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    中藥健脾益肺方對EAAT2表達(dá)的影響

    2019-04-28 02:59:50李惠珍任展能李雅青楊碧瑩杜寶新
    中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2019年4期
    關(guān)鍵詞:星形谷氨酸膠質(zhì)

    李惠珍, 任展能, 李雅青, 楊碧瑩*, 杜寶新

    (1.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院, 廣州 510000;2.廣東省中醫(yī)院, 廣州 510000)

    肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS),又名運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病,是一種破壞性的神經(jīng)退行性疾病,引起上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損害,運(yùn)動(dòng)功能喪失,最終導(dǎo)致患者死亡。目前該疾病病因未明,關(guān)于其發(fā)病存在較多假說,現(xiàn)階段普遍接受的是谷氨酸介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒性;JPYF方是廣東省中醫(yī)院腦病四科杜寶新主任團(tuán)隊(duì)研發(fā)治療ALS的經(jīng)驗(yàn)復(fù)方,本課題組數(shù)十年的前期臨床研究發(fā)現(xiàn),JPYF方從肺脾論之對ALS患者有改善疾病預(yù)后的趨勢,一定程度上延緩疾病進(jìn)展;前期的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),JPYF方對ALS轉(zhuǎn)基因小鼠起到延緩體重下降,延緩臨床發(fā)病時(shí)間,延長生存期,改善運(yùn)動(dòng)能力的作用,但均未進(jìn)一步闡明其分子生物學(xué)機(jī)制。近30年來,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為谷氨酸的興奮性毒性是導(dǎo)致神經(jīng)元退行性變性、死亡的核心內(nèi)容[1]。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)含量最高、分布最廣、作用最強(qiáng)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),其合成、釋放和回收均依靠谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體及其相關(guān)分子完成谷氨酸-谷氨酰胺這一循環(huán)[2]。EAAT2是清除突觸間隙谷氨酸的主力軍,在維持谷氨酸穩(wěn)態(tài)和保護(hù)神經(jīng)元起重要作用。研究發(fā)現(xiàn),EAAT2的下調(diào)或功能失調(diào),將引起多種神經(jīng)變性疾病,如癲癇、AD、ALS等[3]。為進(jìn)一步探討谷氨酸興奮性毒性在ALS發(fā)病機(jī)制中的作用,本研究擬通過觀察JPYF方對谷氨酸誘導(dǎo)幼鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞EAAT2的表達(dá)及對元代脊髓神經(jīng)元的影響,探討ALS的發(fā)病機(jī)制及JPYF方的作用機(jī)理。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    孕14~16 d SPF級SD母鼠(15只),體重290~350 g,由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SYXK(粵)2013-0094],待產(chǎn),取新生24 h內(nèi)幼鼠以提取大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞;取胎鼠以提取脊髓神經(jīng)元。無菌手術(shù)在廣東省中醫(yī)院科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心生物安全柜進(jìn)行[SCXK(粵) 2013-0002]。本實(shí)驗(yàn)由廣東省中醫(yī)院動(dòng)物倫理中心審核動(dòng)物倫理:倫理編號2017039。

    1.1.2 JPYF方組成及凍干粉制備

    黃芪30 g,黨參15 g,云苓10 g,白術(shù)15 g,五味子10 g,菟絲子10 g,麥冬10 g,陳皮5 g,法夏6 g,制馬錢子0.2 g,甘草6 g等均來自本院中藥房,購于康美藥業(yè)。雙蒸水(沒過藥物)浸泡3 h,煮沸1 h,10層紗布過濾,收集濾液;再加雙蒸水(沒過藥渣),煮沸40 min,10層紗布過濾后合并濾液,濾液回旋冷凝濃縮,收集濃縮液,冷凍干燥得凍干粉,以兩劑生藥(222.4 g),制得206.2 g凍干粉;-80℃保存,備用。體外實(shí)驗(yàn)藥液配制:稱取1 g中藥凍干粉加入20 mL無血清DMEM/F12培養(yǎng)基中,配置濃度為50 g/L的母液,震蕩至完全溶解,0.22 μm針頭濾器過濾,4℃保存?zhèn)溆茫看文敢菏褂弥芷诓怀^1周。

