護(hù)腦組織、血管內(nèi)皮免受氧化損傷，從而減輕腦缺血引起的腦水腫、腦梗塞[14-15]，故在理論上它能夠治療新生兒HIE。本研究參照Rice等[7]HIBD模型經(jīng)典創(chuàng)建方法，選用與新生兒神經(jīng)發(fā)育類似的7日齡新生大鼠，術(shù)后缺氧過程中新生大鼠出現(xiàn)呼吸加快、發(fā)紺、站立不穩(wěn)，隨后新生大鼠行為能力發(fā)生障礙，夾尾旋轉(zhuǎn)；顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)結(jié)扎側(cè)大腦形態(tài)異常，出現(xiàn)腦含水量增加，腦組織腫脹，腦梗死等。與前人造模結(jié)果[7]一致。經(jīng)依達(dá)拉奉治療HIBD新生大鼠后，上述行為學(xué)癥狀明顯改善；模型組新生大鼠大腦左側(cè)腦含水量顯著增加，腦腫脹程度嚴(yán)重，梗死區(qū)域較大，而依達(dá)拉奉治療后左側(cè)腦含水量顯著減少，腦腫脹程度減輕，梗死面積顯著減小，說明依達(dá)拉奉治療能明顯減輕HIBD新生大鼠腦水腫、腦梗死程度。

研究發(fā)現(xiàn)，缺氧缺血腦損傷組織中CD163、HO-1的表達(dá)明顯增加[16-17]。CD163屬于富半胱氨酸清道夫受體家族(SRCR)成員，通常分布于單核-巨噬細(xì)胞膜表面，在單核細(xì)胞發(fā)育成巨噬細(xì)胞過程中，其表達(dá)持續(xù)上升。小膠質(zhì)細(xì)胞在生理?xiàng)l件下不表達(dá)CD163，在受到Hb刺激后才開始表達(dá)CD163。血漿中Hb的主要結(jié)合蛋白是觸珠蛋白(Hp)，Hb-Hp結(jié)合物能被單核或巨噬細(xì)胞膜上CD163受體攝入胞內(nèi)，其在內(nèi)質(zhì)體中分解為強(qiáng)氧化物——血紅素，其生成后可由內(nèi)質(zhì)體轉(zhuǎn)移至溶酶體，血紅素氧化酶(HO)可催化其代謝為亞鐵離子、一氧化碳以及膽綠素，血紅素具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，易造成繼發(fā)性腦損傷。HO包括兩種亞型：HO-1和HO-2，腦損傷后HO-1在神經(jīng)系統(tǒng)起關(guān)鍵作用，因此腦損傷后CD163/HO-1途徑為Hb分解代謝的重要途徑[18-19]。在正常生理?xiàng)l件下，每天約10%紅細(xì)胞發(fā)生退化，退化紅細(xì)胞內(nèi)的Hb可通過CD163/HO-1途徑分解清除。然而，在病理?xiàng)l件下，CD163/HO-1途徑分解Hb的作用加強(qiáng)，CD163、HO-1在腦損傷引起的腦水腫組織中的表達(dá)明顯增加[20]。此外，CD163還具有抗脂質(zhì)過氧化、抗炎作用[21]。因此，本研究通過雙結(jié)扎新生大鼠左頸總動脈并缺氧制作HIBD模型，比較依達(dá)拉奉治療組和模型組中腦水腫組織周圍CD163與其下游蛋白HO-1的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)變化，對依達(dá)拉奉治療與腦水腫組織CD163、HO-1轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的相關(guān)性做了基本的研究和探討。本研究結(jié)果顯示模型組、依達(dá)拉奉組新生大鼠腦組織中CD163、HO-1的表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組，而且依達(dá)拉奉治療后新生大鼠腦組織中CD163、HO-1的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平明顯高于模型組，說明依達(dá)拉奉可能通過激活CD163/HO-1信號通路來減輕HIBD新生大鼠腦水腫、腦梗死程度。這充實(shí)了CD163/HO-1途徑在缺氧缺血腦損傷方面實(shí)驗(yàn)研究，為依達(dá)拉奉臨床治療新生兒HIE提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論指導(dǎo)。

模型組新生大鼠腦損傷組織中CD163、HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增加；依達(dá)拉奉治療后新生大鼠腦組織中CD163、HO-1的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平明顯增高，且依達(dá)拉奉治療能明顯減輕HIBD新生大鼠腦水腫、腦梗死程度。新生兒HIE發(fā)生發(fā)展的相關(guān)因素很多、相關(guān)機(jī)制復(fù)雜，依達(dá)拉奉最終在臨床上能否治療新生兒HIE，還需繼續(xù)深入的研究。