111In標(biāo)記的博來霉素復(fù)合物用于鑒別裸鼠高級和低級別膠質(zhì)瘤的實驗研究

王明霜， 唐 禹， 陳 躍， 馮 悅， 趙 巖， 陳 琳

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，核醫(yī)學(xué)與分子影像四川省重點實驗室，瀘州 646000 ； 2.四川大學(xué)原子核科學(xué)技術(shù)研究所，成都 610000)

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤，占腦中所有惡性腫瘤的80%。 在美國，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的平均發(fā)病率為每10萬人6.61(6.57%～6.6%)和2003年至2011年[1]。 膠質(zhì)瘤起源于腦膠質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)其細(xì)胞類型根據(jù)組織學(xué)表現(xiàn)和生物分子狀態(tài)進(jìn)行分類，最常見于星形細(xì)胞瘤或少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤，并根據(jù)其等級，低級(I-II級)或高級(III -IV級)[2]。成人低級別膠質(zhì)瘤的10年生存率約為43%[3]。據(jù)報道，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤與星形細(xì)胞瘤相比具有相對更有利的結(jié)果。與I級和II級膠質(zhì)瘤相比，III級膠質(zhì)瘤預(yù)后明顯更差[4]。最常見的顱內(nèi)腫瘤，即IV級膠質(zhì)瘤，也稱為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，中位生存期為15個月[5]。準(zhǔn)確評估腫瘤分級和類型對于最佳治療計劃至關(guān)重要。腫瘤的診斷，分類和分級是建立在活檢或切除，與相當(dāng)大的風(fēng)險相關(guān)，包括死亡，特別是在大腦的中央?yún)^(qū)域[6]。此外，活組織檢查或亞全切除術(shù)的診斷可能受到樣本不具代表性的限制，導(dǎo)致腫瘤分級的下降[7]，甚至可能會誤導(dǎo)治療計劃，采取更保守的策略。 此外，不能手術(shù)或不愿接受手術(shù)或腫瘤位于雄辯區(qū)域的患者可能不適合進(jìn)行外科手術(shù)，即使他們有資格接受包括化療和/或放療在內(nèi)的輔助治療。

因此，即使目前沒有理想的成像技術(shù)，也非常需要術(shù)前對腦腫瘤進(jìn)行分級的替代方法，其中PET顯像作為合理的替代方案。本研究合成111In-博來霉素復(fù)合物(111In-labeled bleomycin complex，111In-BLMC)，并用作SPECT掃描的追蹤劑，觀察高級別和低級別膠質(zhì)瘤的差異，現(xiàn)將方法和結(jié)果報告如下：

1 材料和方法

1.1 實驗材料

SPF 級3月齡雄性 SD 大鼠 34 只，，由西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SCXK(川)2013-17]，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心實驗室[SYXK(川)2013-181]。實驗前在實驗室飼養(yǎng)1周適應(yīng)新環(huán)境。對大鼠進(jìn)行分組：實驗組 22 只，對照組12只。

SHG44細(xì)胞和U251細(xì)胞膠質(zhì)瘤細(xì)胞株購自于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；其他物品均由西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。111In-BLMC是由13個色譜不同的亞基組成，并由西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院提供。用于放射標(biāo)記前，111In-BLMC溶于生理鹽水，配制成2 mg/mL，并通過緩沖液調(diào)成pH值為7.35～7.45。該研究得到了西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會同意并執(zhí)行，并有簽訂知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SHG44細(xì)胞和U251細(xì)胞膠質(zhì)瘤細(xì)胞于1640培養(yǎng)基(添加10% 胎牛血清)培養(yǎng)。依據(jù)培養(yǎng)瓶細(xì)胞代謝產(chǎn)物及細(xì)胞密度給予換液及傳代。接種細(xì)胞前，用0.25%胰酶消化并吹散細(xì)胞，吸出消化液，并加入含1% 瓊脂糖的無血清1640培養(yǎng)基為細(xì)胞懸浮, 細(xì)胞懸液終濃度為1×106/mL。