    1.2 主要試劑與儀器

    NeurobasalTMMedium培養(yǎng)基、谷氨酰胺、多聚賴氨酸(10888022、25030081、P1399)購自SIGMA;B-27(17504044)購自LIFE;FBS(1600044)購自GIBCO;馬血清(SH30074.03)購自Hyclone;GFAP、EAAT2、ChAT抗體(ab7260、ab41621、ab18736)購自Abcam;NEUN抗體(MAB377)購自Chemicon millipore公司;谷氨酸試劑盒(A074)購自南京建成;培養(yǎng)基A配制:89% DMEM/F12+10% FBS+1%雙抗;培養(yǎng)基B配制:90% DMEM/F12+5% FBS+4%馬血清+1%雙抗;培養(yǎng)基C配制:96.5% NeurobasalTM+2% B27+1%谷氨酰胺+0.5%雙抗。

    冷凍干燥機(jī)ALPHA2-4/LSC(德國 Martin Christ公司); Countstar 型細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 (美國 Inno-Alliance Biotech 公司);多功能酶標(biāo)儀Victor X5(美國Perkin Elme公司);奧林巴斯光學(xué)顯微鏡SZ61(日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社);TS-1000 型脫色搖床(其林貝爾儀器制造有限公司)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元原代分離、提取與培養(yǎng)

    取新生24 h內(nèi)SD幼鼠,斷頭處死,仔細(xì)提取大腦皮質(zhì)組織;胰酶+DNA酶消化20 min,取上清經(jīng)200目細(xì)胞篩過濾,重復(fù)3次;收集濾液,離心,懸液;差速貼壁30 min,取上清,重懸后調(diào)整密度到1×106/mL,于含有培養(yǎng)基A的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),每3 d換液。培養(yǎng)至10 d左右將細(xì)胞至于37℃恒溫?fù)u床24 h,去除小膠質(zhì)細(xì)胞及其他雜質(zhì)細(xì)胞,收集純化細(xì)胞傳代備用。

    取胎齡16天的SD孕鼠,麻醉、消毒,立即取出串珠樣子宮放入預(yù)冷培養(yǎng)基B中;參考上述步驟取胎鼠脊髓,調(diào)節(jié)密度1×105/mL,每孔0.1 mL接種到96孔板,每孔7×105接種于6孔板細(xì)胞爬片上(取材前一天用50 μmol/mL多聚賴氨酸包被4 h,晾干,PBS洗3次后烘干備用),2 h后補(bǔ)足培養(yǎng)液,4~6 h后更換培養(yǎng)基C;之后每3 d半量換液。

    1.3.2 IF法鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元

    收集對數(shù)生長期的星形膠質(zhì)細(xì)胞種板于共聚焦培養(yǎng)皿中(或培養(yǎng)至6~7 d的神經(jīng)元細(xì)胞爬片),次日PBS搖洗3次,每次10 min,4%多聚甲醛固定,0.3%曲通室溫通透20 min,搖洗,10%山羊血清室溫封閉60 min;一抗(星形膠質(zhì):GFAP (1∶1500);神經(jīng)元:ChAT(1∶500))4℃過夜;復(fù)溫,搖洗后,加入對應(yīng)種屬二抗(FITC(1∶200)和cy3(1∶300))37℃孵育1 h;DAPI染核5 min,搖洗;風(fēng)干,滴加熒光淬滅劑,晾干后共聚焦顯微鏡下觀察。

    1.3.3 MTT法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞活力

    調(diào)整星形膠質(zhì)細(xì)胞密度每孔1×104接種于96孔板,24 h后,吸去培養(yǎng)液,加入含JPYF方的培養(yǎng)液A預(yù)處理24 h(終濃度0.25、0.5、1 g/L) 分別為B、C、D組, PBS沖洗后處理同A組;谷氨酸(A)組:加入含谷氨酸培養(yǎng)液(250 μmoL/L培養(yǎng)4 h;對照(E)組:正常培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間的星形膠質(zhì)細(xì)胞,每組均6個(gè)復(fù)孔。藥物作用足夠時(shí)間后,去培養(yǎng)液,加入每孔110 μL含5% MTT的培養(yǎng)基,4 h后,吸去培養(yǎng)基加入每孔150 μL DMSO,震蕩混勻10 min,570 nm 波長檢測吸光度A,按照以下公式:細(xì)胞存活率=(A加藥組-A空白組) /(A正常組-A空白組) ×100%計(jì)算細(xì)胞活力。

    1.3.4 IF法檢測EAAT2的熒光強(qiáng)度

    將星形膠質(zhì)細(xì)胞每孔2萬接種于共聚焦培養(yǎng)皿,48 h后,分組處理同MTT法,藥物作用時(shí)間足夠后,進(jìn)行IF法檢測,(一抗EAAT2 (1∶500)),二抗(cy3(1∶500))。

    1.3.5 Western blot法檢測EAAT2蛋白的表達(dá)

    將星形膠質(zhì)細(xì)胞以每孔5×105接種于6孔板,分組處理同MTT法。藥物作用時(shí)間足夠后,吸去原培養(yǎng)液,PBS沖洗2次,每孔加入30 μL裂解液,充分裂解,刮板,收集裂解液,渦旋離心取上清,BCA測蛋白濃度,按每孔40 μg蛋白樣品,加入10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)中電泳,轉(zhuǎn)膜,5%牛奶封閉60 min,洗凈封閉液,加入一抗(1∶1000)4℃過夜。次日加入二抗(1∶2000)孵育60 min。在PVDF膜上加入適量ECL顯影液,用Image Lab顯影成像并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

    1.3.6 紫外比色法測定谷氨酸濃度

    將星形膠質(zhì)細(xì)胞以每孔5×105接種于6孔板,分組處理同MTT法。藥物作用時(shí)間足夠后,收集各組上清培養(yǎng)液;嚴(yán)格按照谷氨酸試劑盒操作方法,取各組上清液、雙蒸水、谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液各50 μL于96孔板,每組6個(gè)復(fù)孔,加入按比例配置好的工作液150 μL,混勻,340 nm 波長檢測各孔吸光度A1,每孔加入2 μL配置好的試劑五,充分混勻后,37℃孵育40 min,340 nm 波長檢測各孔吸光度A2;按照以下公式:谷氨酸濃度(μmol/L)=(測定A2值-測定A1值)-(空白A2值-空白A1值)/(標(biāo)準(zhǔn)A2值-標(biāo)準(zhǔn)A1值)-(空白A2值-空白A1值)*標(biāo)準(zhǔn)品濃度(200 μmoL/L)*樣品測試前稀釋倍數(shù)。

    1.3.7 IF法檢測神經(jīng)元存活情況

    取各組培養(yǎng)基上清作用于培養(yǎng)至6~7 d的神經(jīng)元,培養(yǎng)4 h后,按IF法檢測各組神經(jīng)元存活情況。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件先進(jìn)行方差分析和齊性檢驗(yàn),當(dāng)滿足正態(tài)分布及方差齊性時(shí),采用單因素方差分析;若不滿足采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,所有指標(biāo)至少重復(fù)3次。

    2 結(jié)果

    2.1 IF法鑒定原代星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞

    傳至第三代的星膠細(xì)胞,核呈圓球形常位于中央,胞突豐富,分支長而多,細(xì)胞之間聯(lián)系緊密;運(yùn)用GFAP特異性染色,F(xiàn)ITC標(biāo)記成綠色所占DAPI核染比例為96%以上,結(jié)果見圖1。

    圖1 熒光鏡下觀察、鑒定原代星形膠質(zhì)細(xì)胞(IF, × 200,×400)Figure 1 Observation and identification of primary astrocytes under a fluorescence microscope

    培養(yǎng)至6 d的脊髓神經(jīng)元,細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定,核大而圓,胞體飽滿,立體感強(qiáng),折光性好,突起細(xì)長,各細(xì)胞之前有聚集生長趨勢,軸突緊密聯(lián)系,Cy3標(biāo)記紅色所占DAPI核染比例為90%以上,結(jié)果見圖2。

    2.2 MTT法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞活力

    與正常組比較,谷氨酸造模組細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01),與造模組比較,不同濃度的JPYF方預(yù)處理組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),并在0.25~1 g/L濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴,詳見表1、圖3。

    圖2 熒光鏡下觀察、鑒定原代神經(jīng)元細(xì)胞(IF, × 200)Figure 2 Observation and identification of primary neuronal cells under a fluorescence microscope

    表1 不同分組星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率

    注:與正常組比較,bP<0.01;與模型組比較,dP<0.01。

    Note. Compared with the normal group,bP<0.01. Compared with the model group,dP<0.01.

    注:與正常組比較,bP<0.01;與模型組比較, dP<0.01。圖3 谷氨酸對星形膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響Note.Compared with the normal group, bP<0.01. Compared with the model group, dP<0.01.Figure 3 Effect of glutamate on the astrocyte viability

    2.3 EAAT2蛋白表達(dá)情況

    2.3.1 IF法檢測EAAT2蛋白熒光強(qiáng)度

    與造模組比較,不同濃度JPYF方預(yù)處理組蛋白熒光強(qiáng)度比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01),提示JPYF方可增加EAAT2蛋白的表達(dá)。詳見表2,圖4。