1.2.2 裸鼠成瘤實驗

選擇裸鼠腋下接種，接種前用0.5%碘伏對進(jìn)針部位進(jìn)行消毒。實驗組裸鼠接種的細(xì)胞懸液為SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞，對照組接種的細(xì)胞懸液為U251細(xì)胞。穿刺注射器排除空氣，吸入0.2 mL細(xì)胞懸液，從進(jìn)針部位向前穿刺大約1 cm，進(jìn)行皮下注射。并每日測量一次裸鼠的腫瘤的體積，每次每只小鼠測量兩次取平均值，并做詳細(xì)記錄，實驗周期為首次治療劑量給藥后的第16天，實驗結(jié)束后處死所有的腫瘤小鼠，取出腫瘤組織進(jìn)行稱重，按組記錄，取平均值。實驗結(jié)束后，每組隨機(jī)抽取小鼠3只(包括實驗組、對照組)，進(jìn)行病理切片顯微鏡觀察。

1.2.3 顯像方法

在進(jìn)行掃描前，要求裸鼠禁食至少6 h以上。注射111In-BLMC前囑咐所有服用加入過氯酸鉀100 mg的飲用水。通過尾靜脈注射111In-BLMC后，進(jìn)行22幀動態(tài)序列(6×10 s，4×15 s，2×30 s，2×60 s，2×150 s和6×300 s)，然后重建2個靜態(tài)FET PET幀整個腦在10～30 min(FET10-30)和20～40 min(FET20-40)。對于所有圖像，應(yīng)用默認(rèn)隨機(jī)，散射和死區(qū)時間校正以及基于低劑量CT的衰減校正。

1.2.4 圖像結(jié)果處理

腦實質(zhì)出現(xiàn)放射性物質(zhì)可定義為異常放射性濃聚，除腦室內(nèi)脈絡(luò)膜外。選擇腫瘤部位放射性濃聚最明顯的橫斷面斷層圖像，確定ROI。并采用鏡影技術(shù)，在對側(cè)相同部位勾畫相同形狀和大小的區(qū)域。分別對早期相和延遲相顯像進(jìn)行半定量分析。在OM線橫斷面上取1幀腫瘤放射性濃聚最明顯的圖像，確定腫瘤ROI并將對側(cè)鏡面部位定為本底，以L/N分別計算111In-BLMC早期和延遲相攝取指數(shù)，并計算滯留指數(shù)(RI)。RI=延遲攝取指數(shù)/早期攝取指數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 基本資料

34只腦膠質(zhì)瘤裸鼠均接種成功，術(shù)后組織學(xué)提示實驗組22只裸鼠為高級別膠質(zhì)瘤，2周后裸鼠的腫瘤體積為(567±124)mm3，對照組12只為低級別膠質(zhì)瘤，2周后裸鼠的腫瘤體積為(531±108)mm3。U251細(xì)胞接種的裸鼠為對照組，SHG44細(xì)胞接種的裸鼠為實驗組，兩組的鼠齡、性別、體重指數(shù)、腫瘤體積均無統(tǒng)計學(xué)差異。

2.2 攝取、滯留指數(shù)與腦膠質(zhì)瘤組織學(xué)關(guān)聯(lián)

111In-BLMC標(biāo)記所有的SPECT均為陽性，見圖1所示。在低級別膠質(zhì)瘤組中(a和c組)，早期和延遲相111In-BLMC攝取指數(shù)和滯留指數(shù)分別(1.59±1.68)和(2.99±1.36)，在高級別膠質(zhì)瘤組中(b和d組)，早期和延遲相111In-BLMC攝取指數(shù)和滯留指數(shù)分別(3.47±1.66)和(5.193±1.49)；如圖2所示，有統(tǒng)計學(xué)差異(均P<0.01)。

注：a和c為對照組裸鼠(低級別膠質(zhì)瘤)，其中a為24 h后111In-BLMC標(biāo)記的SPECT結(jié)果，c為72 h后111In-BLMC標(biāo)記的SPECT結(jié)果；b和d為實驗組裸鼠(高級別膠質(zhì)瘤)，其中b為24 h后111In-BLMC標(biāo)記的SPECT結(jié)果，d為72 h后111In-BLMC標(biāo)記的SPECT結(jié)果。圖1 111In-BLMC標(biāo)記的SPECT在實驗組和對照組腦膠質(zhì)瘤裸鼠的結(jié)果Note. a and c are control nude mice (low grade glioma). a is the SPECT result of 111In-BLMC labeling after 24 h. c is the SPECT result of 111In-BLMC labeling after 72 h. b and d are the experimental group of nude mice (high-grade glioma). b is the SPECT result of 111In-BLMC labeling after 24 h. d is the SPECT result of 111In-BLMC labeling after 72 h.Figure 1 Results of 111In-BLMC-labeled SPECT in nude mice with glioma in the experimental group and the control group

2.3 攝取、滯留指數(shù)診斷高級別腦膠質(zhì)瘤的ROC曲線

為進(jìn)一步探討111In-BLMC標(biāo)記所有裸鼠的SPECT診斷膠質(zhì)瘤的敏感性和特異性，研究人員將進(jìn)行ROC曲線分析，當(dāng)攝取指數(shù)< 1.898時，診斷低級別膠質(zhì)瘤的敏感性為66.67%，特異性為85.71%(P<0.01)；當(dāng)滯留指數(shù)< 3.155時，診斷低級別膠質(zhì)瘤的敏感性為58.33%，特異性為63.66%(P<0.01)，ROC曲線如圖3所示。

3 討論

注：HGG:高級別膠質(zhì)瘤，LGG:低級別膠質(zhì)瘤，與LGG比較，**P<0.01。圖2 不同級別膠質(zhì)瘤的攝取和延遲指數(shù)Note. HGG,High-grade glioma. LGG,Low-grade glioma. Compared with the LGG group， **P<0.01.Figure 2 Uptake and delay index of the gliomas of different grades

圖3 攝取指數(shù)和滯留指數(shù)診斷膠質(zhì)瘤的ROC曲線Figure 3 ROC curve of uptake index and retention index in the diagnosis of glioma

SPECT顯像是現(xiàn)代診斷腫瘤的重要手段之一，腫瘤顯像分子探針可以分為兩大類，非特異性陽性顯像與特異性腫瘤顯像[8]。18F-FDG是現(xiàn)階段用于PET腫瘤診斷的重要的非特異性正電子顯像劑，但是由于其選擇性低，特異性不強(qiáng)，不具有靶向性，在現(xiàn)代腫瘤診斷中已經(jīng)不能滿足臨床需要。特異性腫瘤正電子顯像劑，由于可以與腫瘤受體特異性結(jié)合，在腫瘤診斷中更具有特異性與準(zhǔn)確性。癌癥病人早診斷早治療是降低患者危害的最佳辦法，因此靶向的顯像劑與靶向抗腫瘤藥物正是最佳選擇[9]。腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)的受體是診斷和治療腫瘤的一個潛在靶點。通過檢測腫瘤細(xì)胞中受體的表達(dá)程度可以準(zhǔn)確對腫瘤進(jìn)行診斷、分期、監(jiān)測治療效果等。所以新型靶向顯像劑的研發(fā)已經(jīng)成為了當(dāng)今最熱門的話題之一。

111In是通常用于閃爍顯像的放射性核素(t1/2∶2.81 d，172和247keV光子發(fā)射)，平均每個衰變發(fā)射14.7個俄歇電子(平均能量：0.46 keV)，也可能適合放療。具有< 2 keV的平均能量的俄歇電子是在組織中具有亞細(xì)胞路徑長度(2～500 nm)的高LET輻射。俄歇電子發(fā)射放射性藥物當(dāng)細(xì)胞內(nèi)化到細(xì)胞質(zhì)中時對細(xì)胞具有高度毒性，特別是如果摻入到DNA中可能導(dǎo)致染色體損傷，并且已經(jīng)被認(rèn)為是腫瘤的放射治療劑。111In與多種納米粒子如DTPA-A5-CCPM、DTPA-CCPM、DOTA/Cy5.5/Herceptin等形成的復(fù)合物在體內(nèi)有著良好的分布，通過SPECT/NIRF成像可以觀察到高腫瘤積聚和強(qiáng)的腫瘤與正常組織的對比，用于小鼠腫瘤的多模態(tài)成像[10-12]。