    2.3.2 Western blot法檢測EAAT2蛋白表達(dá)

    JPYF方預(yù)處理24 h,谷氨酸作用4 h后,對照組EAAT2蛋白有一定基礎(chǔ)表達(dá),JPYF方組從0.25 g/L開始,隨著濃度增加,EAAT2蛋白表達(dá)依次提高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),提示JPYF方可提高EAAT2蛋白水平。詳見圖5、圖6。

    2.4 各組星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基上清谷氨酸濃度測定

    與谷氨酸組比較, JPYF方預(yù)處理組上清谷氨酸濃度隨JPYF方濃度增高而下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01),但均高于正常組。詳見表3、圖7。

    表2 IF法檢測EAAT2蛋白熒光強(qiáng)度

    注:與正常組比較,bP<0.01;與模型組比較,dP<0.01。

    Note. Compared with the normal group,bP<0.01. Compared with the model group,dP<0.01.

    圖4 熒光鏡下觀察各組EAAT2蛋白表達(dá)Figure 4 Expression of EAAT2 protein in each group was observed under a fluorescence microscope

    注:與正常組比較,bP<0.01;與模型組比較,cP<0.05, dP<0.01。圖5 Western blot法檢測EAAT2蛋白表達(dá)水平Note. Compared with the normal group,bP<0.01.Compared with the model group,cP<0.05, dP<0.01.Figure 5 Determination of EAAT2 protein expression levels by Western blotting

    2.5 各組星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基上清對原代脊髓神經(jīng)元細(xì)胞的影響

    與造模組比較,不同濃度JPYF方預(yù)處理組神經(jīng)元存活個(gè)數(shù)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01),提示健脾益肺方可提高EAAT2活性及蛋白水平,降低細(xì)胞外液谷氨酸含量,減少谷氨酸興奮性毒性,從而保護(hù)神經(jīng)元。詳見表4、圖8。

    3 討論

    本課題組結(jié)合自身臨床經(jīng)驗(yàn)及查閱ALS相關(guān)古籍發(fā)現(xiàn)該病以肺脾兩虛為主者居多,中醫(yī)認(rèn)為“脾主肌肉,主四肢”,“肺主氣,司呼吸”, 脾為肺之母,肺為脾之子,故參考《脾胃論》補(bǔ)中益氣湯和《備急千金要方》補(bǔ)肺湯自擬治療ALS的經(jīng)驗(yàn)方;JPYF方以黃芪、黨參為君,補(bǔ)益肺脾之氣緩解臨床出現(xiàn)肢體肌無力、肌萎縮,氣短的患者,臣以白術(shù)、茯苓、麥冬補(bǔ)脾氣而生肺氣;佐以健脾理氣化痰之陳皮、

    圖6 星形膠質(zhì)細(xì)胞EAAT2蛋白的表達(dá)Figure 6 Expression of EAAT2 protein in the astrocytes

    組別Groups 原始給藥濃度(Original dose)健脾益肺方(g/kg) JPYF prescription谷氨酸(μmoL/L)Glutamate 上清液谷氨酸濃度(μmol/L)Supernatant glutamate concentration 谷氨酸組(Glutamate group)250113.98±11.19b0.2525094.30±4.80dJPYF方組(JPYF prescription group)0.525080.53±4.32d125064.47±0.30d正常組(Normal group)--26.09±1.22

    注:與正常組比較,bP<0.01;與模型組比較,dP<0.01。

    Note.Compared with the normal group,bP<0.01. Compared with the model group,dP<0.01.

    表4 熒光鏡下觀察不同原始給藥濃度組上清液對脊髓神經(jīng)元細(xì)胞影響

    注:與正常組比較,bP<0.01;與模型組比較,cP<0.05,dP<0.01。

    Note.Compared with the normal group,bP<0.01. Compared with the model group,cP<0.05,dP<0.01.

    法夏,使補(bǔ)而不膩,射干、杏仁宣肺利咽、開音散結(jié),馬錢子健脾益氣,強(qiáng)肌,諸藥合用,已達(dá)健脾補(bǔ)肺強(qiáng)肌之效,前期臨床及基礎(chǔ)研究多有見效[4-6];現(xiàn)代研究證明,中藥可減輕谷氨酸興奮性毒性,黃芪可明顯改善谷氨酸損傷后細(xì)胞的活性[7],黃芪益母草注射液、人參皂甙R均可減輕神經(jīng)興奮毒性[8-9]。