BLMC在生理和病理生理條件下啟動內(nèi)在的凋亡途徑。發(fā)現(xiàn)BLM表達(dá)的降低與腫瘤促進(jìn)和自身免疫相關(guān)，而過度表達(dá)抑制腫瘤生長和耐藥性，因為癌細(xì)胞抑制BLMC表達(dá)和穩(wěn)定性。除了其在正常的動態(tài)平衡的作用，BLMC已經(jīng)成為腫瘤發(fā)生的調(diào)節(jié)中的球員，因此獲得關(guān)注，作為一個合理的目標(biāo)化療。BLMC表達(dá)和穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)在多個層面復(fù)雜和調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后，翻譯后(優(yōu)選通過磷酸化和泛素化)，表觀遺傳(通過啟動子乙?；蚣谆?，包括miRNA。此外，可以利用對BLMC表達(dá)和穩(wěn)定性的控制來增強(qiáng)化學(xué)療效，克服耐藥性并選擇抗癌藥物方案，因為各種化療劑利用BLMC作為細(xì)胞死亡的執(zhí)行者[13]。由于其有效的抗腫瘤活性，許多BH3模擬物例如ABT-737，ABT-263，obatoclax，AT-101和A-1210477已被開發(fā)并進(jìn)入臨床試驗。更有可能的是，在不久的將來，控制BLMC表達(dá)和穩(wěn)定性的策略最終導(dǎo)致基于BLMC的用于癌癥治療的治療方案。

111In與BLMC通過一定條件形成穩(wěn)定的復(fù)合物后，由于其二者本身對腫瘤具有的殺傷性，同時對某些腫瘤的特異性結(jié)合，使其能夠在腫瘤的瘤體內(nèi)停滯一定的時間，達(dá)到腫瘤顯影以及一定的治療作用，SPECT的圖像清晰，病灶定位準(zhǔn)確，所以這種復(fù)合顯像劑在臨床診斷方面具有其自身的優(yōu)勢。癌癥的死亡率偏高，究其主要原因是靶向性顯像劑品種少和早期F18-FDG診斷不靈敏，同時靶向抗癌藥物少。所以研發(fā)診斷腫瘤的特異性顯像劑尤為重要，著手以BLMC進(jìn)行111In標(biāo)記，從而得到新的腫瘤靶分子影像探針，確定他們的結(jié)構(gòu)表征與藥代動力學(xué)參數(shù)。通過在不同腫瘤動物模型上進(jìn)行SPECT顯像，確定其在不同腫瘤中的構(gòu)效關(guān)系，篩選出最優(yōu)靶向性最高的特異性腫瘤[14-15]。并為將來將其進(jìn)行轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究做好基礎(chǔ)工作，豐富腫瘤的顯像診療一體化。并將其應(yīng)用于臨床，提高腫瘤患者的生存率。

本實驗結(jié)果也證實使用111In-BLMC對于在低級別和高級別腦膠質(zhì)瘤患者中出現(xiàn)了很好的追蹤差異。低級別腦膠質(zhì)瘤顯示出少量或基本不吸收，而在高級別腦膠質(zhì)瘤顯示出顯著的吸收。這可能意味著111In-BLMC能夠優(yōu)先與高級別膠質(zhì)瘤表達(dá)的相關(guān)蛋白結(jié)合，從而出現(xiàn)較大的差異。

綜上，研究人員認(rèn)為111In-BLMC能夠作為SPECT的追蹤劑，從而區(qū)別高級別和低級別腦膠質(zhì)瘤，進(jìn)而為臨床診斷和術(shù)前提供參考價值。