    肌萎縮側(cè)索硬化是一種主要累及上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的進(jìn)行性致死性神經(jīng)變性疾病,病變主要損害脊髓前角細(xì)胞、腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的肌萎縮、無力,80%~90%的患者于發(fā)病后3~5年因呼吸衰竭死亡[10]。目前該病發(fā)病機(jī)制尚不清楚,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ALS 患者血漿和腦脊液中谷氨酸水平較正常人高[1],在 ALS 模型小鼠的脊髓中也發(fā)現(xiàn)谷氨酸水平升高的情況[11],認(rèn)為ALS的發(fā)病與谷氨酸興奮性毒性密切相關(guān)。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),胞外谷氨酸的代謝再循環(huán)只能依靠谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(EAATs)來完成,EAATs分子的作用是通過再攝取來調(diào)節(jié)胞外谷氨酸的濃度,并因此保持胞外靜息狀態(tài)1~3 μmol/L的谷氨酸濃度[12]。EAAT2 是腦內(nèi)興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體中最主要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,負(fù)責(zé)中樞神經(jīng)系統(tǒng)90%的谷氨酸再攝取,其表達(dá)主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞胞膜上[13]。研究發(fā)現(xiàn)通過翻譯活化提高EAAT2表達(dá),可以保護(hù)培養(yǎng)的神經(jīng)元免受谷氨酸介導(dǎo)的興奮毒性損傷和死亡,延遲ALS動(dòng)物模型運(yùn)動(dòng)功能的下降和延長其壽命[14]。Rothstein等表示在ALS患者的尸解中谷氨酸鹽的功能性運(yùn)輸減少和EAAT2免疫反應(yīng)性降低[15-16],并且轉(zhuǎn)基因小鼠中EAAT2的消耗會(huì)直接導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[17]。Chen等組合編碼EAAT2、GDH2和NRF2的慢病毒三者協(xié)同作用可延緩ALS轉(zhuǎn)基因小鼠的疾病發(fā)展及改善小鼠運(yùn)動(dòng)功能和神經(jīng)科量表評分[18]。

    圖8 上清液處理后脊髓神經(jīng)元存活情況Figure 8 Survival of the spinal cord neurons after supernatant treatment

    因此,本課題組不斷從轉(zhuǎn)運(yùn)體的角度研究能夠調(diào)節(jié)谷氨酸水平的方藥,提高谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)并維持其功能,從而有利于神經(jīng)元的保護(hù)。通過建立谷氨酸誘導(dǎo)的體外星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷模型探索JPYF方對谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2(EAAT2)表達(dá)的影響及可能機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn),JPYF方在一定范圍內(nèi)可顯著保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞,提高谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2的表達(dá),降低細(xì)胞外液谷氨酸濃度,減少神經(jīng)元損害;然而,在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在誘導(dǎo)體外星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷模型時(shí),給予人體正常胞外水平的谷氨酸濃度并不能成功建立星形膠質(zhì)細(xì)胞損害模型,與正常組比較,細(xì)胞存活情況、形態(tài)及EAAT2的表達(dá)與正常組比較均無顯著差異,這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道提示突觸傳遞過程中,囊泡釋放的Glu可使突觸間隙的濃度由靜息的1 μmoL/L升高到1.1 mmol/L,而維持在此峰值的時(shí)間僅約為1.2 ms相符合[19];故研究人員篩選出適合本課題組實(shí)驗(yàn)的最佳給藥時(shí)間4 h及濃度250 μmoL/L;星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞均表達(dá)攝取谷氨酸的載體,星形膠質(zhì)細(xì)胞的攝取是清除突觸間隙谷氨酸的主要途徑,只有當(dāng)谷氨酸溢出時(shí),神經(jīng)元的谷氨酸載體才發(fā)揮作用,引起谷氨酸興奮性毒性;本課題組在檢測培養(yǎng)基上清谷氨酸濃度時(shí)發(fā)現(xiàn)正常組谷氨酸濃度高于體內(nèi)正常胞外靜息狀態(tài)水平,這可能與基礎(chǔ)培養(yǎng)基谷氨酸水平含量相關(guān),而該濃度仍在溢出濃度之內(nèi)。

    圖7 紫外比色法檢測各組培養(yǎng)基上清谷氨酸濃度Figure 7 Concentrations of glutamic acid in each medium determined by UV colorimetric assay

    綜上所述,JPYF方(0.25~1 g/L)呈濃度依賴的增加谷氨酸誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上EAAT2蛋白水平,降低谷氨酸濃度,保護(hù)培養(yǎng)的神經(jīng)元免受谷氨酸介導(dǎo)的興奮毒性損傷和死亡。在今后的實(shí)驗(yàn)研究中,本課題組將會(huì)深入探索健脾益肺方對ALS的作用機(jī)制,期望研究成果為臨床應(yīng)用提供理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),為ALS患者的綜合治療提供新的選擇。

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